地黃多糖對(duì)糖尿病腎病大鼠模型的治療作用及對(duì)PPAR-γ信號(hào)通路的影響

康偉，王肅

(天津第五中心醫(yī)院 內(nèi)分泌科，天津 300450)

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地黃多糖對(duì)糖尿病腎病大鼠模型的治療作用及對(duì)PPAR-γ信號(hào)通路的影響

康偉，王肅Δ

(天津第五中心醫(yī)院 內(nèi)分泌科，天津 300450)

目的 研究地黃多糖對(duì)糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)大鼠的治療作用并初步探索其分子機(jī)制。方法 注射鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)誘導(dǎo)糖尿病腎病大鼠模型，分為模型組，地黃多糖低劑量組(10 mg/kg)、中劑量組(20 mg/kg)、高劑量組(30 mg/kg)，羅格列酮處理組以及正常對(duì)照組。檢測(cè)各組大鼠24 h尿蛋白、腎質(zhì)量指數(shù)(腎質(zhì)量/體質(zhì)量)和血糖以及腎功能參數(shù)三酰甘油(TG)、尿素氮(BUN)及肌酐(Scr)水平。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)各組大鼠血清中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β含量。逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)和免疫印跡實(shí)驗(yàn)(Western blot)檢測(cè)各組大鼠骨骼肌中過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)、脂肪細(xì)胞脂肪酸結(jié)合蛋白(aP2)和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4(GLU4)mRNA和蛋白表達(dá)水平。結(jié)果 糖尿病腎病大鼠模型 (DN模型) 24 h蛋白、腎質(zhì)量指數(shù)、血糖、TGF-β、TG、BUN和Scr高于正常對(duì)照組(P<0.05)，PPARγ、aP2和GLUT4水平低于正常對(duì)照組(P<0.05)，顯示造模成功。隨著地黃多糖劑量增加，aP2/GAPDH和GLUT4/GAPDH水平增高(P<0.05)，其余指標(biāo)隨著劑量增加而降低(P<0.05)。高劑量組地黃多糖治療效果略低于羅格列酮組。模型組DN大鼠骨骼肌中PPARγ、aP2和GLUT4蛋白水平顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，地黃多糖能夠明顯上調(diào)各蛋白表達(dá)水平。結(jié)論 地黃多糖能夠通過(guò)調(diào)節(jié)PPARγ信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)對(duì)糖尿病腎病大鼠起到治療作用，且該治療作用有劑量依賴性。

糖尿病腎??；葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；過(guò)氧化物酶體增生物激活受體；羅格列酮

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病最常見的并發(fā)癥之一，研究表明，地黃多糖具有增強(qiáng)造血、降低血糖[1]、抑制腫瘤生長(zhǎng)等作用[2]。過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)的激動(dòng)劑對(duì)于包括糖尿病腎病在內(nèi)的多種腎病具有保護(hù)和治療作用，可成為腎臟疾病的潛在治療靶點(diǎn)[3]，PPAR γ激動(dòng)劑(如吡格列酮)是臨床上治療2型糖尿病運(yùn)用最廣泛的藥物[4]。本研究旨在通過(guò)構(gòu)建糖尿病腎病大鼠模型探索地黃多糖對(duì)糖尿病腎病是否有治療作用，并初步探索其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

地黃多糖由本實(shí)驗(yàn)室提取分離；鏈脲佐菌素(STZ)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；胰島素檢測(cè)試劑盒購(gòu)自法國(guó)CIS公司；葡萄糖檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海榮盛生物技術(shù)有限公司，馬來(lái)酸羅格列酮片購(gòu)自葛蘭素史克公司；PCR引物購(gòu)自Biomics公司；PPARγ、脂肪細(xì)胞脂肪酸結(jié)合蛋白(aP2)、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4(GLUT4)抗體購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；免疫印跡化學(xué)發(fā)光(ECL)系統(tǒng)購(gòu)自Syngene公司；大鼠血清轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒購(gòu)自美國(guó)TPI公司。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型的建立：選取45只8周齡SPF級(jí)Wistar大鼠(購(gòu)自北京實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，體質(zhì)量(220±20)g，按照隨機(jī)數(shù)字表法取40只進(jìn)行單腎切除加單次腹腔注射STZ 40 mg/kg，建立DN大鼠模型[5]，剩余5只為正常對(duì)照組(NC)。

1.2.2 動(dòng)物分組與處理：造模72 h檢測(cè)大鼠血糖，隨機(jī)血糖高于16.7 mmol/L，尿糖“++++”者為造模成功，選出DN造模成功的35只，分為DN模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組和羅格列酮組，每組7只。低、中、高劑量組分別以10、20、30 mg/kg地黃多糖腹腔注射給藥，每天1次，每次0.2 mL，羅格列酮組每天1 mg/kg灌胃1次。正常對(duì)照組和DN模型組注射等體積的生理鹽水，給藥12周。

1.2.3 尿蛋白含量檢測(cè)：糖尿病模型建立并給藥12周，每4周檢測(cè)1次各組大鼠24 h尿蛋白，將大鼠置于代謝籠中24 h，不禁食，自由飲水，記錄每只大鼠24 h尿量，取1.5 mL，用考馬斯亮藍(lán)G-250法檢測(cè)尿蛋白濃度，計(jì)算24 h尿蛋白含量。

1.2.4 生化分析與腎重指數(shù)測(cè)定：給藥4周后，抽取各組大鼠血樣，EDTA抗凝。檢測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)：血糖測(cè)定采用葡萄糖氧化酶法；三酰甘油(TG)、尿素氮(BUN)及肌酐(Scr)采用全自動(dòng)生化分析儀進(jìn)行測(cè)定。腎質(zhì)量指數(shù)檢測(cè)，將小鼠頸椎脫臼處死，稱重后記錄，取腎，稱質(zhì)量記錄，按照腎質(zhì)量指數(shù)=腎質(zhì)量/(體質(zhì)量×103)的公式計(jì)算腎質(zhì)量指數(shù)。

1.2.5 ELISA檢測(cè)大鼠血清TGF-β水平：注射地黃多糖12周后心臟采血，3000 r/min離心10 min分離出血清，用ELISA試劑盒檢測(cè)血清中TGF-β水平。

1.2.6 大鼠腎組織RNA提?。簷z測(cè)各組生化指標(biāo)后，取各組肌肉組織，用Qiagen組織RNA提取試劑盒進(jìn)行組織RNA的提取。通過(guò)紫外分光光度計(jì)測(cè)定A260/A280后，計(jì)算RNA的濃度，用DEPC水調(diào)節(jié)所提的RNA至相同濃度。

1.2.7 RT-PCR測(cè)定PPARγ信號(hào)通路相關(guān)基因的表達(dá)：用Promega公司的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將組織總RNA反轉(zhuǎn)成cDNA，以GAPDH為內(nèi)參，反應(yīng)體系為50 μL，其中10×Reaction Buffer 5 μL，dNTP混合物2 μL，引物各1 μL，Taq DNA聚合酶1 μL，ddH2O補(bǔ)加到50 μL 體系。PCR 擴(kuò)增儀中擴(kuò)增，檢測(cè)各組大鼠腎組織PPARγ，aP2以及GLUT4的表達(dá)水平。引物序列如下：內(nèi)參GAPDH上游：ACAGCAACAGGGTGGTGGAC，下游：TTTGA-GGGTGCAGCGAACTT，產(chǎn)物大小為252 bp；PPARγ上游：CACA-AGAGCTGACCCAATGGTTGCTG，下游：CGCAGCTCAGCAGA-CTCTGGGTTC，產(chǎn)物大小為470bp；aP2上游： GACCTGG-AAACTCGTCTCCA，下游： CATGACACATTCCACCACCA，產(chǎn)物大小為349 bp；GLUT4上游： TCTTTGAGATTCGTCCTGGC，下游： TACTGGGTTTCACCTCCTGC，產(chǎn)物大小為312 bp。反應(yīng)條件：94 ℃，5 mim；94 ℃，5 mim，60 ℃，30 s，72 ℃，30 s，40個(gè)循環(huán)；72 ℃，5 min，4 ℃保存。

1.2.8 Western blot檢測(cè)PPARγ信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)：檢測(cè)各組大鼠生化指標(biāo)后，取各組大鼠骨骼肌組織，用Qiagen 組織提取試劑盒進(jìn)行組織總蛋白的提取。SDS-PAGE凝膠電泳分離，恒流300 mA轉(zhuǎn)移至PVDF膜。5%脫脂牛奶封閉2 h后，加入一抗，4 ℃孵育過(guò)夜。次日PBST洗膜，二抗室溫孵育2 h，PBST洗膜。用化學(xué)發(fā)光法顯色，凝膠成像系統(tǒng)采集成像。以β-actin為內(nèi)參，檢測(cè)PPARγ、aP2及GLUT4蛋白的表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 造模對(duì)大鼠生化指標(biāo)及基因的影響 DN模型組24 h蛋白、腎質(zhì)量指數(shù)、血糖、TGF-β、TG、BUN和Scr高于正常對(duì)照組，PPARγ/GAPDH、aP2/GAPDH和GLUT4/GAPDH低于正常對(duì)照組(P<0.01)。見表1、表2。

表1 正常對(duì)照組與DN模型組大鼠各指標(biāo)比較±s)Tab.1 Comparison of indexes between normal control group and DN model ±s)

**P<0.01，與對(duì)照組比較，compared with control group

表2 正常對(duì)照組與DN模型組大鼠各指標(biāo)比較±s)Tab.2 Comparison of indexes between normal control group and DN model ±s)

2.2 地黃多糖對(duì)DN生化指標(biāo)及基因表達(dá)的影響 不同劑量組間各指標(biāo)的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，3個(gè)時(shí)間點(diǎn)24 h尿蛋白、血糖、TGF-β、aP2/GAPDH和GLUT4/GAPDH組間兩兩比較差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，aP2/GAPDH和GLUT4/GAPDH隨著劑量增加而增高，其余指標(biāo)隨著劑量增加而降低。其余指標(biāo)組間兩兩比較結(jié)果見表3、表4。

表3 DN模型組及不同劑量組大鼠各指標(biāo)比較±s)Tab.3 Comparison of indexes between DN model group different and dose group ±s)

*P<0.05，與DN模型組比較，compared with DN model group；#P<0.05，與低劑量組比較，compared with the low dose group；△P<0.05：與中劑量組比較，compared with middle dose group

表4 DN模型組及不同劑量組大鼠各指標(biāo)比較±s)Tab.4 Comparison of indexes between DN model group different and dose group ±s)

*P<0.05，與DN模型組比較，compared with DN model group；#P<0.05，與低劑量組比較，compared with the low dose group；△P<0.05：與中劑量組比較，compared with middle dose group

2.3 地黃多糖高劑量組與羅格列酮對(duì)DN生化指標(biāo)及基因表達(dá)影響的比較 2組間3個(gè)時(shí)間點(diǎn)24 h尿蛋白、血糖、TGF-β、GLUT4/GAPDH比較差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，地黃多糖高劑量組GLUT4/GAPDH仍低于羅格列酮組，其余指標(biāo)仍高于羅格列酮組；2組腎質(zhì)量指數(shù)、TG、BUN、Scr和aP2/GAPDH比較差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表5、表6。

表5 高劑量組與羅格列酮組大鼠各指標(biāo)比較±s)Tab.5 Comparison of indexes between high dose group rats and rosiglitazone ±s)

*P<0.05，與羅格列酮組比較，compared with rosiglitazone group

表6 高劑量組與羅格列酮組大鼠各指標(biāo)比較±s)Tab.6 Comparison of indexes between high dose group rats and rosiglitazone ±s)

*P<0.05，與羅格列酮組比較，compared with rosiglitazone group

2.4 地黃多糖對(duì)各組大鼠PPARγ、aP2及GLUT4 蛋白表達(dá)水平影響 Western blot結(jié)果如圖2所示，與對(duì)照組相比，模型組大鼠肌肉組織中的PPARγ 及其下游基因aP2和GLUT4 蛋白表達(dá)水平顯著降低，地黃多糖注射組DN大鼠PPARγ、aP2及GLUT4表達(dá)相對(duì)于模型組升高，并且地黃多糖劑量越高，其蛋白表達(dá)升高越明顯。

圖1 各組大鼠PPARγ，aP2以及GLUT4 蛋白表達(dá)水平Fig.1 The expressiom level of PPARγ，aP2 and GLUT4 protein in rats of all groups

3 討論

糖尿病腎病(DN)是糖尿病最常見的并發(fā)癥之一[6]，也是引起糖尿病患者死亡的重要原因，至今其確切發(fā)病機(jī)制尚未闡明[7]。近年來(lái)，中醫(yī)臨床辨證治療糖尿病腎病的研究越來(lái)越多[8]，中藥在DN治療方面也取得一定進(jìn)展[9]，研究表明，許多單味中藥及其提取物具有降糖、降脂及改善腎功能的作用[10]，可作為臨床治療DN的潛在有效藥物。地黃(Rehmanniaglutinosa，RG)為玄參科植物地黃的干燥塊根，是一種常見中藥，能改善進(jìn)行性腎功能衰竭和糖尿病腎病[11]，地黃多糖作為地黃的有效成分之一，具有增強(qiáng)造血功能，降低血糖，抑制腫瘤生長(zhǎng)等作用。

為探究地黃多糖是否對(duì)糖尿病腎病有治療作用，本研究首先采用單腎切除加單次腹腔注射STZ 法構(gòu)建了DN大鼠模型，造模后24 h蛋白、腎質(zhì)量指數(shù)、血糖、TGF-β、TG、BUN和Scr高于正常對(duì)照組，說(shuō)明該造模方法成功有利于后續(xù)研究。造模成功后，向DN大鼠注射不同劑量的地黃多糖進(jìn)行療效觀察。結(jié)果顯示，注射地黃多糖后，與對(duì)照組相比，大鼠24 h尿蛋白量、腎質(zhì)量指數(shù)和血糖都顯著降低(P<0.05)，并且降低程度與地黃多糖的劑量呈正相關(guān)。并且，注射地黃多糖后，大DN鼠血TG、BUN以及Scr水平也顯著降低，說(shuō)明地黃多糖對(duì)DN大鼠腎功能恢復(fù)具有一定作用。為進(jìn)一步研究地黃多糖的治療作用，本研究比較了高劑量組地黃多糖與羅格列酮組各項(xiàng)指標(biāo)，結(jié)果顯示，地黃多糖高劑量組GLUT4/GAPDH略低于羅格列酮組，其余指標(biāo)略高于羅格列酮組，提示，30 mg/kg地黃多糖的療效略低于與羅格列酮，后續(xù)可以加大地黃多糖劑量進(jìn)一步研究。另外本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，地黃多糖能夠顯著降低DN大鼠血清中糖尿病腎病重要的致病因子TGF-β的水平，以上結(jié)果表明，地黃多糖對(duì)糖尿病腎病大鼠的確有一定的治療作用。

過(guò)氧化物酶增殖物激活受體(PPAR)是一類配體激活的核轉(zhuǎn)錄因子，其亞型之一PPARγ在降低血糖、調(diào)節(jié)脂類代謝和抗炎過(guò)程中發(fā)揮重要作用[12，13]。研究表明，其激動(dòng)劑羅格列酮對(duì)糖尿病腎病具有顯著的治療作用[14-15]。本研究以羅格列酮治療DN大鼠組作為陽(yáng)性對(duì)照，探索地黃多糖對(duì)DN大鼠的治療作用是否是通過(guò)對(duì)PPARγ信號(hào)通路的調(diào)控作用實(shí)現(xiàn)的。

本研究首先檢測(cè)了地黃多糖對(duì)PPARγ下游調(diào)控脂類儲(chǔ)存和代謝的靶基因aP2的調(diào)控作用，結(jié)果顯示，地黃多糖能夠上調(diào)aP2在DN大鼠的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平，與PPARγ激動(dòng)劑羅格列酮的調(diào)節(jié)作用是一致的。研究表明，PPARγ配體通過(guò)激活PPARγ增強(qiáng)GLUT4的表達(dá)而促進(jìn)葡萄糖的攝取[16]，因地黃多糖有降低血糖作用，本研究接著檢測(cè)了其GLUT4在DN大鼠表達(dá)的影響，結(jié)果顯示地黃多糖能夠上調(diào)GLUT4在DN大鼠的轉(zhuǎn)錄和翻譯的水平，與PPARγ激動(dòng)劑羅格列酮的調(diào)節(jié)作用一致，說(shuō)明地黃多糖在一定程度上可激活PPARγ信號(hào)通路。

綜上所述，地黃多糖對(duì)糖尿病腎病大鼠有一定的治療作用，其作用可能是通過(guò)激活PPARγ信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的，當(dāng)然，其具體分子機(jī)制還有待在體外細(xì)胞水平上進(jìn)一步驗(yàn)證，地黃多糖對(duì)糖尿病腎病的治療效果以及能否成為治療糖尿病腎病的有效藥物也需要臨床樣本的進(jìn)一步驗(yàn)證。

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(編校：譚玲)

Therapeutic effect of rehmannia polysaccharide on diabetic nephropathy rat model and its effects on PPARγ signal pathway

KANG Wei, WANG SuΔ

(Department of Endocrine, The Fifth Central Hospital, Tianjin 300450, China)

ObjectiveTo investigate therapeutic effect and molecular mechanism of RPS on Diabetic Nephropathy rats.MethodsDN rats were induced by STZ injection and grouped into model group,low-dose RPS group,middle-dose RPS group,high-dose RPS group,Rosiglitazone group and normal group.24 h urine protein,kidney weight index,blood glucose level and TG, BUN and Scr level in normal and DN rats were detected.TGF-β level of serum of rats in all groups by ELISA were detected.mRNA and protein expression level of PPARγ,aP2 and GLUT4 by RT PCR and Western blot were also detected.ResultsDN rats were induced successfully because the 24 h urine protein, kidney weight index and the levels of blood sugar and TG,BUN,Scr l and TGF-βevels, and the mRNA level of PPARγ,aP2 and GLUT4 level in DN rats increased than normal group(P<0.05).The mRNA level of PPARγ,aP2 and GLUT4 level increased(P<0.05) and other indexes decreased(P<0.05) as the doses of RPS increasing.The therapeutic effects of Rosiglitazone group was better than high dose PRS group.The protein level of PPARγ, aP2 and GLUT4 in DN rat skeletal muscle were significantly lower than normal group(P<0.05), and RPS can increase their expression level obviously.ConclusionRPS has a dose-dependent therapeutic effect on DN rats by improving the expression level of related protein in PPAR gamma signaling pathways.

diabetic nephropathy; GLUT4; PPARγ; rosiglitazone

康偉，女，本科，副主任醫(yī)師，研究方向：糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制及治療，E-mail：kangweitianjin@163.com；王肅，通訊作者，女，碩士，主任醫(yī)師，研究方向：糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制及治療，E-mail：tianjinkang123@126.com。

R285

A

1005-1678(2015)09-0030-05