烏頭堿對(duì)室間隔缺損模型大鼠血清鋅指蛋白41和富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白的影響研究

余成

(海南省人民醫(yī)院 心臟外科，海南 ?？?570311)

?

烏頭堿對(duì)室間隔缺損模型大鼠血清鋅指蛋白41和富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白的影響研究

余成

(海南省人民醫(yī)院 心臟外科，海南 海口 570311)

目的 探究烏頭堿對(duì)室間隔缺損模型大鼠血清鋅指蛋白41和半胱氨酸的酸性分泌蛋白(Secreted protein acidic and rich in cysteine,SPARC)的影響。方法 選取80只室間隔缺損模型大鼠，隨機(jī)分為2組，其中實(shí)驗(yàn)組40只經(jīng)尾靜脈注射，給予0.05 mg/kg烏頭堿，連續(xù)7 d；對(duì)照組40只予等量生理鹽水經(jīng)尾靜脈注射，連續(xù)7 d。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，各組大鼠腹主動(dòng)脈取血，分別采用Western blot法和ELISA法測(cè)定血清中鋅指蛋白41和SPARC，表達(dá)并進(jìn)行比較。結(jié)果 Western blot結(jié)果表明，2組血清樣本中，鋅指蛋白41和SPARC均有所表達(dá)，但實(shí)驗(yàn)組鋅指蛋白41和SPARC相對(duì)表達(dá)均明顯低于對(duì)照組(P<0.05)；ELISA結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組鋅指蛋白41和SPARC的濃度均明顯低于對(duì)照組(P<0.05)。結(jié)論 烏頭堿能夠明顯降低室間隔缺損模型大鼠血清鋅指蛋白41和SPARC的表達(dá)水平。

烏頭堿；室間隔缺損；鋅指蛋白41；半胱氨酸的酸性分泌蛋白

室間隔缺損(ventricular septal defect，VSD)是由于遺傳因素、環(huán)境因素等導(dǎo)致胚胎的室間隔發(fā)育不完全而引起的一種先天性心臟疾病[1]。本病臨床表現(xiàn)為氣促、呼吸困難、反復(fù)發(fā)生的肺部感染、喂養(yǎng)困難、乏力、多汗、紫紺等，嚴(yán)重者可出現(xiàn)心力衰竭，臨床表現(xiàn)的嚴(yán)重程度與缺損大小有關(guān)[2]。本病多發(fā)于嬰幼兒，據(jù)2007年九屆中國南方國際心血管病學(xué)術(shù)會(huì)議調(diào)查統(tǒng)計(jì)[3]，我國VSD患者的發(fā)病率為0.3%，占到小兒先天性心臟病的50%左右，并有逐年上升趨勢(shì)。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，本病人們更加重視疾病防治及預(yù)后，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)多試圖從蛋白質(zhì)表達(dá)與調(diào)控方面探索疾病診斷治療的新思路[4]。研究發(fā)現(xiàn)[5]，目前室間隔缺損多采取手術(shù)治療，術(shù)后多配合烏頭堿等藥物增強(qiáng)心肌收縮力，但關(guān)于烏頭堿對(duì)VSD的作用研究較少。本研究旨在通過觀察烏頭堿對(duì)各組室間隔缺損模型大鼠血清鋅指蛋白41、半胱氨酸的酸性分泌蛋白(secreted protein acidic and rich in cysteine，SPARC)水平的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選擇Jcl:ICR的懷孕母鼠，在妊娠8.5 d給予70 mg/kg視黃酸，待產(chǎn)崽后通過動(dòng)物B超儀器，篩選室間隔缺損模型大鼠80只(由中國醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室提供，合格證號(hào)：遼H00132)，體質(zhì)量(280±30)g。大鼠均采用標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，自由進(jìn)食，室溫控制在19 ℃～23 ℃，濕度控制在55%～60%，本實(shí)驗(yàn)遵循《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物保護(hù)條例》，符合3R原則。

1. 2 主要試劑和儀器 烏頭注射液(菏澤步長(zhǎng)制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字Z37021104)；大鼠鋅指蛋白41抗體、大鼠鋅指蛋白41 ELISA試劑盒、大鼠SPARC抗體、大鼠SPARC ELISA試劑盒(上海凱博生化試劑有限公司)；PBS漂洗緩沖液(BOSTER公司)；Western封閉液、專用一抗二抗稀釋液、DyLight 680標(biāo)記羊抗鼠IgG二抗(上海雙螺旋生物科技有限公司)；蛋白電泳儀、離心機(jī)(美國貝克曼庫爾特公司)；Spectra Max M5酶標(biāo)儀(美國Molecular Devices)。

1.3 分組給藥及標(biāo)本采集 將室間隔缺損模型大鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組40只。實(shí)驗(yàn)組大鼠經(jīng)尾靜脈注射予0.05 mg/kg烏頭堿，對(duì)照組大鼠給予等量的0.9%氯化鈉注射液，均連續(xù)注射7d；實(shí)驗(yàn)前后分別抽取大鼠的腹腔動(dòng)脈血10 mL，靜置于4 ℃冰箱，1 h后3000 r/min離心，取上清液，置于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 Western blot法測(cè)定鋅指蛋白41和SPARC含量 在保存的各血清中加入TBS液進(jìn)行稀釋(10×)；加入上樣緩沖液，分別于沸水、冰塊中放置5 min，之后離心1 min；將各樣本加入上樣孔中；將電泳槽電壓設(shè)置在80 V，進(jìn)行電泳至分離膠染色，電壓改為120 V，至染色區(qū)域距玻璃板1 cm停止；利用轉(zhuǎn)膜儀將凝膠染色轉(zhuǎn)至經(jīng)甲醇浸泡過的PVDF膜上；室溫下，將PVDF膜置入含有Western blot抗體的孵育30 min后封閉，2 h后用TBST沖洗5 min，反復(fù)進(jìn)行3次；將封閉過的PVDF膜置入稀釋后的大鼠鋅指蛋白41抗體溶液(大鼠SPARC抗體溶液，稀釋1000倍)中，4 ℃搖床過夜；將PVDF膜置入稀釋后的DyLight 680 標(biāo)記羊抗鼠IgG二抗(稀釋1000倍)溶液中2 h；清洗后利用紅外激光成像系統(tǒng)掃描，觀察蛋白的表達(dá)量[6]。

1.5 ELISA法測(cè)定鋅指蛋白41和SPARC含量 鋅指蛋白41和SPARC含量測(cè)定嚴(yán)格按照 ELISA試劑盒說明操作。

2 結(jié)果

2.1 Western blot法檢測(cè)2組大鼠血清鋅指蛋白41和SPARC表達(dá) Western blot結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組鋅指蛋白41和SPARC表達(dá)水平均明顯低于對(duì)照組(P<0.05)，見圖1、圖2。

圖1 Western blot 測(cè)定2組鋅指蛋白41和SPARC的表達(dá)1-4：實(shí)驗(yàn)組；5-8：對(duì)照組Fig.1 Western blot results of zinc finger protein 41 and SPARC expression in two groups1-4: experimental group;5-8:control group

圖2 Western blot法測(cè)定2組鋅指蛋白41和SPARC含量*P<0.05,與對(duì)照組相比Fig.2 Western blot results of zinc finger protein 41 and SPARC content*P<0.05,compared with control group

2.2 ELISA法檢測(cè)2組鋅指蛋白41和SPARC濃度 ELISA結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組鋅指蛋白41和SPARC含量均明顯低于對(duì)照組(P<0.05)，見表1。

組別 只數(shù)鋅指蛋白41SPARC對(duì)照組40137.63±55.34197.05±86.49實(shí)驗(yàn)組40101.67±36.11*141.58±78.73*

*P<0.05，與對(duì)照組相比，compared with control group

3 討論

室間隔屬于最常見的先天性心臟病，嚴(yán)重影響嬰幼兒的生命健康，具有較高的死亡率[7]。研究認(rèn)為其發(fā)病與環(huán)境、遺傳因素有關(guān)[8]，但具體的發(fā)病機(jī)制尚不明確。研究認(rèn)為[9]，先天性心臟病的發(fā)生與心臟發(fā)育的信號(hào)傳導(dǎo)通路有關(guān)，在傳導(dǎo)中起重要作用的是各種蛋白質(zhì)，鋅指蛋白41和SPARC是研究最多的2種[10]。鋅指蛋白41屬于DNA轉(zhuǎn)錄因子，能夠與DNA結(jié)合，調(diào)控DNA活性，影響心臟發(fā)育所必需蛋白質(zhì)的產(chǎn)生，參與心肌細(xì)胞增殖和心臟形成過程[11]；SPARC亦稱骨連接蛋白，具有影響組織分化、參與胚胎發(fā)育、調(diào)節(jié)細(xì)胞的黏附與遷移、抑制內(nèi)皮DNA合成等作用[12]。很多研究表明，在室間隔缺損患者血清中鋅指蛋白41和SPARC表達(dá)水平均有所升高，可以作為評(píng)價(jià)室間隔缺損的血清標(biāo)志物[13]。本研究即通過觀察烏頭堿對(duì)室間隔缺損模型大鼠血清鋅指蛋白41和SPARC的影響，來探索烏頭堿對(duì)室間隔缺損的作用。

Western blot法和ELISA法是目前蛋白組學(xué)定性定量檢測(cè)最常用的辦法，2者在應(yīng)用上各有側(cè)重，本研究聯(lián)合應(yīng)用以提高結(jié)果的準(zhǔn)確性。Western blot結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組鋅指蛋白41和SPARC相對(duì)表達(dá)值均明顯低于對(duì)照組(P<0.05)；ELISA結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組鋅指蛋白41和SPARC含量均明顯低于對(duì)照組(P<0.05)；提示烏頭堿能夠明顯降低室間隔缺損大鼠血清中鋅指蛋白41和SPARC的表達(dá)及含量，這可能與烏頭堿能夠影響心肌細(xì)胞膜內(nèi)鈣離子通道的開合，導(dǎo)致鈣超載，鈣信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)隨之改變，因而影響鋅指蛋白41和SPARC的表達(dá)有關(guān)[14]。根據(jù)以上研究結(jié)果，可以認(rèn)為烏頭堿對(duì)室間隔缺損大鼠有正面作用，但具體的作用機(jī)制，還需進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，烏頭堿能夠明顯降低室間隔缺損模型大鼠血清鋅指蛋白41和SPARC的表達(dá)水平。

[1] 梁雪村，黃國英.室間隔缺損的發(fā)病機(jī)制研究進(jìn)展[J].國外醫(yī)學(xué)(兒科學(xué)分冊(cè))，2001，28(6)：290-292.

[2] 張又祥，卓美瑛，杜薇云，等.新生兒先天性心臟病的早期臨床特征[J].中國婦幼保健，2005，20(3)：339-340.

[3] 羅新錦，胡盛壽.國內(nèi)先天性心臟病流行病學(xué)調(diào)查現(xiàn)狀[A].//第九屆中國南方國際心血管病學(xué)術(shù)會(huì)議[C].2007，424-428.

[4] 曾小云，仇小強(qiáng)，李永紅，等.單純性室間隔缺損血清標(biāo)志蛋白的篩選[J].實(shí)用預(yù)防醫(yī)學(xué)，2007，14(5)：1365-1367.

[5] 周達(dá)新，葛均波，陳灝珠，等.室間隔缺損封堵治療的療效和安全性[J].中華心血管病雜志，2003，31(5)：330-333.

[6] Oceguera LF,Patiris PJ,Chiles RE,et a1.Flavivirus serology by Western blot analysis[J].Am J Trop Med Hyg,2007,77(1):159-163.

[7] Schellings MW,Vanhoutte D,Swinnen M,et al.Absence of SPARC results in increased cardiac rupture and dysfunction after acute myocardial infarction[J].J Exp Med,2009,206(1):113-123.

[8] 惠增騫，仇小強(qiáng).室間隔缺損病因和致病機(jī)理的研究現(xiàn)狀及展望[J].實(shí)用預(yù)防醫(yī)學(xué)，2010，17(11)：2332-2334.

[9] 惠增騫.室間隔缺損血清標(biāo)志蛋白質(zhì)的篩查和鑒定研究[D].廣西：桂林醫(yī)學(xué)院，2011.

[10] 周亮.人類鋅指蛋白新基因的研究[D].湖南：湖南師范大學(xué)，2003.

[11] 趙玉蓮.人類心臟發(fā)育相關(guān)的三個(gè)候選基因的克隆和功能研究[D].湖南：湖南師范大學(xué)，2006.

[12] Takahashi M,Nagaretani H,Funahashi T,et al.The expression of SPARC in adipose tissue and its increased plasma concentration in patients with coronary artery disease[J].Obes Res,2001,9(7):388-393.

[13] 惠增騫，仇小強(qiáng)，曾小云，等.室間隔缺損血清標(biāo)志蛋白質(zhì)篩查和鑒定[J].中國公共衛(wèi)生，2011，27(4)：487-488.

[14] Fu M,Li RX,Fan L,et al.Sarcoplasmic reticulum Ca2+release channel ryanodine receptor (RyR2) plays a crucial role in aconitine-induced arrhythmias[J].Biochem Pharmacol,2008,75(11):2147-2156.

(編校：吳茜)

Effect of aconitine on serum zinc finger protein 41 and SPARC in ventricular septal defect model rats

YU Cheng

(Department of Heart Surgery, People’s Hospital of Hainan Province, Haikou 57031, China)

ObjectiveTo explore the effect of aconitine on serum zinc finger protein 41 and secreted protein acidic and rich in cysteine in ventricular septal defect model rats.Methods80 ventricular septal defect model rats were randomly divided into two groups, experimental group (n=40) were treated with 0.05 mg/kg aconitine via tail vein injection for 7 consecutive days; control group (n=40) were treated with normal saline via tail vein injection for 7 consecutive days. Then, the abdominal aorta blood of each rat was collected, and the contents of zinc finger protein 41 and SPARC in two groups were detected by Western blot and ELISA method,seperately.ResultsWestern blot results showed that the expression of zinc finger protein 41 and SPARC in serum samples of experimental group were significantly lower than that of control group(P<0.05). ELISA results showed that the contents of zinc finger protein 41 and SPARC of experimental group was significantly lower than that of control group(P<0.05), respectively.ConclusionAconitine can decrease the expression of serum zinc finger protein 41 and SPARC in ventricular septal defect model rat.

aconitine;ventricular septal defect;zinc finger protein 41;secreted protein acidic and rich in cysteine

余成，男，碩士，主治醫(yī)師，研究方向：心臟外科，E-mail：yuchen292@163.com。

R541.1

A

1005-1678(2015)03-0042-03