732型陽離子樹脂分離純化吳茱萸總堿及抗乳腺癌研究

陳仕學，姚元勇，盧忠英，唐幫成

(銅仁學院 材料與化學工程學院 梵凈山特色動植物資源重點實驗室，貴州 銅仁 554300)

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732型陽離子樹脂分離純化吳茱萸總堿及抗乳腺癌研究

陳仕學，姚元勇，盧忠英，唐幫成Δ

(銅仁學院 材料與化學工程學院 梵凈山特色動植物資源重點實驗室，貴州 銅仁 554300)

目的 研究吳茱萸總堿最佳純化工藝路線及其抗乳腺癌活性。方法 分別采用傳統(tǒng)提取純化和732型陽離子交換樹脂法提取純化吳茱萸總堿，用碘化汞鉀試劑對其進行定性分析，并對洗脫劑進行選擇。應用MTT實驗對所提取的吳茱萸總堿進行抗乳腺癌活性測試。結果 與傳統(tǒng)提取工藝相比，732型陽離子交換樹脂法提取吳茱萸總堿的產(chǎn)率較高(16.18%)；732型陽離子樹脂純化法提取吳茱萸總堿的最佳洗脫劑為飽和氯化鈉溶液；細胞毒性實驗結果表明U251乳腺癌細胞對吳茱萸總堿的濃度依賴性不強，即隨著載藥濃度的增加，細胞的形態(tài)改變不大、凋亡的細胞數(shù)量增多不明顯。當濃度為50 μmol/mL，作用時間為24 h時，細胞的存活率為68%；隨著濃度的增加(100、150 μmol/mL)，作用時間為24 h時，細胞的存活率分別為66%和60%。結論 與傳統(tǒng)提取法相比，732型陽離子樹脂純化法提取的吳茱萸總堿純度較高；同時吳茱萸總堿對乳腺癌細胞具有明顯的抑制作用。

吳茱萸；陽離子交換樹脂；純化工藝；總堿

吳茱萸(Evodiarutaecarpa)為蕓香科植物，藥用部位為干燥近成熟的果實，其果實除具有溫祛寒、散寒止痛、降逆止嘔、助陽止瀉的功效外，對于嘔吐泄瀉、頭痛眩暈也具有一定的生物活性[1]。吳茱萸主要含有揮發(fā)油、生物堿、苦味素等多種化學成分[2-5]，以生物堿居多，而生物堿中最主要的有效成分為吳茱萸堿和吳茱萸次堿[6-7]，結構見圖1。張瑩等[8]采用吳茱萸堿誘導小鼠纖維肉瘤L929細胞凋亡過程中對細胞周期的阻滯作用。

圖1 吳茱萸堿(a)、吳茱萸次堿(b)結構式Fig.1 Structure of evodiamine (a) and rutaecarpin (b)

目前，生物堿的提取工藝報道較多，但其在植物藥材中的相對含量較低，提取純化工藝研究仍然較困難[9]。生物堿提取純化方法常用離子樹脂交換法、有機溶劑萃取法和大孔吸附樹脂法。離子交換反應實現(xiàn)物質(zhì)分離的離子樹脂交換法，是利用離子樹脂作為的固定相與目標提取物的結合能力強弱，流動相則可除去多余雜質(zhì)，其有洗脫效果好，提取效率高的優(yōu)點；有機溶劑提取法缺點表現(xiàn)為提取效率低、純度不高、提取時間較長；大孔吸附樹脂法在用于生物堿的提取純化時，也存在吸附困難、造價高等問題。

本文采用離子交換樹脂法中的732型陽離子樹脂純化法對吳茱萸生物堿進行純化[10]，其原理是：以732型陽離子交換樹脂作為固定相，可溶解吳茱萸生物堿中多余雜質(zhì)的水或含有水的溶劑作為流動相，當流動相流過732型陽離子交換柱時，生物堿中能與樹脂上的交換基團發(fā)生離子交換的物質(zhì)就能被吸附到陽離子交換柱上，利用流動相除去雜質(zhì)，最后選擇適當?shù)南疵搫┫疵撋飰A，即實現(xiàn)了物質(zhì)的分離[11-12]，為中醫(yī)藥研究，提供了一定參考價值。

1 材料與方法

1.1.1 藥材：吳茱萸(Evodiarutaecarpa)購于銅仁市中藥材市場，由銅仁學院中藥學專業(yè)魯?shù)劳苯淌阼b定，于60 ℃的烘箱中烘干，粉碎，過60目篩，室溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 藥品與試劑：吳茱萸堿(批號：E101966)、吳茱萸次堿(批號：R107338)均購于阿拉丁試劑公司。732型陽離子樹脂(武漢華眾新化工有限公司)；碘化汞鉀(化學醇，阿拉丁公司)；其他試劑均為分析純。

1.1.3 儀器：RE-2000A旋轉蒸發(fā)儀(上海豫康科教儀器公司)；98-Ⅱ-B電子天平(天津泰斯特儀器有限公司)；ZF-Ⅰ紫外分析儀(上海顧村電光儀器廠)。

1.2 方法

1.2.1 傳統(tǒng)提取純化法：稱取吳茱萸藥材粉末50 g，加入5%HCl溶液 100 mL，于35 ℃水浴下浸泡6 h。用5%NaOH調(diào)節(jié)pH至9～10，靜置，抽濾，得到濾渣。將濾渣用150 mL乙醇浸泡6 h，抽濾，得乙醇溶液。在60 ℃條件下，旋轉蒸發(fā)脫去乙醇溶劑，得浸膏，再用氯仿萃取3次，無水MgSO4干燥，抽濾，萃取脫去氯仿溶劑，即得黃色沉淀物(0.5 mg/L)。見圖2。

圖2 傳統(tǒng)提取純化工藝流程Fig.2 Traditional process of extraction-purification

1.2.2 陽離子樹脂的預處理：稱取100 g 732型陽離子樹脂，用去離子水浸泡2 h，裝入層析柱中。用去離子水沖洗至無色顯中性，再用2%的HCl溶液沖洗至顯酸性；將顯酸性陽離子樹脂用去離子水沖洗至中性(pH試紙)，再用2%NaOH沖洗至顯堿性(pH為8～9)；將顯堿性的陽離子樹脂用去離子水沖洗至中性，再用2%的HCl沖洗至顯酸性，最后用去離子水沖洗至中性即可。

圖3 陽離子樹脂的預處理Fig.3 Preprocessing cation exchange resin

1.2.3 陽離子樹脂純化工藝流程：稱取吳茱萸藥材粉末50 g，加人5%HCl溶液100 mL，于35 ℃水浴下浸泡6 h，取出，用5%NaOH調(diào)節(jié)pH至9～10，靜置，抽濾，得到濾渣。將濾渣用150 mL乙醇浸泡6 h，抽濾，得乙醇溶液。在60 ℃條件下，旋轉蒸發(fā)脫去乙醇溶劑，得浸膏。將處理好的樹脂倒入燒杯中，加入乙醇溶解的吳茱萸總堿，用玻璃棒輕輕攪拌致吳茱萸總堿充分吸附在樹脂上，再將樹脂裝柱，用飽和氯化鈉溶液洗脫，TLC追蹤反應，至產(chǎn)物全部洗脫完畢，將洗脫溶劑調(diào)節(jié)pH至9～10，冷藏，自然沉淀，抽濾，即得黃色沉淀物。用毛細管取少量產(chǎn)物，乙醇溶解后調(diào)節(jié)pH至2～3。加入0.1 g碘化汞鉀，產(chǎn)生黃色沉淀。說明該產(chǎn)物為吳茱萸總堿。見圖4。

圖4 陽離子樹脂純化工藝流程Fig.4 Process of purification by cation exchange resin

1.2.4 陽離子樹脂純化吳茱萸生物堿的洗脫劑選擇：用732型陽離子交換樹脂法提取吳茱萸堿，在選擇洗脫劑時，分別采用濃度為5%氨水、氨水-乙醇(v/v=1/19)、10%鹽酸、飽和濃度的氯化鈉洗脫。用TLC追蹤反應，直至吳茱萸生物堿全部洗脫完畢，取洗脫液于60 ℃條件下旋干，得吳茱萸總堿，見圖5。取少量產(chǎn)物，乙醇溶解后調(diào)節(jié)pH為2～3。加入0.1g碘化汞鉀，產(chǎn)生黃色沉淀。說明該產(chǎn)物為吳茱萸總堿。

圖5 洗脫劑的選擇工藝流程Fig.5 Process of elute’s selection

1.2.5 MTT檢測：經(jīng)陽離子樹脂純化后得到的吳茱萸總堿進行MTT檢測[13]，用天平分別準確稱取純化的吳茱萸總堿和傳統(tǒng)法得到的吳茱萸總堿0.55g，分別溶于1 mL的純凈水中，配制成為1.67 mmol/ mL的溶液。

生長狀態(tài)良好U251人腦膠質(zhì)瘤細胞作為對照組，常規(guī)消化，以5000個/孔的密度接種于96孔板，每孔體積為200 μL，倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況。吳茱萸總堿組和傳統(tǒng)吳茱萸總堿組分別設50、100、150 μmol/mL 3個梯度，分別吸取30、60、90 μL于96孔板中，每個濃度均設定8個復孔。培養(yǎng)24 h后將濃度為5 mg/mL的MTT(噻唑藍)以每孔20 μL加入待測的96孔板內(nèi)，37 ℃培養(yǎng)4 h，棄去上清液，每孔加200 μL DMSO以溶解所產(chǎn)生的Formazan，振蕩20 min，使結晶物充分溶解，最后用酶標儀于570 nm波長處測定各孔的吸光度(A值)，記錄結果。

細胞存活率的計算：用自由生長U251細胞作為對照，求出各實驗組細胞的存活率[14]：

注： A(Test)為純化的吳茱萸總堿組或者傳統(tǒng)法得到的吳茱萸總堿組吸光度值；A(Control)為對照組的吸光度值。

2 結果

2.1 吳茱萸總堿的鑒定 用石油醚︰乙酸乙酯=5︰1(v/v)為展開劑，將傳統(tǒng)提取法得到的吳茱萸總堿和陽離子樹脂法得到的吳茱萸總堿與吳茱萸次堿標準品作TLC對比，見圖6(左)。R1為原點到層析點的距離，R2為原點到溶劑前緣的距離，Rf為比移值，Rf= R1/R2。由Rf計算公式可知：在層析點1處，傳統(tǒng)提取法得到的吳茱萸總堿Rf值為0.126(1.45 cm/9.1 cm)；陽離子樹脂提取純化法得到的吳茱萸總堿Rf值為0.121(1.1 cm/9.1 cm)；在層析點3處，傳統(tǒng)提取法得到的吳茱萸總堿Rf值為0.649(5.91 cm/9.1 cm)，而陽離子樹脂提取純化法得到的吳茱萸總堿和吳茱萸次堿標準品在層析點3處均不顯色；在層析4處，傳統(tǒng)提取法得到的吳茱萸總堿Rf值為0.741(6.74 cm/9.1 cm)，陽離子樹脂提取純化法得到的吳茱萸總堿Rf值為0.752(6.84 cm/9.1 cm)，且吳茱萸次堿標準品的Rf值為0.801(7.29 cm/9.1 cm)。用石油醚︰乙酸乙酯=5︰1(v/v)為展開劑，將傳統(tǒng)提取法得到的吳茱萸總堿和陽離子樹脂提取純化法得到的吳茱萸總堿與吳茱萸堿標準品作TLC對比，見圖6(右)。由圖6可知：在層析點4處，傳統(tǒng)提取法得到的吳茱萸總堿Rf值為0.743(6.76 cm/9.1 cm)，陽離子樹脂提取純化法得到的吳茱萸總堿Rf值為0.751(6.83 cm/9.1 cm)；在層析點3處，傳統(tǒng)提取法得到的吳茱萸總堿Rf值為0.652(5.93 cm/9.1 cm)，而陽離子樹脂提取純化法得到的吳茱萸總堿和吳茱萸次堿標準品在此處均不顯色。在層析點2處，傳統(tǒng)提取法得到的吳茱萸總堿Rf值為0.415(3.78 cm/9.1 cm)，陽離子樹脂提取純化法得到的吳茱萸總堿Rf值為0.420(3.82 cm/9.1 cm)，吳茱萸堿標準品的Rf值為0.418(3.8 cm/9.1 cm)。

由圖6可知，采用732陽離子樹脂法提取的吳茱萸次堿在TLC上的顯色點比采用傳統(tǒng)方法提取的吳茱萸次堿在TLC上的顯色點大，說明該陽離子樹脂對吳茱萸次堿的吸附能力較強。采用陽離子樹脂法提取的吳茱萸堿在TLC上的顯色點與傳統(tǒng)方法提取的吳茱萸堿在TLC上的顯色點相差不大，說明732陽離子樹脂對吳茱萸堿的吸附能力不是太強。根據(jù)產(chǎn)率公式=(得到的吳茱萸總堿含量)/(吳茱萸藥材粉末總量)×100%，計算出傳統(tǒng)方法得到的吳茱萸總堿產(chǎn)率為16.08%(8.04 g/50 g)。陽離子樹脂純化法得到的產(chǎn)率為16.18%(8.09 g/50 g)。

圖6 傳統(tǒng)提取法吳茱萸總堿、陽離子樹脂法吳茱萸總堿與吳茱萸堿、吳茱萸次堿標準品TLC比較Fig.6 Comparison of total base extracted by traditional and cation exchange resin methods with standard reagents of evodiamine and rutaecarpin in TLC

由此可知，732型陽離子交換樹脂純化法提取吳茱萸總堿可以除去較多的雜質(zhì)，使產(chǎn)物純度明顯提高。

2.2 吳茱萸總堿洗脫劑的選擇 用不同洗脫劑對純化后的吳茱萸總堿進行洗脫。見表2。

表2 洗脫劑種類對洗脫率的影響Tab.2 The influence of eluting efficacy from varied elute

由表2可知，用5%氨水進行洗脫，總堿洗脫率為55.45%，用5%/95%的氨性乙醇洗脫，總堿洗脫率為57.26%，用10%鹽酸洗脫，總堿洗脫率為60.13%，用飽和氯化鈉溶液洗脫，總堿洗脫率為61.14%。由此可知，4種洗脫劑對吳茱萸總堿的洗脫率存在一定的差異，飽和氯化鈉溶液的洗脫效率最高，鹽酸溶液次之，氨水和氨性乙醇溶液洗脫能力較低。且鹽酸溶液在洗脫過程中，存在酸性腐蝕，因此，選用飽和氯化鈉溶液作為吳茱萸總堿的最佳洗脫劑。

2.3 吳茱萸總堿的MTT試驗 將上述得到的吳茱萸總堿，采用MTT比色法對U251乳腺癌細胞抑制其活性的研究，并考察了總堿在不同濃度條件下，對U251乳腺癌細胞抑制活性測試，見圖7。從圖7試驗結果可知，吳茱萸總堿的細胞毒性對其濃度依賴性不強，即隨著載體濃度的增加，細胞形態(tài)改變不大，凋亡細胞的數(shù)量增多不明顯。當濃度為50 μmol/mL時，作用時間達24 h，細胞的存活率為68.1%(0.966/1.418)；隨著載體濃度的增加，當作用濃度分別為100 μmol/mL和150 μmol/mL時，作用時間仍為24 h時，細胞的存活率無明顯降低，分別為66.0%(0.870/1.318)和60.3%(0.873/1.448)。傳統(tǒng)吳茱萸總堿相同濃度和作用時間下的細胞存活率分別為67.4%(0.812/1.205)，65.6%(0.910/1.387)和59.2(0.869/1.469)，由此可推斷出純化方法得到的吳茱萸總堿細胞存活率比傳統(tǒng)方法得到的細胞存活率高。

圖7 不同濃度的吳茱萸總堿與U251乳腺癌細胞共培養(yǎng)24 h細胞形態(tài)圖(×40)Fig.7 Cellular shape picture of U251breast cancer cell done by different concentration of total evodiamine(×40)

3 結論

本文以中藥材-吳茱萸果實為原料，并對傳統(tǒng)提取法提取的吳茱萸總堿，與732型陽離子樹脂純化法得到的吳茱萸總堿進行對比研究，傳統(tǒng)方法得到的吳茱萸總堿的產(chǎn)率為16.08%，732型陽離子樹脂純化法得到的吳茱萸總堿的產(chǎn)率為16.18%。由此對比得出732型陽離子樹脂純化法得到的總堿產(chǎn)率較高。在用TLC檢測時，732型陽離子樹脂純化法的顯色點比傳統(tǒng)提取法少，因此純度也明顯提高。在此基礎上，本文還探究了732型陽離子樹脂純化后對吳茱萸總堿洗脫時洗脫劑的選擇，結果表明：采用飽和氯化鈉溶液洗脫時，總堿洗脫率最高，達到61.14%。因此，篩選出飽和氯化鈉溶液為最佳洗脫劑。本文的創(chuàng)新點在于用陽離子樹脂純化吳茱萸總堿，不僅避免了有毒溶劑氯仿的使用，而且純度也明顯提高；另外，還對吳茱萸總堿進行乳腺癌抑制其活性研究，此項研究目前未見報道，結果表明：細胞毒性對其濃度依賴性不強，隨著載體濃度的增加，細胞形態(tài)改變不大，凋亡細胞的數(shù)量增多不明顯。該研究通過應用較為簡潔的提取方法，避免了毒性溶劑的使用，并對其生物活性成分進行評價，在中醫(yī)藥領域中，具有一定參考價值。

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(編校：王冬梅)

Separation and purification of total alkaloids fromEvodiarutaecarpausing 732 cation exchange resin and investigations on its anti-breast cancer bioactivity

CHEN Shi-xue, YAO Yuan-yong, LU Zhong-ying, TANG Bang-chengΔ

(Institute of Material and Chemical Engineering, Key Laboratory of Fanjing Mountain Special Animal and Plant Resources Tongren University, Tongren 554300, China)

ObjectiveTo optimize conditions for extraction of alkaloids fromEvodiarutaecarpaby means of 732 cation exchange resin and performe its anti-breast cancer bioactivity.MethodsThe optimum processing route on extraction of alkaloids fromEvodiarutaecarpawas investigated by means of 732 cation exchange resin.The performance of 732 cation exchange resin was compared with tranditonal process (aqueous extraction-ethanol precipitation in extraction-purification process).The alkaloid reagent-potassium mercuric iodide test and MTT test were performed on the crudes.ResultsCompared with traditional purification process, it was much better to use 732 cation exchange resin approach for extraction of alkaloids from Evodia rutaecarp with high yield(16.81%) The best eluent should be saturated brine with excellent purification.No obvious correlations were found between the toxin of breast cancer cell and concentration of total alkaloids.When the concentration of total alkaloids was 50 μmol/mL, cellular survival rate was 68%afterward 24 h.When the concentration of total alkaloids comes to 100 μmol/mL and 150 μmol/mL, cellular survival rates were slightly decreased by 66% and 60%.Conclusion732 cation exchange resin performes much higher than traditional process in purification of total alkaloids extracted fromEvodiarutaecarpa.Simultaneously, the extracted total alkaloids showe remarkable inhibition in breast cancer cell.

Evodiarutaecarpa; cation exchange resin; extraction process; total alkaloids

貴州省教育廳基金[黔教合KY(2011)005]；貴州省高等學校重點支持學科[黔教合重點支持學科字(2011)232]

陳仕學，女，碩士，副教授，研究方向：天然藥物的提取及應用研究，E-mail：tongrencsx01@126.com；唐幫成，通訊作者，男，本科，副教授，研究方向：天然藥物的提取，E-mail：1608096643@qq.com。

R284

A

1005-1678(2015)09-0015-04