MR干細(xì)胞標(biāo)記在替莫唑胺干預(yù)腦膠質(zhì)瘤血管生成及治療研究中的應(yīng)用

陳偉志，楊重恒

(1.遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院 放射科，遼寧 錦州 121001；2. 遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院 口腔科，遼寧 錦州 121001)

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MR干細(xì)胞標(biāo)記在替莫唑胺干預(yù)腦膠質(zhì)瘤血管生成及治療研究中的應(yīng)用

陳偉志1Δ，楊重恒2

(1.遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院 放射科，遼寧 錦州 121001；2. 遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院 口腔科，遼寧 錦州 121001)

目的 探究MR干細(xì)胞標(biāo)記在替莫唑胺干預(yù)腦膠質(zhì)瘤血管生成及治療中的作用。方法 通過C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞株靜脈注射建立大鼠腦膠質(zhì)瘤的動(dòng)物模型，采用MR干細(xì)胞標(biāo)記技術(shù)以及免疫組化觀測腫瘤生長及新生血管的生成，對比影像學(xué)與免疫組化檢測結(jié)果，進(jìn)行2者間的相關(guān)性分析。結(jié)果 本研究成功運(yùn)用MR掃描示蹤SPIO-PLL共同標(biāo)記的骨髓干細(xì)胞，動(dòng)態(tài)檢測了腦膠質(zhì)瘤模型大鼠腦內(nèi)腫瘤血管生成情況。影像學(xué)與免疫組化相關(guān)性分析結(jié)果顯示，2者呈現(xiàn)良好的負(fù)相關(guān)性(P<0.05)。結(jié)論 SPIO對于骨髓干細(xì)胞的磁性標(biāo)記標(biāo)記和MR示蹤技術(shù)是活體動(dòng)態(tài)觀察腦膠質(zhì)瘤血管生成的有效手段。

MR；干細(xì)胞標(biāo)記；腦膠質(zhì)瘤；血管生成

近年來，惡性腫瘤的發(fā)病率及死亡率正呈逐年上升的趨勢嚴(yán)重威脅著人類健康，其中膠質(zhì)瘤是腦部最常見、浸潤性最強(qiáng)的原發(fā)性腫瘤，其侵襲性的生長方式導(dǎo)致術(shù)后復(fù)發(fā)率高，治療效果不理想[1-2]。腫瘤的發(fā)展與血管的生成密不可分，無論原發(fā)性還是轉(zhuǎn)移性，腫瘤的持續(xù)生長都必須依賴于血管的新生，目前抗腫瘤血管生成是腫瘤治療的研究熱點(diǎn)之一，監(jiān)測腫瘤的血管新生情況也成為有效的抗腫瘤治療評價(jià)指標(biāo)[3-4]。磁性標(biāo)記骨髓干細(xì)胞能夠直接顯示腫瘤的新生血管，評價(jià)抗血管生成的治療效果，使活體檢測腫瘤的新生血管及抗血管生成治療效果成為可能[5-6]。本研究采用超順磁氧化鐵(superparamagnetic iron oxide，SPIO)及聚左旋賴氨酸(PLL)進(jìn)行大鼠腦膠質(zhì)瘤的干細(xì)胞標(biāo)記及MR示蹤，觀察腫瘤的血管生成及治療情況。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及細(xì)胞：1月齡雄性SPF級SD大鼠5只，體質(zhì)量(100±12)g；2月齡雄性SPF級SD大鼠50只，體質(zhì)量(200±25)g(大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號：2014-7A004)；膠質(zhì)瘤細(xì)胞為C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞株。

1.1.2 藥品與試劑：胎牛血清(美國Hyclone公司)；DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司)；胰酶(Shanghai生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)；替莫唑胺(江蘇天士力帝益藥業(yè)有限公司)；聚左旋賴氨酸(Sigma公司)；超順磁氧化鐵(德國拜爾公司)。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器：HH.CP-01型CO2培養(yǎng)箱(上海凱朗儀器設(shè)備廠)；CKX41倒置顯微鏡(日本奧林巴斯)；ACB-A超凈工作臺(新加坡藝思高科技有限公司)；1.5 T磁共振成像系統(tǒng)(Sonata Siemens公司)。

1.2 方法

1.2.1 骨髓干細(xì)胞分離及培養(yǎng)：取體重指數(shù)為(100±12)g的大鼠，頸椎脫臼處死后，取動(dòng)物的脛骨及股骨，用不加血清的DMEM培養(yǎng)基沖洗骨髓腔，獲得的細(xì)胞懸液2000 rpm離心 3 min， 棄去上清，沉淀中加入含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，反復(fù)吹打制成細(xì)胞懸液并計(jì)數(shù)，以2×107個(gè)/mL接種入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基內(nèi)，置于CO2培養(yǎng)箱中，37 ℃，5%CO2的條件下培養(yǎng)，每2 d換液1次，每周傳代1次，傳代至第4代時(shí)-20 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 骨髓干細(xì)胞的SPIO-PLL共同標(biāo)記：將20 g/mL的磁性標(biāo)記物SPIO與0.4 μg/mL的PLL混合，并加入到含有骨髓干細(xì)胞DMEM培養(yǎng)基中，37 ℃條件下孵育24 h。

1.2.3 大鼠腦膠質(zhì)瘤模型的建立：采用立體腦定位儀對大鼠進(jìn)行固定，于冠狀縫向前1 mm，中線旁開3 mm，深度5 mm處用微涼注射器注射C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞懸液5 μL，速度為1 μL/min。

1.2.4 SPIO-PLL共同標(biāo)記的骨髓干細(xì)胞的移植：注射C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞2周后，對于大鼠進(jìn)行MR掃描觀察腫瘤生長情況，對50只大鼠進(jìn)行造模，選取造模成功的40只進(jìn)行試驗(yàn)，尾靜脈注射SPIO-PLL共同標(biāo)記的骨髓干細(xì)胞懸液0.5 mL。

1.2.5 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及給藥：將40只已標(biāo)記的模型大鼠隨機(jī)分成2組，每組20只，分別為替莫唑胺組和對照組，替莫唑胺組按照1 mg/kg給予替莫唑胺，1次/周，連續(xù)給藥2周，對照組給予等量生理鹽水。

1.2.6 MR示蹤腦膠質(zhì)瘤內(nèi)SPIO-PLL共同標(biāo)記的骨髓干細(xì)胞分析方法：分別于標(biāo)記的骨髓干細(xì)胞的移植前1 d，給藥前 1 d 以及給藥2周后1、2 d進(jìn)行MR檢查，項(xiàng)目包括T1 WI，T2WI以及T2*map。T1 WI掃描：TE=400 ms，TR=9.5 ms；T2WI掃描：TE=3000 ms，TR=45 ms；T2*map掃描TE=3000 ms，TR=2.5-37 ms；采用常規(guī)橫斷位掃描層厚度1.0 mm，層間距0.0 mm，層數(shù)10，F(xiàn)OV=50-80 mm。觀察和分析T1 WI ，T2WI以及T2*map圖像上大鼠腦膠質(zhì)瘤的形態(tài)，信號特征，邊緣等情況，計(jì)算腫瘤體積。

1.2.7 MR擴(kuò)散加權(quán)成像掃描分析方法：采用SE-EPI的序列中10個(gè)擴(kuò)散敏感度的b值進(jìn)行加權(quán)擴(kuò)散成像，采用橫斷位掃描。TE=1800 ms，TR=85 ms，層厚度1.0 mm，層間距0.0 mm，層數(shù)10，F(xiàn)OV=70 mm。將不同b值的DWI圖像輸入Biomap軟件中進(jìn)行擬合，得到10個(gè)不同b值的表觀擴(kuò)散系數(shù)(ADC10b)，對照組和替莫唑胺組分別于治療前、治療后5 d以及治療后10d隨機(jī)選取12、14、14只大鼠進(jìn)行ADC10b擬合。

1.2.8 免疫組化檢測：2組分別于治療后5 d、10 d各14只大鼠經(jīng)MR掃描后處死相應(yīng)組別大鼠，取出瘤體并用10%甲醛固定，經(jīng)石蠟包切片、脫蠟至水，治療后5 d、10 d各14個(gè)的樣本隨機(jī)平均分成兩組分別進(jìn)行后進(jìn)行微血管密度(MVD)計(jì)數(shù)和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)表達(dá)的檢測。經(jīng)過石蠟包埋，切片，脫蠟至水，熱修復(fù)，3%過氧化氫的PBS封閉內(nèi)源性過氧化物酶，分別滴加一抗CD34(1:100)、一抗VEGF(1:100)，4 ℃過夜，沖洗，滴加二抗20 min，沖洗，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，PBS返藍(lán)，脫水，封片。2組分別于治療后5、10 d經(jīng)MR掃描后處死相應(yīng)組別大鼠，取出瘤體并用10%甲醛固定，經(jīng)石蠟包切片、脫蠟至水后進(jìn)行微血管密度(MVD)計(jì)數(shù)和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)表達(dá)的檢測。

1.2.9 ADC10b擬合結(jié)果與免疫組化結(jié)果相關(guān)性分析:分別將2組MR擴(kuò)散加權(quán)成像掃描中不同b值擬合出的ADC10b與免疫組化檢測中獲得的MVD計(jì)數(shù)及VEGF計(jì)分進(jìn)行Pearson線性相關(guān)性的分析。

2 結(jié)果

2.1 常規(guī)MR示蹤檢測結(jié)果 在注射SPIO-PLL共同標(biāo)記的骨髓干細(xì)胞前的模型大鼠的MR掃描結(jié)果可見大鼠腦右側(cè)基底節(jié)區(qū)域顯示T1WI信號稍低，T2WI信號稍高，腫瘤瘤體區(qū)域強(qiáng)化，腫瘤區(qū)域T2*map可見線狀針道信號，而腫瘤組織的T2*map信號未見明顯異常。將 T2WI 數(shù)據(jù)輸入 Biomap 軟件內(nèi)進(jìn)行擬合，獲得腫瘤組織的體積, 所有模型大鼠腫瘤的體積分布在50 mm3-100 mm3之間。劃取3次最大感興趣區(qū)，取其平均值計(jì)算腫瘤體積注射SPIO-PLL共同標(biāo)記的骨髓干細(xì)胞后的模型大鼠的MR掃描結(jié)果可見，T1WI和T2WI在腫瘤區(qū)域周圍均有低信號出現(xiàn)，但信號有逐漸消散的趨勢，表明被標(biāo)記的骨髓干細(xì)胞開始遷移和分化，由此可以證實(shí)SPIO-PLL標(biāo)記的骨髓干細(xì)胞向瘤體遷移的進(jìn)程可以被MR所示蹤。在給予抗腫瘤藥物治療后可見T2WI上出現(xiàn)一部分腫瘤信號不均勻，呈現(xiàn)斑塊狀的高信號液化壞死區(qū)域。見圖1。

圖1 治療前后模型大鼠常規(guī)MR掃描(n=3)Fig.1 Conventional MR scan in the model rats pre- and post-treatment(n=3)

2.2 ADC10b擬合 治療前替莫唑胺組和對照組的ADC10b值沒有顯著性差異，ADC圖像顯示腫瘤區(qū)呈現(xiàn)低信號，腫瘤邊界清晰。治療后5d和10d時(shí)，替莫唑胺組的ADC10b均高于對照組(P<0.05)。ADC圖像上顯示信號不均勻的現(xiàn)象，并可見斑塊狀液化壞死區(qū)域。見表1、圖2。

表1 2組腦膠質(zhì)瘤模型大鼠治療前后不同時(shí)段ADC10b值的測量結(jié)果±s)Tab.1 The measurement results of different time ADC10b value of the two groups pre-and post-treatment of brain glioma ±s)

*P<0.05，與對照組相比，compared with control group

圖2 治療前后ADC10b圖Fig.2 ADC10b figure pre-and post-treatment

2.3 免疫組化檢測結(jié)果 替莫唑胺組在治療后5 d和10 d，MVD計(jì)數(shù)值低于對照組(P<0.05)。在VEGF計(jì)分檢測中，替莫唑胺組在治療后5 d和10 d，VEGF計(jì)分值低于對照組(P<0.05)。見表2、表3、圖3、圖4。

表2 2組腦膠質(zhì)瘤模型大鼠治療后不同時(shí)段MVD計(jì)數(shù)的測定結(jié)果±s)Tab.2 The determination results of MVD counting of rat brain glioma model after treatment in different periods of two ±s)

*P<0.05，與對照組相比，compared with control group

表3 2組腦膠質(zhì)瘤模型大鼠治療后不同時(shí)段VEGF計(jì)分的 測定結(jié)果Tab.3 Determination results of VEGF score of rat brain glioma model after treatment in different periods of two ±s)

*P<0.05，與對照組相比，compared with control group

圖3 2組腦膠質(zhì)瘤模型大鼠治療后不同時(shí)段MVD結(jié)果圖A：替莫唑胺組治療后5 d；B：替莫唑胺組治療后10 d；C：對照組治療后5 d；D：對照組治療后10 dFig.3 MVD results of brain glioma model between two groups atdifferent time post-treatmentA: temozolomide group 5 d after post-treatment;B: temozolomide group 10 d after post-treatment;C: control group 5 d after post-treatment;D: control group 10 d after post-treatment

圖4 2組腦膠質(zhì)瘤模型大鼠治療后不同時(shí)段VEGF結(jié)果圖A：替莫唑胺組治療后5 d；B：替莫唑胺組治療后10 d；C：對照組治療后5 d；D：對照組治療后10 dFig.4 VEGF results of brain glioma model between two groups atdifferent time post-treatment A: temozolomide group 5 d after post-treatment;B: temozolomide group 10 dafter post-treatment;C: control group 5 d after post-treatment;D: control group 10 d after post-treatment

2.4 ADC10b擬合結(jié)果與免疫組化結(jié)果相關(guān)性分析 分別將2組MR擴(kuò)散加權(quán)成像掃描中不同b值擬合出的ADC10b與免疫組化檢測中獲得的MVD計(jì)數(shù)及VEGF計(jì)分進(jìn)行Pearson線性相關(guān)性的分析。結(jié)果顯示，ADC10b與免疫組化檢測中獲得的MVD計(jì)數(shù)(r=-0.647，P=0.000)及VEGF計(jì)分(r=-0.571，P=0.000)均顯示出良好的負(fù)相關(guān)性，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。這充分說明了采用MR示蹤SPIO-PLL共同標(biāo)記的骨髓干細(xì)胞方法進(jìn)行腦膠質(zhì)瘤血管生成的檢測是可行的。

3 討論

腫瘤的新生血管在腫瘤的生長與轉(zhuǎn)移中具有十分重要的作用，它不僅為腫瘤的生長提供血液等營養(yǎng)物質(zhì)，更為腫瘤細(xì)胞的浸潤和轉(zhuǎn)移提供通道[7]。病理學(xué)中常采用MVD來評判腫瘤的血管生成情況。CD34是血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性標(biāo)記物之一，能夠特異性的表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞，MVD可以借助于CD34特異性表達(dá)從而直接定量的反映腫瘤組織的血管生成情況[8-9]。血管的新生依賴于多種細(xì)胞因子的調(diào)控，其中血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)是目前已知的最強(qiáng)的血管滲透劑，可以增加微血管的滲透性，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移，誘導(dǎo)毛細(xì)血管管腔的形成，達(dá)到促進(jìn)血管生成的作用。VEGF體內(nèi)促進(jìn)血管內(nèi)發(fā)生，體外促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增生，VEGF不僅對血管內(nèi)皮細(xì)胞有趨化和生長刺激作用，而且誘導(dǎo)產(chǎn)生相關(guān)的蛋白產(chǎn)物參于血管外基質(zhì)的降解，使VEGF從基質(zhì)中釋放，參與血管的形成[10-12]。

雖然MVD和VEGF等指標(biāo)均能有效地反映機(jī)體內(nèi)腫瘤組織的血管生成情況，但在臨床應(yīng)用中存在諸多限制，不能進(jìn)行實(shí)時(shí)、動(dòng)態(tài)、可重復(fù)的操作和觀察。隨著分子影像學(xué)技術(shù)的發(fā)展，新的影像學(xué)技術(shù)能顯示早期的細(xì)胞代謝及血流灌注等相關(guān)信息，其中MR以其安全無輻射、可定量等優(yōu)勢在觀察機(jī)體內(nèi)腫瘤的變化和發(fā)展方面越來越受到關(guān)注[13-14]。在體外使用SPIO對目標(biāo)干細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，通過轉(zhuǎn)染劑的修飾進(jìn)一步提高有效磁標(biāo)記率，利用磁共振成像追蹤干細(xì)胞的增殖、移行等情況來判斷腫瘤組織的變化，從而達(dá)到實(shí)時(shí)、高效、可重復(fù)的觀察目的，有利于臨床的治療與研究的開展[15]。

同時(shí)，本研究采用相關(guān)性分析，進(jìn)一步驗(yàn)證了MR示蹤SPIO-PLL共同標(biāo)記的骨髓干細(xì)胞方法進(jìn)行腦膠質(zhì)瘤血管生成的檢測的可行性。本研究中選取的ADC10b與細(xì)胞增值的情況密切相關(guān)，可以動(dòng)態(tài)的反映腫瘤區(qū)域血管增值的情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明其變化與免疫組化的結(jié)果呈現(xiàn)良好的負(fù)相關(guān)性，且在可操作性、數(shù)據(jù)采集的連續(xù)性以及患者依從性方面較免疫組化方法更加具有優(yōu)勢。隨著該項(xiàng)技術(shù)在實(shí)驗(yàn)和臨床實(shí)踐中的不斷進(jìn)步，它將會得到越來越廣泛的應(yīng)用。

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(編校：王冬梅)

Application of MR stem cell markers in research of temozolomide intervention gliomas angiogenesis and therapy

CHEN Wei-zhi1Δ, YANG Zhong-heng2

(1.Department of Radiology, First Affiliated Hospital of Liaoning Medical University, Jinzhou 121001, China; 2. Department of Stomatology, First Affiliated Hospital of Liaoning Medical University, Jinzhou 121001, China)

ObjectiveTo explore the role of MR stem cell markers in temozolomide intervention gliomas angiogenesis and therapy.MethodsC6 glioma cells were intravenously injected in glioma model rat. MR stem cell markers and immunohistochemistry were used to observe the tumor growth and angiogenesis. Correlation of contrast imaging and immunohistochemistry results were studied.ResultsIn this study, MR scanning was successfully used to trace the SPIO-PLL marked bone marrow stem cells, dynamic testing of angiogenesis in rat brain glioma tumor. Correlation analysis of imaging and immunohistochemical showed that they had a good negative correlation (P<0.05).ConclusionSPIO magnetic markers for bone marrow stem cells and MR tracing technique is an effective means of dynamic observation in vivo glioma angiogenesis.

MR; stem cell markers; glioma; angiogenesis

國家自然科學(xué)基金計(jì)劃(2013022027)

陳偉志，通信作者，男，碩士，主治醫(yī)師，研究方向：神經(jīng)影像診斷，E-mail:lnchenwwizhi@163.com。

R445

A

1005-1678(2015)12-0009-04