靶向沉默CXCR4表達(dá)逆轉(zhuǎn)肺癌細(xì)胞吉西他濱耐藥性的作用研究

王立文，沈曉潔，俞茹云，林莉莉

(無(wú)錫衛(wèi)生高等職業(yè)技術(shù)學(xué)校 康復(fù)系，江蘇 無(wú)錫 214028)

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靶向沉默CXCR4表達(dá)逆轉(zhuǎn)肺癌細(xì)胞吉西他濱耐藥性的作用研究

王立文Δ，沈曉潔，俞茹云，林莉莉

(無(wú)錫衛(wèi)生高等職業(yè)技術(shù)學(xué)校 康復(fù)系，江蘇 無(wú)錫 214028)

目的 觀察靶向沉默CXCR4基因表達(dá)對(duì)非小細(xì)胞肺癌吉西他濱耐藥株(A549/Gem)逆轉(zhuǎn)作用的影響。方法 采用體外濃度梯度遞增的誘導(dǎo)方法建立非小細(xì)胞肺癌吉西他濱耐(Gemcitabine)獲得性耐藥細(xì)胞株(A549/Gem)。通過(guò)Quantitative RT-PCR(RT-qPCR)檢測(cè)A549與A549/Gem細(xì)胞中CXCR4的表達(dá)量。通過(guò)體外轉(zhuǎn)染CXCR4 shRNA干擾載體到A549/Gem細(xì)胞，RT-qPCR及蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)驗(yàn)證shRNA對(duì)CXCR4基因的靶向沉默效率。進(jìn)而采用MTT法檢測(cè)A549、A549/Gem和CXCR4沉默表達(dá)細(xì)胞株(A549/Gem-CXCR4)對(duì)Gemcitabine的半數(shù)抑制濃度(50% inhibitory concentration，IC50)和耐藥指數(shù)(resistance index，RI)；最后采用Western blot法檢測(cè)A549、A549/Gem和A549/Gem-CXCR4細(xì)胞中JNK、p38和ERK1/2磷酸化蛋白的表達(dá)水平的變化。 結(jié)果 通過(guò)體外濃度梯度遞增的誘導(dǎo)方法成功建立A549/Gem細(xì)胞株(P<0.05)。A549/Gem細(xì)胞株中CXCR4的表達(dá)量明顯高于A549細(xì)胞株。體外轉(zhuǎn)染CXCR4 shRNA可明顯下調(diào)A549/Gem細(xì)胞株中CXCR4表達(dá)。MTT法檢測(cè)A549，A549/Gem和A549/Gem-CXCR4對(duì)Gemcitabine的IC50分別為(0.08±0.01)μmol/L，(14.01±0.21)μmol/L和(1.84±0.61)μmol/L。A549/Gem細(xì)胞株對(duì)Gemcitabine的耐藥指數(shù)(RI)是(127.12±12.28)，遠(yuǎn)高于A549/Gem-CXCR4對(duì)Gemcitabine的耐藥指數(shù)(RI)(0.27±0.08)；Western blot結(jié)果顯示A549/Gem-CXCR4細(xì)胞株中JNK、p38和ERK1/2磷酸化蛋白的表達(dá)量較A549/Gem細(xì)胞株明顯下調(diào)。 結(jié)論 A549/Gem細(xì)胞株中CXCR4的表達(dá)明顯上調(diào)。靶向沉默CXCR4表達(dá)能夠逆轉(zhuǎn)肺癌細(xì)胞吉西他濱耐藥性，提示CXCR4是肺癌臨床放射治療相關(guān)的有效分子靶點(diǎn)。

非小細(xì)胞肺癌；吉西他濱；CXCR4；耐藥性

肺癌是世界范圍內(nèi)腫瘤死亡的首要原因，我國(guó)肺癌在城市人口腫瘤患者死亡原因中由原來(lái)的第四位上升為第一位，其中非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)占了85%左右[l-2]。目前研究報(bào)道，只有14%的患者在確診肺癌后能生存五年或以上[3]。在診斷為晚期肺癌的患者中，研究發(fā)現(xiàn)吉西他濱可明顯提高患者的生存率，其聯(lián)合任何一種抗癌藥物，如紫杉醇、鉑類、長(zhǎng)春瑞濱等均被認(rèn)為是晚期肺癌一線治療方案。盡管多樣的化療方案可以改善患者的預(yù)后，但由于耐藥及不可避免的藥物毒性導(dǎo)致大多數(shù)患者最終結(jié)果仍然是治療的失敗[4]。大量實(shí)驗(yàn)和臨床研究已經(jīng)證明一系列分泌性趨化因子與NSCLC發(fā)展的病理機(jī)制有密切關(guān)系，特別是基質(zhì)源性細(xì)胞因子1(stromalcell-deriredfactor-1，SDF-1)與其受體CXCR4在NSCLC轉(zhuǎn)移中扮演重要角色[5-6]。最新研究表明，CXCR4在肝癌組織中異常高表達(dá)，并且與肝癌預(yù)后明確相關(guān)[7]。本研究擬通過(guò)RNA干擾技術(shù)，靶向沉默CXCR4基因的表達(dá)，觀察其對(duì)吉西他濱耐藥NSCLC細(xì)胞株A549逆轉(zhuǎn)作用的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料 聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)購(gòu)自 Milliproe公司。DMEM培養(yǎng)液和胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；二甲基亞砜(DMSO)、四甲基偶氮唑鹽(MTT)和碘化丙啶(PI)均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株A549購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所。鹽酸吉西他濱購(gòu)(Gemcitabine)自南京正大天晴制藥有限公司。轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM 2000購(gòu)自Invitrogen公司，G418購(gòu)自Gibico公司。RNA干擾載體CXCR4-shRNA及陰性對(duì)照載體(negative control)購(gòu)自由本上海Genechem公司。兔抗人CXCR4抗體及ACTIN抗體購(gòu)自Santa Cruz公司。JNK、p38和ERK1/2磷酸化抗體均購(gòu)自美國(guó)CST公司。HRP標(biāo)記山羊抗兔或鼠IgG二抗購(gòu)自北京中衫金橋公司。PCR引物合成于北京鼎國(guó)生物公司，RT-qPCR試劑體系購(gòu)自日本TaKaRa公司。

1.1.2 儀器 5810R冷凍離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)eppendorf公司；5415D臺(tái)式離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)eppendorf公司；Heλiosγ紫外分光光度計(jì)購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；TS-2脫色搖床購(gòu)自江蘇其林貝爾公司；TS-8轉(zhuǎn)移脫色搖床購(gòu)自江蘇其林貝爾公司；EPS-300電泳儀購(gòu)自上海天能公司；VE-180微型垂直電泳槽購(gòu)自上海天能公司；VE-186轉(zhuǎn)移電泳槽購(gòu)自上海天能公司；微量加樣器購(gòu)自德國(guó)eppendorf公司；SW-CJ-1FD超凈工作臺(tái)購(gòu)自日本AIR TECH公司；TP600梯度PCR儀購(gòu)自日本TaKaRa公司；TP800Real time PCR儀購(gòu)自日本TaKaRa公司；Elx800型自動(dòng)酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)BioTek公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng):A549細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液，培養(yǎng)于 37 ℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及生長(zhǎng)狀態(tài)，每1～2 d傳代一次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 耐藥細(xì)胞株的建立：采用體外逐步遞增濃度方法誘導(dǎo)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞加入含吉西他濱的培養(yǎng)液，吉西他濱從低濃度10 nmol/L濃度開始處理，作用24 h，敏感細(xì)胞逐漸死亡，棄去培養(yǎng)液，用PBS緩沖液洗3遍，換新鮮培養(yǎng)液，耐藥細(xì)胞在不含藥物的培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，逐漸提高吉西他濱的濃度，如此反復(fù)誘導(dǎo)，換液傳代，直至該細(xì)胞株能夠在2.0 μmol/L 吉西他濱濃度下穩(wěn)定生長(zhǎng)。歷時(shí)8個(gè)月，最終得到耐受吉西他濱 2.0 μmol/L的細(xì)胞株A549/Gem。

1.2.3 RNA反轉(zhuǎn)錄及RT-qPCR檢測(cè)：用Trizol提取各組細(xì)胞總RNA。取1 μg按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板PCR擴(kuò)增CXCR4，按照TaKaRau熒光定量試劑盒說(shuō)明書，以cDNA為模版在LightCycler480Ⅱ熒光定量 PCR 儀上進(jìn)行RT-qPCR反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)反應(yīng)體系為：模版cDNA 1 μL，SYBR premix Ex TaqTMⅡ PCR Mix 10 μL，正、反向引物(20 μmol)共1.6 μL，CXCR4上游引物為 5′- CAATGACTTGTGGGTGGTTGTG -3′，下游引物為5′- AGGATGACTGTGGTCTTGAGGG -3′；以β-ACTIN為內(nèi)參，β-ACTIN上游引物為 5′- GACTTAGTTGCGTTAC-ACCCTTTCT -3′，下游引物為5′- ACTGCTGTCACCTTCACCGTTC -3′，加RNase-free water 7.4 μL至總體積20 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃ 30 s，隨后95 ℃ 10 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，共45 個(gè)循環(huán)。

1.2.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染干擾載體CXCR4 shRNA(5’- CCAAUGACUUGUGGGUGGUUG：UGUU -3’)及陰性對(duì)照載體(negative control)(5’- CAGUACUUUUGUGUAGUACAA -3’)均購(gòu)自上海Genechem公司。參照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞進(jìn)行消化，細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，用含10 FBS無(wú)抗生素的DMEM培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞數(shù)為6×106個(gè)/mL，以2×104個(gè)/mL于24孔培養(yǎng)板培養(yǎng)過(guò)夜，當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)達(dá)到75% 左右融合后進(jìn)行轉(zhuǎn)染。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染48 h后消化細(xì)胞，按1:6接種于6孔板，用無(wú)抗生素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.2.5 細(xì)胞分組：實(shí)驗(yàn)中共分為3組：正常非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株(A549)；吉西他濱耐藥肺癌細(xì)胞株(A549/Gem)；靶向沉默CXCR4后的吉西他濱耐藥肺癌細(xì)胞株(A549/Gem- CXCR4)。

1.2.6 MTT法檢測(cè)不同細(xì)胞株耐藥指數(shù)(resistance index，RI)及對(duì)Gemcitabine的半數(shù)抑制濃度(50% inhibitory concentration，IC50) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，用胰酶消化，制成單細(xì)胞懸液，并調(diào)整細(xì)胞濃度至3.5×104個(gè)/mL，接種于96孔板，每孔接種100 μL，置于恒溫培養(yǎng)箱中，孵育過(guò)夜，吸出原培養(yǎng)液，加入用培養(yǎng)液稀釋的不同濃度各種藥物200 μL，記為實(shí)驗(yàn)組。每個(gè)藥物濃度設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組(僅含培養(yǎng)基)、細(xì)胞對(duì)照組(僅含細(xì)胞和培養(yǎng)液不含藥物)。培養(yǎng)72 h后，加入5 mg/mL MTT溶液20 μL，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，用移液槍洗出培養(yǎng)基，加入150 μL DMSO，震蕩10 min使結(jié)晶溶解，酶標(biāo)儀490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值(OD)，計(jì)算生長(zhǎng)抑制率。生長(zhǎng)抑制率=[(細(xì)胞對(duì)照組OD值-實(shí)驗(yàn)組OD值)/(細(xì)胞對(duì)照組OD值-空白對(duì)照組OD值)]×100%。根據(jù)生長(zhǎng)抑制率計(jì)算藥物半數(shù)抑制濃度(IC50)。IR=耐藥細(xì)胞IC50/親本細(xì)胞IC50。

1.2.7 Western blot檢測(cè)：研究發(fā)現(xiàn)p38，JNK1/2及ERK1/2磷酸化蛋白表達(dá)水平與腫瘤化療敏感性密切相關(guān)[8-10]。為進(jìn)一步探究A549/Gem-CXCR4逆轉(zhuǎn)Gemcitabine耐藥的分子機(jī)制，本研究使用與Western blot技術(shù)檢測(cè)試驗(yàn)各組p38，JNK1/2，ERK1/2磷酸化蛋白表達(dá)水平，選擇生長(zhǎng)良好的細(xì)胞1×107個(gè)，細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白。BCA法測(cè)定蛋白濃度。SDS-PAGE凝膠電泳，半干轉(zhuǎn)膜法轉(zhuǎn)至PVDF膜。5%脫脂牛奶室溫封閉1 h。加一抗稀釋液(兔抗人CXCR4抗體1:500，兔抗人β-ACTIN抗體1:5000，抗phospho-p38抗體1:800，抗phospho-JNK1/2抗體1:500，抗phospho-ERK1/2抗體 1:400)4 ℃孵育過(guò)夜。TBST緩沖液洗膜后加相應(yīng)二抗稀釋液室溫孵育1 h。ECL化學(xué)發(fā)光，暗室顯影。膠片成像系統(tǒng)掃描記錄，全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析并拍照。蛋白表達(dá)以光密度表示，Quantity One軟件進(jìn)行灰度分析，以目的蛋白/內(nèi)參蛋白β-ACTIN表示蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 CXCR4在A549與A549/Gem細(xì)胞株的表達(dá)特征 通過(guò) 2-ΔΔCT計(jì)算 CXCR4 表達(dá)量在A549/Gem相對(duì)A549細(xì)胞株倍數(shù)并作圖。CXCR4在A549/Gem細(xì)胞株中的相對(duì)表達(dá)量為(6.3±0.56)要明顯高于在A549細(xì)胞株中的相對(duì)表達(dá)量(1.10±0.37)(P<0. 01)，見圖1A。同樣，Western blot結(jié)果顯示，A549/Gem細(xì)胞株中CXCR4的表達(dá)量(灰度值為3218761±78311)要明顯高于在A549細(xì)胞株中的相對(duì)表達(dá)量(灰度值為820064±53121)(P<0. 01)，見圖1B。

圖1 CXCR4在A549與A549/Gem細(xì)胞株的表達(dá)特征(n=3) A：mRNA；B：蛋白**P<0. 01，與A549比較Fig.1 Expressions of CXCR4 in both A549 and A549/Gem cell lines(n=3) A：mRNA；B：protein**P<0. 01，compared with A549

2.2 CXCR4 shRNA對(duì)A549/Gem細(xì)胞株CXCR4表達(dá)的影響 經(jīng)RT-qPCR檢測(cè)，與正常陰性對(duì)照組細(xì)胞株(A549/Gem)相比，CXCR4 shRNA組A549/Gem細(xì)胞株(A549/Gem-CXCR4)細(xì)胞中CXCR4 mRNA表達(dá)受到了明顯的抑制，其抑制率高達(dá)70%。CXCR4在A549/Gem-CXCR4細(xì)胞株中的相對(duì)表達(dá)量為(0.28±0.04)要明顯低于在A549/Gem細(xì)胞株中的相對(duì)表達(dá)量(1.00±0.07)(P<0.05)，見圖2A。同樣，Western blot檢測(cè)提示，A549/Gem-CXCR4細(xì)胞株中CXCR4的表達(dá)量(灰度值為306417±38311)要明顯低于在A549/Gem細(xì)胞株中的相對(duì)表達(dá)量(灰度值為2710994±63121)(P<0.05)，見圖2B。

圖2 CXCR4 shRNA對(duì)A549/Gem細(xì)胞株CXCR4表達(dá)的影響(n=3)A：mRNA；B：蛋白**P<0. 01，與A549比較Fig.2 The effect of CXCR4 shRNA in A549/Gem cell lines(n=3)A：mRNA；B：protein**P<0. 01，compared with A549

2.3 MTT法檢測(cè)A549，A549/Gem及A549/Gem-CXCR4細(xì)胞株對(duì)Gemcitabine的耐藥濃度(IC50)及耐藥指數(shù)(RI)分析 經(jīng)MTT試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)A549，A549/Gem和A549/Gem-CXCR4細(xì)胞株對(duì)Gemcitabine的IC50分別為(0.08±0.01)μmol/L，(14.01±0.21)μmol/L和(1.84±0.61)μmol/L，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0. 05)。A549/Gem細(xì)胞株對(duì)Gemcitabine的RI是(127.12±12.28)，遠(yuǎn)高于A549/Gem-CXCR4對(duì)Gemcitabine的RI值(27.3±0.98)，(P<0. 05)。

2.4 Western blot法測(cè)定A549 A549/Gem及A549/Gem-CXCR4細(xì)胞株中p38，JNK1/2，ERK1/2磷酸化蛋白表達(dá)水平結(jié)果顯示，與正常A549/Gem細(xì)胞株相比，CXCR4靶向沉默的A549/Gem-CXCR4 細(xì)胞株中ERK1/2，JNK1/2，p38的磷酸化受到了明顯的抑制，見圖3。Quantity One軟件進(jìn)行灰度分析Western blot檢測(cè)條帶的光密度，以β-ACTIN表達(dá)量作為蛋白定量分析內(nèi)參，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。與A549細(xì)胞株相比，A549/Gem細(xì)胞中p38的表達(dá)量以及JNK1/2和ERK1/2的磷酸化水平顯著升高(P<0.05)。見表1。與A549/Gem相比，A549/Gem-CXCR4細(xì)胞株中p38的表達(dá)量以及JNK1/2和ERK1/2的磷酸化水平顯著升高(P<0.05)。見表1。

圖3 A549，A549/Gem及A549/Gem-CXCR4細(xì)胞株中p38，JNK1/2，ERK1/2磷酸化蛋白表達(dá)變化(n=3)Fig.3 Expressions of p38, phosphor-JNK1/2 and phosphor-ERK1/2 in A549, A549/Gem and A549/Gem-CXCR4 cell lines(n=3)

組別p38phospho-ERK1/2phospho-JNK1/2β-actinA549934440±125688 603116±148758 198266±138248 4247626±237218 A549/Gem3794874±879348*1850118±133968*939474±137218*4146450±223778*A549/Gem-CX-CR41064940±231637△603116±142138△401540±124698△4345231±245718△

*P<0.01，與A549組相比，compared with A549；△P<0.01，與A549/Gem相比，compared with A549/Gem

3 討論

大部分腫瘤細(xì)胞都表達(dá)趨化因子及趨化因子受體，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中趨化因子及其受體表現(xiàn)出關(guān)鍵的作用。因此，以趨化因子及其受體分子為靶點(diǎn)，通過(guò)抑制或拮抗趨化因子受體的信號(hào)傳導(dǎo)來(lái)控制趨化因子系統(tǒng)的功能，可望用于有效防止惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)，具有潛在的臨床應(yīng)用前景。CXCR4是組織表達(dá)最為廣泛的細(xì)胞趨化因子受體之一，對(duì)多種惡性腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移都具有重要的調(diào)節(jié)作用[11]。

本研究為了探究靶向沉默CXCR4的表達(dá)對(duì)吉西他濱耐藥的影響，首先在體外實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了Gemcitabine耐藥的肺癌細(xì)胞模型A549/Gem，通過(guò)現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)CXCR4的表達(dá)量在耐藥肺癌細(xì)胞株A549/Gem明顯升高，提示CXCR4可能與吉西他濱的耐藥性有關(guān)；為了進(jìn)一步驗(yàn)證本猜想，本研究構(gòu)建了CXCR4靶向沉默的吉西他濱耐藥細(xì)胞株A549/Gem-CXCR4，并探究A549/Gem-CXCR4細(xì)胞株對(duì)Gemcitabine耐藥實(shí)驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與A549/Gem相比，A549/Gem-CXCR4對(duì)Gemcitabine的敏感性明顯提高，其耐藥程度降低。為了進(jìn)一步探究CXCR4的逆轉(zhuǎn)耐藥機(jī)理，本研究還考察了CXCR4對(duì)p38，phosphor-JNK1/2和phosphor-ERK1/2的表達(dá)量的影響。

c-Jun氨基末端激酶(c-Jun NH2-terminal kinase，JNK)是促分裂原活化蛋白激酶的一個(gè)亞群，為細(xì)胞凋亡信號(hào)傳導(dǎo)中的重要介質(zhì)。JNK包括了至少10種亞型，由JNK1、JNK2、JNK3基因編碼[12]。研究表明JNK磷酸化蛋白的失活和腫瘤細(xì)胞化療耐藥性密切相關(guān)，JNK磷酸化蛋白的激活可以明顯增加NSCLC對(duì)化療和放療的敏感性[13]。Teraishi等[12]對(duì)NSCLC耐Gemcitabine細(xì)胞株(H1299-GR)及其親本細(xì)胞株(H1299)進(jìn)行體外研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)H1299細(xì)胞株中JNK磷酸化蛋白被激活，而Gemcitabine誘導(dǎo)的H1299-GR細(xì)胞株中的JNK磷酸化蛋白始終未被激活。此外Teraishi等還在H1299細(xì)胞中通過(guò)一種特殊的JNK磷酸化蛋白阻斷劑SP600125來(lái)阻滯JNK磷酸化蛋白的正常信號(hào)傳導(dǎo)，結(jié)果表明Gemcitabine介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡顯著減少。另外對(duì)JNK1-JNK2融合蛋白的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染可以部分逆轉(zhuǎn)H1299-GR對(duì)Gemcitabine的耐藥。上述結(jié)果充分表明JNK在吉西他濱介導(dǎo)對(duì)NSCLC細(xì)胞毒過(guò)程中有著重要作用，同時(shí)JNK磷酸化蛋白活性的減少和Gemcitabine耐藥密切相關(guān)[14]。

p38為一個(gè)38kDa的酪氨酸磷酸化蛋白激酶，在各種細(xì)胞外刺激作用下，p38三肽基區(qū)的蘇氨酸、酪氨酸被雙磷酸化而被激活。近年研究表明p38在全身炎癥反應(yīng)、休克、細(xì)胞遷移、心血管疾病等方面具有重要作用[15]。最新研究發(fā)現(xiàn)p38的活化與肺癌的耐藥呈明顯負(fù)相關(guān)[16-17]。ERK1/2對(duì)腫瘤的作用主要體現(xiàn)在促增殖方面，活化的ERK激酶可激活或滅活其他信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的關(guān)鍵效應(yīng)分子(如NF-κB，Akt，CREB 等)以及重要的轉(zhuǎn)錄因子(Ets，Ap-1，C-myc)，并能調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)因子(cyclin D，p21)和凋亡分子(bcl-2，bcl-XI，F(xiàn)asI)的表達(dá)，其持續(xù)活化最終促進(jìn)細(xì)胞增殖和惡性轉(zhuǎn)化[18]。研究提示，ERK磷酸化蛋白活化，亦可增加腫瘤的化療敏感性[19]。進(jìn)一步探究發(fā)現(xiàn)靶向沉默CXCR4后A549/Gem-CXCR4細(xì)胞株中p38，JNK和ERK1/2的磷酸化蛋白活化減少。

上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，靶向沉默CXCR4表達(dá)能夠逆轉(zhuǎn)肺癌細(xì)胞吉西他濱耐藥性，提示CXCR4是肺癌臨床放射治療相關(guān)的有效分子靶點(diǎn)。該研究不僅為非小細(xì)胞癌吉西他濱耐藥機(jī)制提供了依據(jù)，也為聯(lián)合檢測(cè)CXCR4可能有助于評(píng)估肺癌的預(yù)后，并可為以此為靶點(diǎn)的腫瘤治療新藥的開發(fā)研究提供理論依據(jù)。

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(編校：譚玲)

Study on the reversion effect of targeting silence CXCR4 gene on Gemcitabine-resistance in non-small cell lung cancer

WANG Li-wenΔ, SHEN Xiao-jie, YU Ru-yun, LIN Li-li

(Department of Rehabilitation,Wuxi Technical Vocational College, Wuxi 214028, China)

ObjectiveTo explore the reversion effect of Gemcitabine-resistance A549 cell (A549/Gem) by silencing CXCR4.MethodsA549 cell was induced by continuous stepwise exposure to Gemcitabine in order to obtain Gemcitabine-resistance A549 cell (A549/Gem) in vitro. The CXCR4 expressions level of A549 and A549/Gem were detected by Quantitative RT-PCR (RT-qPCR) and Western blot analyses. The CXCR4 shRNA vector was transfected into the A549/Gem cell by targeting silence CXCR4. Furthermore, MTT assay was used to explore the IC50and RI in A549, A549/Gem and A549/Gem-CXCR4 cells. Moreover, Western blot analysis was performed to detect the expressions of phospho-JNK, phospho-p38 and phospho-ERK 1/2 in A549, A549/Gem and A549/Gem-CXCR4 cells.ResultsGemcitabine-resistance A549 cell (A549/Gem) was successful constructed by using continuous stepwise exposure to Gemcitabine in vitro. The expression level of CXCR4 was up-regulated in A549/Gem cell than in A549 cell. The CXCR4 shRNA vector could significantly decrease CXCR4 expression in A549/Gem cell. The IC50 values of Gemcitabine in A549, A549/Gem and A549/Gem-CXCR4 cell were (0.08±0.01) μmol/L, (14.01±0.21)μmol/L and (1.84±0.61)μmol/L, respectively. The RI value of Gemcitabine was (127.12±12.28) in A549/Gem cells, while the value of RI was (27.3±0.98) in A549/Gem-CXCR4 cells. The expression level of phospho-JNK, phospho-p38 and phospho-ERK 1/2 were also markedly inhibited in A549/Gem-CXCR4 cell than in A549/Gem cell. ConclusionCXCR4 is up-regulated in A549/Gem cell. Targeting silence CXCR4 can successfully reverse drug-resistance of Gemcitabine in A549/Gem cells, which hints CXCR4 is associated with lung cancer radiation therapy as an effective molecular target.

non-small cell lung cancer; Gemcitabine; CXCR4; drug-resistance

無(wú)錫市醫(yī)院管理中心科研項(xiàng)目 (YGZXM14021)

王立文，通信作者， 男，碩士，副教授，研究方向：康復(fù)治療技術(shù)研發(fā)，E-mail: wangliwen0310@163.com。

R734.2

A

1005-1678(2015)12-0024-05