SULT1A3與芹菜素的磺酸化結(jié)合反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)特征研究

蔣昆諭,呂曉,周昱,周一平,馬穎林,孟勝男

(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院 藥劑教研室，遼寧 沈陽(yáng) 110013)

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SULT1A3與芹菜素的磺酸化結(jié)合反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)特征研究

(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院 藥劑教研室，遼寧 沈陽(yáng) 110013)

目的 研究人重組酶SULT1A3與芹菜素的磺酸化結(jié)合反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)特征。方法 采用高效液相色譜法，測(cè)定芹菜素的消除量及其磺酸化結(jié)合反應(yīng)代謝產(chǎn)物的生成量，并應(yīng)用LC-MS/MS液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)鑒定其結(jié)構(gòu)。建立芹菜素與重組酶SULT1A3體外反應(yīng)體系，測(cè)定SULT1A3催化不同濃度芹菜素的磺酸化結(jié)合反應(yīng)代謝速率，采用GraphPad Prism 5軟件對(duì)其進(jìn)行酶動(dòng)力學(xué)分析。結(jié)果 芹菜素在0.15625～30 μM范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，平均回收率大于80%，日內(nèi)和日間的RSD均小于15%。芹菜素與SULT1A3孵育體系中的代謝產(chǎn)物為單磺酸化結(jié)合產(chǎn)物。芹菜素與人重組酶SULT1A3的反應(yīng)呈底物抑制動(dòng)力學(xué)特征。芹菜素與SULT1A3酶反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)參數(shù)Km和Ksi分別為(0.355±1.04)、(23.62±0.06) μM，Vmax為(65.71±1.30) nmol/(min·mg)，Vmax/Km為185.10 mL/(min·mg)。結(jié)論 人重組酶SULT1A3可介導(dǎo)芹菜素的磺酸化結(jié)合反應(yīng)，且其酶動(dòng)力學(xué)特征呈現(xiàn)底物抑制效應(yīng)。推測(cè)由SULT1A3介導(dǎo)的磺酸化結(jié)合反應(yīng)可能在芹菜素的體內(nèi)II相代謝中發(fā)揮重要的作用。

芹菜素；SULT1A3重組酶；磺酸化代謝；動(dòng)力學(xué)特征

圖1 芹菜素結(jié)構(gòu)圖Fig.1 Structure of apigenin

芹菜素(apigenin, API)是一類廣泛存在于蔬菜和水果中的黃酮類化合物，化學(xué)名為4’,5,7 -三羥基黃酮，見(jiàn)圖1[1]。對(duì)多種腫瘤具有抑制生長(zhǎng)，誘導(dǎo)凋亡的作用，此外還具有預(yù)防高血壓、抗炎、抗氧化等藥理作用[2-4]。但是由于芹菜素的理化性質(zhì)，水溶性較差，生物利用度較低，在一定程度上限制了它的應(yīng)用。研究發(fā)現(xiàn)芹菜素在人體內(nèi)存在強(qiáng)烈的Ⅱ相代謝反應(yīng)，這是導(dǎo)致其生物利用度低的主要原因[5-6]。由磺基轉(zhuǎn)移酶(sulfotransferases, SULTs)介導(dǎo)的磺酸化結(jié)合反應(yīng)是一種重要的Ⅱ相代謝反應(yīng)。SULT1A3是SULTs超基因家族中的一個(gè)重要的亞酶，在人體內(nèi)尤其是小腸內(nèi)表達(dá)量多，底物譜廣泛且多為兒茶酚胺類化合物[7-8]。目前，SULT1A3是否在芹菜素的磺酸化代謝中發(fā)揮作用以及其代謝特性尚不清楚。本文應(yīng)用人重組SULT1A3與芹菜素的體外孵育體系，考察芹菜素的磺酸化代謝特性，為進(jìn)一步闡明芹菜素的體內(nèi)代謝行為，促進(jìn)其在臨床合理、有效應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)和科學(xué)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 儀器 HPLC- waters 2695，2489 UV檢測(cè)器；API 3200 Q Trap三重四極桿質(zhì)譜(Applied Biosystem/MDS SCIEX， Foster City， CA)；SHA-CA恒溫水浴震蕩器(金壇市精達(dá)儀器制造廠)；紫外分光光度計(jì)TU-1901(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)；TLL-C高速冷凍離心機(jī)(北京四環(huán)科學(xué)儀器廠)；METTLER TOLEDO AL104分析天平、METTLER TOLEDO 320 pH計(jì)(瑞士梅特勒-托利多)。

1.2 藥品與試劑 芹菜素(陜西慧科，純度>99%)；人重組酶SULT1A3(英國(guó)Cypex)；3’-磷酸腺苷-5’-磷酰硫酸(3′-Phosphoadenosine 5′-phosphosulfate， PAPS)(美國(guó)sigma)；色譜純乙腈(天津康科德)；醋酸銨、鹽酸、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀(分析純)；超純水(Millipore)。

1.3 色譜與質(zhì)譜條件 色譜分析條件為：色譜柱：Thermo-C18(250 mm×4.6 mm，5 μM)；流動(dòng)相：乙腈(A)-(2.5 mM)pH4.5醋酸銨水溶液(B)，梯度洗脫，0～2 min，10%～25%A ；2～3 min，25%～40%A ；3～5 min，40%～60%A ；5～9 min，60%～65%A；9～15 min，65%～80%A；15～16 min，80%～90%A；16～18 min，90%～10%A；18～20 min，10%A。內(nèi)標(biāo)：睪酮。進(jìn)樣量：20 μL。流速：1 mL/ min。本實(shí)驗(yàn)采用雙通道紫外檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm(內(nèi)標(biāo))和340 nm(芹菜素及其代謝產(chǎn)物)。柱溫：30 ℃。采用液相色譜質(zhì)譜方法測(cè)定芹菜素及其磺酸化代謝產(chǎn)物。質(zhì)譜分析條件：負(fù)離子方式檢測(cè)；離子噴霧電壓：-4.0 kV；源溫度：400 ℃；噴霧氣(gas l)：氮?dú)猓?0 psi；渦輪氣(gas 2)：氫氣，20 psi；保護(hù)氣：氮?dú)猓?0 psi。采用一級(jí)全掃描質(zhì)譜及選擇離子全掃描二級(jí)質(zhì)譜2種方式同時(shí)測(cè)定。

1.4 體外代謝系統(tǒng)孵育條件及樣品處理 芹菜素的磺酸化代謝反應(yīng) 芹菜素與SULT1A3的酶動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)：取系列濃度的芹菜素適量，分別加入50 mM KPI緩沖液中(pH7.4)，加入SULT1A3酶(終濃度為0.00267～0.0053 mg/mL)，最后加入0.1 mM PAPS溶液?jiǎn)⑹挤磻?yīng)，孵育體系總體積為200 μL，混勻，37 ℃水浴孵育一定時(shí)間后，加入預(yù)凍的50 μL的100 μM睪丸酮溶液終止反應(yīng)[9-10]。

樣品處理：反應(yīng)終止后，樣品進(jìn)行渦旋60 s后進(jìn)行離心(4 ℃， 7700×g)，離心20 min，取上清液進(jìn)行HPLC及HPLC/MS/MS分析測(cè)定，進(jìn)樣量20 μL。

底物抑制動(dòng)力學(xué)方程：

V為酶反應(yīng)速率，C為底物濃度，Vmax為高親和狀態(tài)時(shí)的最大反應(yīng)速率，Km是達(dá)到Vmax一半時(shí)底物的濃度，Ksi是底物抑制常數(shù)[11]。

2 結(jié)果

2.1 方法學(xué)驗(yàn)證

2.2.1 線性與專屬性：在本實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)條件下，本方法具有良好的專屬性，芹菜素及其代謝產(chǎn)物峰形良好，無(wú)內(nèi)源性雜質(zhì)干擾。芹菜素標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.042x-0.011，相關(guān)系數(shù)R2=0.999，其中y代表芹菜素與內(nèi)標(biāo)睪酮峰面積的比值，x代表芹菜素的濃度。芹菜素代謝產(chǎn)物濃度在0.15625～30 μM范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

2.2.2 回收率與精密度：芹菜素在人重組SULT1A3酶中濃度分別為2.5、10、30 μmol/L 時(shí)，提取回收率(n=6) 分別為(89.23±5.50)%、(88.27±3.45)%、(86.30±4.86)%。日內(nèi)精密度 RSD(n=6)分別為 2.01%、0.43%、0.46%; 日間精密度 RSD(n=6)分別為3.57 %、2.28%、2.35%。

2.2 芹菜素磺酸化結(jié)合產(chǎn)物HPLC圖譜的確認(rèn)與定量 芹菜素與SULT1A3孵育體系反應(yīng)后，產(chǎn)生一種磺酸化代謝產(chǎn)物(API-S)，其出峰時(shí)間為7.1 min，該峰位于母體(API)的前面，芹菜素的保留時(shí)間為8.5 min，見(jiàn)圖2。該代謝產(chǎn)物在不加PAPS的體系中則不產(chǎn)生。由于無(wú)市售芹菜素磺酸化代謝產(chǎn)物，因此本研究基于其母體芹菜素的標(biāo)準(zhǔn)曲線，以及確定兩者之間的轉(zhuǎn)換因子K并進(jìn)行校正，從而對(duì)芹菜素代謝產(chǎn)物進(jìn)行定量。本實(shí)驗(yàn)測(cè)得的芹菜素磺酸化代謝產(chǎn)物與芹菜素之間的轉(zhuǎn)化因子K值為1.18。具體操作參見(jiàn)文獻(xiàn)[12]。

芹菜素在SULT1A3空白孵育體系(不加PAPS) 芹菜素在SULT1A3孵育體系圖2 芹菜素在SULT1A3孵育體系的HPLC 色譜圖Fig.2 HPLC profile of API and API-S in SULT1A3

2.3 LC/MS/MS鑒定芹菜素的磺酸化代謝產(chǎn)物 本實(shí)驗(yàn)采用LC/MS/MS技術(shù)進(jìn)一步鑒定芹菜素及其代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)。質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果顯示，樣品產(chǎn)生的準(zhǔn)分子離子峰[M-H]-m/z為349.2，與芹菜素的磺酸化結(jié)合產(chǎn)物的相對(duì)分子質(zhì)量(350.2)相吻合。另一分子離子峰m/z為268.6 與準(zhǔn)分子離子峰的相對(duì)分子質(zhì)量相差80，推斷其為[M-SO3]-，即丟失1個(gè)磺酸基碎片所致。由此可確認(rèn)代謝產(chǎn)物即為芹菜素磺酸化結(jié)合反應(yīng)產(chǎn)物。見(jiàn)圖3。

圖3 芹菜素及其代謝產(chǎn)物的質(zhì)譜圖Fig.3 LC-MS/MS profile of apigenin and its metabolites

2.4 芹菜素在人重組SULT1A3中代謝的酶動(dòng)力學(xué)考察 芹菜素與SULT1A3的酶促動(dòng)力學(xué)曲線見(jiàn)圖4，其對(duì)應(yīng)的Eadie-Hofstee見(jiàn)圖5。芹菜素與SULT1A3的反應(yīng)呈現(xiàn)底物抑制的動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)，即SULT1A3介導(dǎo)的芹菜素磺酸化代謝反應(yīng)速率隨芹菜素濃度增大而升高，而當(dāng)芹菜素濃度大于4 μM時(shí)則逐漸降低。SULT1A3介導(dǎo)芹菜素的動(dòng)力學(xué)參數(shù)Km和Ksi分別為(0.355±1.04)，(23.62±0.06) μM，Vmax為(65.71±1.30)nmol/(min·mg)，Vmax/Km為185.10 mL/(min·mg)。

圖4 芹菜素與SULT1A3的酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)曲線圖Fig.4 Kinetic curve of SULT1A3 catalyzed metabolism of apigenin

圖5 芹菜素與SULT1A3的酶促反應(yīng)的Eadie-Hofstee圖Fig.5 Eadie-Hofstee plot of SULT1A3 catalyzed metabolism of apigenin

3 討論

磺酸化結(jié)合反應(yīng)是內(nèi)源性物質(zhì)和外源性物質(zhì)的重要代謝途徑。在磺酸化結(jié)合反應(yīng)中，SULT1A3將其輔因子3’-磷酸腺苷-5’-磷酰硫酸(PAPS)的親電子硫基部分轉(zhuǎn)移至芹菜素的酚羥基上，生成親電子的硫酸酯類復(fù)合物[13-14]，使底物的親水性增加，使其利于排泄。由于芹菜素具有3個(gè)酚羥基，本研究證明芹菜素磺酸化結(jié)合反應(yīng)只產(chǎn)生一種代謝產(chǎn)物，即可推測(cè)PAPS只與芹菜素的1個(gè)酚羥基相結(jié)合，PAPS的親電子硫基部分具體轉(zhuǎn)移至哪個(gè)酚羥基上則需進(jìn)一步研究。

本研究中SULT1A3介導(dǎo)的芹菜素磺酸化結(jié)合反應(yīng)呈現(xiàn)底物抑制動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)，提示在高底物濃度下代謝速率減小。SULT1A3介導(dǎo)的芹菜素磺酸化代謝反應(yīng)的Km較小，且Vmax/Km較大，說(shuō)明芹菜素在與SULT1A3反應(yīng)具有高親和性和高體內(nèi)清除率。而Riches等[15]證明的SULT1A3在人腸道內(nèi)表達(dá)量較多，肝臟中幾乎不表達(dá)，由此可推斷由SULT1A3介導(dǎo)的磺酸化結(jié)合反應(yīng)可能在芹菜素的體內(nèi)II相代謝中發(fā)揮重要的作用，小腸可能是芹菜素磺酸化代謝的主要器官之一。后續(xù)研究將對(duì)芹菜素的II相代謝特征進(jìn)行綜合考察。

本研究首次明確了SULTs家族中由SULT1A3介導(dǎo)的芹菜素磺酸化代謝的酶動(dòng)力學(xué)特性。了解芹菜素的代謝特點(diǎn)有助于解析芹菜素發(fā)揮藥效和毒性反應(yīng)的物質(zhì)基礎(chǔ)，并能提高其生物利用度的辦法，將為芹菜素的藥用開(kāi)發(fā)及其在臨床合理應(yīng)用提供理論支持和科學(xué)指導(dǎo)。

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(編校：王冬梅)

Study on kinectics characteristics of the sulfation of apigenin by SULTIA3

JIANG Kun-yu,LV Xiao-yue,ZHOU Yu,ZHOU Yi-ping,MA Ying-lin,MENG Sheng-nanΔ

(Department of Pharmaceutics, School of pharmacy, China Medical University, Shenyang 110013, China)

ObjectiveTo investigate the kinectics characteristics of sulfation of apigenin mediated by SULTIA3.MethodsAfter incubation of apigenin using in vitro SULT1A3 system, high-performance liquid chromatography was utilized to determine the sulfates of apigenin. Mass spectrum(MS) were employed to elucidate the structure of metabolite. The program GraphPad Prism 5 was used to perform the kinetic characterization of SULT1A3 catalyzed metabolism of apigenin.ResultsA liner calibration curve for the assay of apigenin was validated in the range of 0.15625～30 μM with the recoveries of at least 80% and intra-day and inter-day RSD of less than 15%. Metabolic product of apigenin and SULT1A3 in the incubated system was identified one monosulfate. The metabolic behavior of apigenin in SULT1A3 was followed substrate inhibition kinetics. Apparent kinetic parameters of metabolism of apigenin by SULT1A3, Kmwas(0.355±1.04) μM and Ksiwas(23.62±0.06) μM，Vmaxwas(65.71±1.30) nmol/(min·mg)，Vmax/Kmwas 185.10 mL/(min·mg).ConclusionSULT1A3 can mediate the binding of apigenin sulfonated reaction, and the character of enzymatic kinetics shows substrate inhibition. Sulfation of apigenin mediated by SULTIA3 may play an important role in phaseⅡmetabolic in vivo.

apigenin; SULT1A3; sulfation; kinetic characterization

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81173123)；遼寧省自然科學(xué)基金課題(2013021080)

蔣昆諭，女，碩士，助教，研究方向：藥物吸收與代謝特性，E-mail：cmu_kyjiang@163.com；孟勝男，通訊作者，女，博士，教授，研究方向：藥物制劑及藥物吸收與代謝特征，E-mail：shnmeng_16@163.com。

R963

A

1005-1678(2015)03-0153-03