大黃素體外對(duì)小鼠免疫細(xì)胞的影響及其溶血作用

田一含，喬瑞紅，謝鯤鵬，謝明杰

(遼寧師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，遼寧省生物技術(shù)與分子藥物研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116081)

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大黃素體外對(duì)小鼠免疫細(xì)胞的影響及其溶血作用

田一含，喬瑞紅，謝鯤鵬，謝明杰Δ

(遼寧師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，遼寧省生物技術(shù)與分子藥物研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116081)

目的 探討大黃素對(duì)小鼠免疫功能的影響及其溶血毒性。方法 制備并體外培養(yǎng)小鼠特異性免疫細(xì)胞T、B淋巴細(xì)胞及非特異性免疫細(xì)胞巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞，采用濃度為5、10、15、20 μM的大黃素分別處理各免疫細(xì)胞，另設(shè)DMSO為對(duì)照組，采用中性紅法和MTT法檢測大黃素對(duì)免疫細(xì)胞功能的影響。采用濃度為20、40、60、80 μM的大黃素進(jìn)行體外溶血實(shí)驗(yàn)，以生理鹽水為空白對(duì)照組，以無菌蒸餾水為陽性對(duì)照組，觀察大黃素的溶血毒性。結(jié)果 與對(duì)照組比較，5、10、15、20 μM組對(duì)T、B淋巴細(xì)胞增殖的影響差異均不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.009，P=1.000；F=0.003，P=1.000)，各劑量組提高巨噬細(xì)胞吞噬能力且呈濃度依賴性(F=665.525，P=0.000)，提高巨噬細(xì)胞增殖率且呈濃度依賴性(F=134.812，P=0.000)，提高NK細(xì)胞活性且呈濃度依賴性(F=200.190，P=0.000)。溶血實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，大黃素在20～80 μM濃度范圍內(nèi)，溶血率測定結(jié)果均小于5%。結(jié)論 大黃素能顯著促進(jìn)小鼠非特異性免疫細(xì)胞的活性，在大黃素發(fā)揮有效活性的濃度范圍內(nèi)，對(duì)紅細(xì)胞無溶血毒性。

大黃素；特異性免疫細(xì)胞；非特異性免疫細(xì)胞；體外；溶血毒性

免疫功能是人體及其重要的自衛(wèi)功能，能抵御各種疾病的發(fā)生和發(fā)展，因此獲得具有提高機(jī)體自身免疫系統(tǒng)的藥物，是最終治愈疾病的有效方法[1]。長期以來，中藥以其較好的生物活性，較低的毒副作用和具有提高機(jī)體免疫活性等作用，成為各國學(xué)者獲取有效藥物的主要來源[2]。已有研究表明，革皮氏海參皂苷、藏藥綠蘿花水提物、樟芝多糖、茵陳蒿等中藥提取物都可以提高機(jī)體免疫活性[3-6]。大黃素(emodin，EM)主要來源于蓼科植物虎杖和掌葉大黃的根莖和根中[7-8]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，大黃素具有廣泛的藥理學(xué)功效，包括抗腫瘤、抗氧化、抗炎和抑菌等活性[9]。本實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)大黃素的抗腫瘤作用和抑菌作用進(jìn)行了深入的研究，抗腫瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，大黃素可通過干預(yù)ERα-MAPK/Akt-cyclin D1/Bcl-2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑來抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖[10]。抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，大黃素對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用主要是通過對(duì)其細(xì)胞膜通透性的破壞、菌體內(nèi)蛋白質(zhì)的合成及代謝關(guān)鍵酶活性的抑制等多種途徑來實(shí)現(xiàn)[11]。但目前關(guān)于大黃素對(duì)免疫的調(diào)節(jié)作用研究較少，因此，本文對(duì)大黃素體外對(duì)小鼠免疫細(xì)胞的影響及其溶血作用進(jìn)行了研究，旨在為研究大黃素的藥理作用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

細(xì)胞：K562細(xì)胞由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)研究所細(xì)胞中心提供；

動(dòng)物：雄性的ICR小鼠(SPF級(jí))1只，5周齡，體質(zhì)量20 g，由大連醫(yī)科大學(xué)提供，合格證號(hào)：SCXK Liao 2008-0002；

試劑：大黃素(純度≥98%)購于中國食品藥品檢定研究院；新生牛血清購于Gibco公司；DMSO、四甲基偶氮唑鹽(MTT)、RPMI-1640購于Sigma公司；PBS緩沖液、紅細(xì)胞裂解液、中性紅、D-Hank’s液、BSA購于上海生工生物工程有限公司；尼龍毛柱購于伊普瑞斯科技有限公司。人的新鮮血液由大連市紅十字血液中心提供。

儀器：Multican Ascent酶標(biāo)儀型(Thermo公司)；UV1102型紫外分光光度計(jì)(上海天美科技儀器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 大黃素對(duì)小鼠T、B淋巴細(xì)胞增殖的影響：① 小鼠T、B淋巴細(xì)胞分離：小鼠T、B淋巴細(xì)胞分離參照高巍等[12]的尼龍毛柱法：脫頸處死小鼠，取出脾臟，研磨，離心，去上清，加入紅細(xì)胞裂解液室溫靜置5 min。用培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度為5×108個(gè)/mL，將脾細(xì)胞懸液上柱，待細(xì)胞全部滴入柱內(nèi)，孵育1 h，培養(yǎng)液(30 mL)洗柱，流出的細(xì)胞為T淋巴細(xì)胞，柱內(nèi)細(xì)胞為B淋巴細(xì)胞，分別收集，離心，含15%新生牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液重懸，備用；

② 大黃素處理小鼠T、B淋巴細(xì)胞：用含15%新生牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液調(diào)整T、B淋巴細(xì)胞密度為2×106個(gè)/mL，以每孔200 μL接種到96孔板中待細(xì)胞貼壁后，采用終濃度為5、10、15、20 μM的大黃素處理，以1‰ DMSO為對(duì)照組。于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，每孔加入20 μL MTT，孵育4 h，棄上清，每孔加入150 μL DMSO，酶標(biāo)儀測定495 nm 下的吸光度值，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。按照下列公式計(jì)算：相對(duì)增殖率(%)=(A實(shí)驗(yàn)組-A空白組)/(A對(duì)照組-A空白組)×100%。

1.2.2 大黃素對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬能力及增殖的影響：① 制備小鼠巨噬細(xì)胞：小鼠巨噬細(xì)胞的制備參照榮岳光[13]的實(shí)驗(yàn)方法：脫頸處死小鼠，于75%乙醇中浸泡5～10 min，注射5～8 mL D-Hank’s 液，將腹腔液吸到離心管中，1000 r/min離心3 min，棄上清，加紅細(xì)胞裂解液重懸，靜置3～5 min，離心，棄上清，收集細(xì)胞，15%新生牛血清RPMI-1640 培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，得到貼壁細(xì)胞為腹腔巨噬細(xì)胞；

② 大黃素處理小鼠巨噬細(xì)胞：調(diào)整腹腔巨噬細(xì)胞密度為 2×106個(gè)/mL。分組及處理方法同1.2.1項(xiàng)下②，培養(yǎng)48 h后，加入200 μL 0.09%的中性紅溶液孵育3 h，用PBS沖凈未被吞噬的中性紅，各孔加入200 μL細(xì)胞裂解液，室溫過夜培養(yǎng)，酶標(biāo)儀測定495 nm下的吸光度值，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。按照下列公式計(jì)算：相對(duì)細(xì)胞吞噬率(%)=(A實(shí)驗(yàn)組-A空白組)/(A對(duì)照組-A空白組)×100%。

③ 同1.2.1項(xiàng)下②的方法及公式，測定巨噬細(xì)胞的相對(duì)增殖率。

1.2.3 大黃素對(duì)小鼠NK細(xì)胞活性的影響：① 制備小鼠NK細(xì)胞：制備小鼠NK細(xì)胞(脾細(xì)胞)；無菌取小鼠脾臟，剪碎、研磨、離心、洗滌后懸于含5%BSA的15%新生牛血清RPMI-1640 培養(yǎng)液。

② 大黃素處理小鼠NK細(xì)胞：調(diào)整效應(yīng)細(xì)胞(NK細(xì)胞)密度為5×106個(gè)/mL和靶細(xì)胞(K562細(xì)胞)密度為1×105個(gè)/mL。設(shè)NK細(xì)胞組、K562細(xì)胞組及混合組(NK細(xì)胞+K562細(xì)胞)，NK細(xì)胞組、K562細(xì)胞組取相應(yīng)細(xì)胞100 μL接種到96孔板中，加培養(yǎng)液100 μL，混合組取NK細(xì)胞、K562細(xì)胞各100 μL(50:1)，接種到96孔板中。大黃素濃度及處理方法同1.2.1項(xiàng)下②，培養(yǎng)48 h后，MTT法檢測細(xì)胞活性的方法同1.2.1項(xiàng)下②。按照下列公式計(jì)算NK細(xì)胞活性(%)=[1-(A混合組-ANK細(xì)胞)/AK562細(xì)胞]×100%。

1.2.4 大黃素體外溶血實(shí)驗(yàn)：①制備人紅細(xì)胞：取10 mL人的新鮮血液，1000 r/min離心10 min，棄去上清液。沉淀的紅細(xì)胞再用生理鹽水洗3次，將所得紅細(xì)胞用生理鹽水配成2.0%的混懸液備用；②大黃素處理紅細(xì)胞：分別用20、40、60、80 μM大黃素處理配制好的紅細(xì)胞懸液，均勻混合后，放入37 ℃恒溫水浴孵育60 min，后1800 r/min離心10 min。取出離心管用肉眼觀察，如果細(xì)胞全部沉淀在管底，上清液為無色透明，表明未發(fā)生溶血現(xiàn)象，記為“-”。反之，管底只有少量或無細(xì)胞殘留，上清液為紅色，則表明發(fā)生了溶血現(xiàn)象，記為“+”。取上清，用紫外分光光度計(jì)測定波長540 nm下的A值，溶血率<5%，可認(rèn)為未引起體外紅細(xì)胞明顯溶血。以生理鹽水為空白對(duì)照組，以無菌蒸餾水為陽性對(duì)照組，每組設(shè)3個(gè)平行復(fù)孔。按照下列公式計(jì)算溶血率：溶血率(%)=(A實(shí)驗(yàn)組-A生理鹽水組)/(A蒸餾水組-A生理鹽水組)×100%。

2 結(jié)果

2.1 大黃素對(duì)T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞增殖的影響 用0、5、10、15、20 μM濃度的大黃素處理小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞后，各實(shí)驗(yàn)組吸光度值如下：T淋巴細(xì)胞為(1.89±0.044)、(1.894±0.044)、(1.895±0.043)、(1.896±0.044)、(1.896±0.043)(F=0.009，P=1.000)，B淋巴細(xì)胞為(1.737±0.042)、(1.739±0.042)、(1.739±0.043)、(1.74±0.043)及(1.741±0.043)。大黃素對(duì)T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞增殖無顯著影響。小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞用5、10、15、20 μM濃度的大黃素處理后，與對(duì)照組相比，B淋巴細(xì)胞增殖率分別提高了(0.10±0.01)%、(0.11±0.02)%、(0.18±0.03)%和(0.21±0.09)%，T淋巴細(xì)胞增殖率分別提高了(0.23±0.03)%、(0.25±0.06)%、(0.31±0.02)%和(0.32±0.04)%。見圖1。

圖1 大黃素對(duì)T、B淋巴細(xì)胞增殖的影響(n=3)Fig.1 The effect of emodin on proliferation of T，B lymphocyte(n=3)

2.2 大黃素對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬能力的影響 腹腔巨噬細(xì)胞用5、10、15、20 μM濃度的大黃素處理后，與對(duì)照組相比，吞噬能力分別提高了(56.38±4.53)%、(87.03±4.12)%、(139.46±2.87)%和(188.35±3.92)%。4個(gè)不同劑量組對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬能力的影響差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=665.525，P=0.000)，且呈濃度依賴性。見圖2。

圖2 大黃素對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬能力的影響(n=3)*P<0.05，與5 μM組比較；#P<0.05，與10 μM組比較；△P<0.05，與15 μM組比較Fig.2 The effect of emodin on phagocytosis of macrophages(n=3)*P<0.05，compared with 5 μM group；#P<0.05，compared with 10 μM group；△P<0.05，compared with 15 μM group

2.3 大黃素對(duì)巨噬細(xì)胞增殖的影響 腹腔巨噬細(xì)胞用5、10、15、20 μM濃度的大黃素處理后，與對(duì)照組相比，增殖率提高了(4.82±0.37)%、(7.96±0.29)%、(13.63±0.93)%和(19.46±1.62)%。4個(gè)不同劑量組對(duì)巨噬細(xì)胞增殖率的影響差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=134.812，P=0.000)，且呈濃度依賴性。見圖3。

圖3 大黃素對(duì)巨噬細(xì)胞代謝活性的影響(n=3)*P<0.05，與5 μM組比較；#P<0.05，與10 μM組比較；△P<0.05，與15 μM組比較Fig.3 The effect of emodin on energy metabolism of macrophages(n=3)*P<0.05，compared with 5 μM group；#P<0.05，compared with 10 μM group；△P<0.05，compared with 15 μM group

2.4 大黃素對(duì)NK細(xì)胞活性的影響 5、10、15、20 μM的大黃素作用NK細(xì)胞后，NK細(xì)胞的活性分別提高了(4.35±0.43)%、(6.59±0.92)%、(12.86±0.98)%和(21.73±1.28)%。4個(gè)不同劑量組對(duì)NK細(xì)胞活性的影響差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=200.190，P=0.000)，且呈濃度依賴性。見圖4。

圖4 大黃素對(duì)小鼠NK細(xì)胞活性的影響(n=3)*P<0.05，與5 μM組比較；#P<0.05，與10 μM組比較；△P<0.05，與15 μM組比較Fig.4 Effect of emodin on proliferation of NK cell in mice(n=3)*P<0.05，compared with 5 μM group；#P<0.05，compared with 10 μM group；△P<0.05，compared with 15 μM group

2.5 大黃素的體外溶血實(shí)驗(yàn) 溶血實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，大黃素在20～80 μM濃度范圍內(nèi)，通過肉眼觀察無溶血現(xiàn)象。因?yàn)槿苎蕼y定結(jié)果均小于5%，說明大黃素不能引起體外紅細(xì)胞溶血。見表1。

表1 大黃素體外溶血實(shí)驗(yàn)結(jié)果±s，n=3)Tab.1 The hemolytic results of emodin in ±s，n=3)

3 討論

尋找生物活性高，不良反應(yīng)小，且能提高機(jī)體免疫力等功效的天然藥物是當(dāng)今醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)，機(jī)體的免疫功能對(duì)保證機(jī)體維持內(nèi)環(huán)境的平衡穩(wěn)定和疾病的治愈發(fā)揮著重要作用[2]。大黃素具有多種生理活性，是臨床上應(yīng)用十分廣泛的藥物之一，大黃素對(duì)機(jī)體免疫細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用，對(duì)其今后的進(jìn)一步應(yīng)用具有重要的影響。機(jī)體免疫包括特異性免疫與非特異性免疫，其中非特異性免疫細(xì)胞主要為巨噬細(xì)胞和NK細(xì)胞。特異性免疫細(xì)胞主要為B淋巴細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞。巨噬細(xì)胞是機(jī)體內(nèi)具有吞噬功能的一類細(xì)胞的總稱，已有的研究表明，巨噬細(xì)胞可釋放TNF-α、ROS等腫瘤殺傷分子，在調(diào)節(jié)機(jī)體免疫、吞噬和殺傷腫瘤細(xì)胞過程中發(fā)揮著重要的作用[13-14]。NK能識(shí)別并攻擊與正常細(xì)胞不同的任何膜表面發(fā)生變化的細(xì)胞，如腫瘤細(xì)胞、病毒感染細(xì)胞、較大的病原體和同種異體移植的器官、組織等[15]。本研究結(jié)果顯示，大黃素可明顯提高腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬能力、代謝活力及NK細(xì)胞的活性，呈劑量依賴性，對(duì)機(jī)體的非特異性免疫具有促進(jìn)作用。但大黃素對(duì)T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞的作用不明顯。

溶血實(shí)驗(yàn)是研究藥物毒性必須兼顧的實(shí)驗(yàn)，因?yàn)橛行┧幬锟墒箼C(jī)體產(chǎn)生溶血現(xiàn)象和凝聚現(xiàn)象，引起血液循環(huán)功能障礙，導(dǎo)致機(jī)體不良反應(yīng)。本文的溶血實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在藥物發(fā)揮有效作用的4倍濃度范圍內(nèi)，溶血率均小于5%。

由于大黃素對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)具有顯著的促進(jìn)作用，使其在未來的應(yīng)用中具有巨大的潛力和不可替代的優(yōu)勢，但關(guān)于大黃素提高機(jī)體免疫功能的作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

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(編校：王儼儼)

Effect of emodin on mice immune cells and its hemolysis in vitro

TIAN Yi-han, QIAO Rui-hong, XIE Kun-peng, XIE Ming-jieΔ

(College of Life Science, Liaoning Normal University, Key Laboratory of Biotechnology and Drug of Liaoning Province, Dalian 116081, China)

ObjectiveTo investigate effect of emodin on mice immune function and its hemolysis toxicity.MethodsThe mouse specific immune cells of T, B lymphocytes and nonspecific immune cell of macrophages and NK cells were prepared and incubated in vitro.The different immune cells were treated by emodin with different concentrations of 5,10,15 and 20 μM, and DMSO as control group.The effect of emodin on immune cells function was detected by neutral red assay and MTT assay.The hemolysis test in vitro was conducted by emodin with different concentrations of 20, 40, 60 and 80 μM, physiological saline as blank control group and sterile distilled water as positive control group, then the hemolysis toxicity of emodin was observed.ResultsThere were no significant difference of T and B lymphocyte proliferation among control group, 5, 10, 15 and 20 μM group(F=0.009，P=1.000；F=0.003，P=1.000), the phagocytic ability of macrophages enhanced in each dose group and was concentration dependent(F=665.525，P=0.000), the proliferation rate of macrophages enhanced and was concentration dependent(F=134.812，P=0.000), the activity of NK cells enhanced and was concentration dependent(F=200.190，P=0.000).Hemolysis test results showed the hemolysis rate was less than 5% in the range of 20 to 80 μM emodin.ConclusionEmodin could significantly promote the nonspecific immune cells activity.Within the concentration of experiment, emodin has no hemolysis toxicity.

emodin; specific immune cells; nonspecific immune cell; in vitro; hemolysis toxicity

遼寧省教育廳科學(xué)研究一般項(xiàng)目(L2013412)；大連市科技計(jì)劃項(xiàng)目(2013E13SF108)

田一含，女，本科，研究方向：微生物生化，E-mail：2324241060@qq.com；謝明杰，通訊作者，女，博士，教授，研究方向：微生物生化，E-mail： xmj1222@sina.com。

Q935

A

1005-1678(2015)09-0034-04