沙利度胺對(duì)急性白血病患者外周血調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的影響及其臨床療效評(píng)價(jià)

夏軼姿，朱寶玲，湯魯明，邢超，陳慧，邵美娟

(1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 急診科，浙江 溫州 325027；2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 血液科，浙江 溫州 325027；3.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 檢驗(yàn)科，浙江 溫州 325027)

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沙利度胺對(duì)急性白血病患者外周血調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的影響及其臨床療效評(píng)價(jià)

夏軼姿1Δ，朱寶玲2，湯魯明1，邢超3，陳慧3，邵美娟3

(1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 急診科，浙江 溫州 325027；2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 血液科，浙江 溫州 325027；3.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 檢驗(yàn)科，浙江 溫州 325027)

目的 評(píng)定沙利度胺(thalidomide)對(duì)急性髓細(xì)胞白血病(acute myelocytic leukemia，AML)患者CD4+CD25+T淋巴細(xì)胞的影響及其臨床療效。方法 將71例AML患者隨機(jī)分為常規(guī)化療方案對(duì)照組(37例)和沙利度胺加常規(guī)化療方案治療組(34例)，另有31例健康者納入正常組。治療組和對(duì)照組患者均接受相同化療方案，其中治療組加用沙利度胺。分別檢測治療前、第二療程化療結(jié)束后10～14d、完全緩解后隨訪6個(gè)月或隨訪過程中復(fù)發(fā)時(shí)血清CD4+CD25+T淋巴細(xì)胞、CD3+T淋巴細(xì)胞、CD4+T淋巴細(xì)胞、CD8+T淋巴細(xì)胞、CD4+/CD8+比值、NK細(xì)胞水平，正常組于對(duì)應(yīng)化療前及化療結(jié)束后10～14d檢測相同指標(biāo)。觀察治療組和對(duì)照組患者臨床療效。結(jié)果 治療組有效緩解率較對(duì)照組高(P<0.05)；治療組和對(duì)照組患者治療前CD4+CD25+T淋巴細(xì)胞水平均明顯高于正常組(P<0.05)，治療后2組均下降(P<0.05)；與對(duì)照組相比，治療組CD4+CD25+T淋巴細(xì)胞水平明顯降低(P<0.05)。加用沙利度胺治療后，治療組在CD3+T淋巴細(xì)胞、CD4+T淋巴細(xì)胞、CD4+/CD8+比值、NK細(xì)胞水平均明顯高于對(duì)照組(P<0.05)。結(jié)論 沙利度胺可改善AML患者細(xì)胞免疫功能和提高臨床緩解有效率，機(jī)制與下調(diào)CD4+CD25+T淋巴細(xì)胞水平相關(guān)。

沙利度胺；急性髓細(xì)胞白血??；CD4+CD25+T淋巴細(xì)胞；腫瘤免疫

急性髓細(xì)胞白血病(acute myelocytic leukemia，AML)是造血系統(tǒng)非淋巴細(xì)胞的惡性腫瘤，多數(shù)患者經(jīng)過正規(guī)治療后仍殘存部分白血病細(xì)胞(minimal residual disease，MRD)，此時(shí)自身的免疫系統(tǒng)在清除MRD的過程中發(fā)揮重要作用。CD4+CD25+T淋巴細(xì)胞(CD4+CD25+Treg)是近年來鑒定的一種新型免疫抑制細(xì)胞，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)AML患者外周血中 CD4+CD25+Treg比例明顯高于正常人，并推測CD4+CD25+Treg在AML發(fā)生發(fā)展中起到一定作用[1-3]。沙利度胺(thalidomide)作為一種合成的谷氨酸衍生物，具有免疫調(diào)節(jié)、抗炎及抗血管生成等重要作用[4-5]。研究認(rèn)為沙利度胺可以通過調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)、抑制炎癥反應(yīng)等方式對(duì)血液系統(tǒng)腫瘤有一定的療效[6-7]。本研究擬通過觀察沙利度胺對(duì)AML患者的免疫功能的調(diào)節(jié)并進(jìn)一步探索沙利度胺的作用機(jī)制，為探索AML的免疫調(diào)理治療提供新思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2011年6月至2014年6月溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院血液科新發(fā)、復(fù)發(fā)或難治的AML病患者71例，其中年齡51～67歲，平均(56.1±8.1)歲；男性43例，女性28例。按照FAB分型(法國、美國和英國)三國血細(xì)胞形態(tài)學(xué)專家討論、制訂了關(guān)于急性白血病的分型診斷標(biāo)準(zhǔn)，簡稱“FAB”分型，M1型7例，M2型12例，M3型27例，M4型21例，M5型4例。所有患者的診斷均根據(jù)臨床、細(xì)胞形態(tài)學(xué)、病理、免疫學(xué)資料及遺傳學(xué)檢查做出診斷。按隨機(jī)化數(shù)字表原則，入科后疾病診斷符合AML診斷標(biāo)準(zhǔn)后立刻納入研究，按照患者入住血液科日期分為治療組(34例)與對(duì)照組(37例)。治療組男性22例，女性12例，年齡50～66歲，平均年齡(56.0±7.4)歲，M1型3例，M2型6例，M3型11例，M4型12例，M5型2例。對(duì)照組男性21例，女性16例，年齡51～67歲，平均年齡(56.2±7.8)歲，M1型4例，M2型6例，M3型16例，M4型9例，M5型2例。選取同期本院健康體檢患者30例，男性15例，女性15例，年齡50～67歲，平均(55.1±7.9)歲。治療組與對(duì)照組一般資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有可比性。排除伴有其他惡性腫瘤、嚴(yán)重肝腎功能不全、嚴(yán)重代謝性疾病及治療不配合患者。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 治療方法：所有患者按照隨機(jī)化原則分為治療組(34例)和對(duì)照組(37例)，治療組確診后立即進(jìn)行常規(guī)化療方案并開始服用沙利度胺片(常州制藥廠有限公司，國藥準(zhǔn)字H32026129)，起始劑量從50 mg/d，1周后可加量至100 mg/d，若病人無不能耐受的毒副作用，在加量至200 mg/d后一直服用至全部化療結(jié)束。對(duì)照組化療方案同實(shí)驗(yàn)組，但無沙利度胺。正常組不做藥物處理。

1.2.2 樣品采集：根據(jù)張之南《血液病療效及診斷標(biāo)準(zhǔn)》[8]，將白血病分為完全緩解，部分緩解，未緩解。完全緩解：白血病的癥狀、體征消失；血象和骨髓象基本正常，中性粒細(xì)胞絕對(duì)值≥1.5×109/L，血小板≥100×109/L，外周血分類中無白血病細(xì)胞；骨髓象原始、幼稚白血病細(xì)胞≤5%，紅系、巨核系正常。部分緩解：骨髓中原始細(xì)胞為5%～20%，外周血標(biāo)準(zhǔn)同CR。未緩解(NR)：骨髓中原始細(xì)胞≥20%。

1.2.3 外周血CD4+CD25+Treg水平測定：2組患者于治療前(T1)、第二療程化療結(jié)束后10～14 d(T2)、完全緩解后隨訪6個(gè)月或隨訪過程中復(fù)發(fā)時(shí)(T3)，分別抽取外周血；正常組于治療組和對(duì)照組化療前及化療結(jié)束后10～14 d(T2)對(duì)應(yīng)時(shí)間抽取外周血，乙二胺四乙酸二鉀抗凝。取50 μL血液標(biāo)本，每管中加入10 μLCD4-FITC、5 μLCD25-PE、10 μLCD127-PECy5后混勻，室溫避光孵育30 min，加1 mL細(xì)胞裂解液混勻，PBS洗滌2次，低速離心5 min，去上清液后加入200 μL PBS液，重懸后用Handyem流式細(xì)胞儀(北京四正柏生物科技有限公司)進(jìn)行檢測。

1.2.4 外周血CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞及NK細(xì)胞的檢測：抽取患者空腹血2 mL，肝素抗凝。直接免疫熒光標(biāo)記法，100 μL全血CD3-FITC/CDl6CD56PE熒光雙標(biāo)記單克隆抗體放入試管中，混勻后室溫避光放置30 min，低速離心5 min棄去上清液，PBS洗滌后上機(jī)檢測(DF-100熒光光譜儀，上海仁特檢測儀器有限公司)。

2 結(jié)果

2.1 臨床療效比較 71例患者均于第二療程化療結(jié)束后10～14 d后評(píng)價(jià)療效，治療組有效病例繼續(xù)口服沙利度胺。治療組中，完全緩解28例，部分緩解4例，未緩解2例，有效率94.12%。對(duì)照組中，完全緩解25例，部分緩解3例，未緩解9例，有效率75.68%。2組間療效差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.603，P<0.05)。

2.2 各組患者外周血CD4+CD25+Treg水平比較 治療前2組患者CD4+CD25+Treg水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但均高于正常組(P<0.05)；治療后2組患者CD4+CD25+Treg水平較治療前均降低，但仍高于正常組(P<0.05)，其中治療組CD4+CD25+Treg水平明顯低于對(duì)照組(P<0.05)。見表1。

表1 3組患者不同時(shí)間點(diǎn)CD4+ CD25+ Treg細(xì)胞的比較Tab.1 Comparison of CD4+ CD25+ Treg in serum of different point of three groups(±s)

#P<0.05，與同組治療前比較，compared with the same group pre-treatment；*P<0.05，與對(duì)照組同期比較，compared with control group same period

2.3 各組患者外周血T淋巴細(xì)胞亞群及NK細(xì)胞水平比較 患者治療前CD3+、CD4+、NK細(xì)胞比例及CD4/CD8比值較正常組明顯偏低(P<0.05)；CD8+較正常人升高(P<0.05)。2組患者治療后CD3+、CD4+、NK細(xì)胞比例及CD4/CD8比值較治療前明顯升高(P<0.05)；CD8+治療前后無顯著變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與對(duì)照組治療后相比，治療組患者CD3+、CD4+、NK細(xì)胞比例及CD4+/CD8+比值明顯升高(P<0.05)；CD8+無明顯變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表2。

表2 3組患者不同時(shí)間點(diǎn)血清T淋巴細(xì)胞亞群及NK細(xì)胞的比較

#P<0.05，與同組治療前比較，compared with the same group pre-treatment；*P<0.05，與對(duì)照組同期比較，compared with control group same period

3 討論

AML的微環(huán)境具有免疫抑制性和抗細(xì)胞凋亡的特性，而其中的免疫抑制性又包括免疫細(xì)胞和免疫分子[9]。自身免疫系統(tǒng)能夠積極對(duì)抗白血病細(xì)胞，對(duì)免疫系統(tǒng)進(jìn)行調(diào)節(jié)可能提高腫瘤患者的生存率[10]。闡明自身免疫的作用機(jī)制，對(duì)于提出新的腫瘤治療方案以及進(jìn)一步探討腫瘤發(fā)生發(fā)展規(guī)律具有非常重要的意義。

本研究采用隨機(jī)對(duì)照臨床研究，觀察沙利度胺對(duì)AML患者免疫功能及預(yù)后的影響。研究結(jié)果提示，2組AML患者治療后，T淋巴細(xì)胞亞群及NK細(xì)胞水平均治療前有升高(P<0.05)，研究組升高程度大于對(duì)照組(P<0.05)，提示隨時(shí)間延長，2組患者自身免疫功能改善，而研究組改善明顯，提示沙利度胺能促進(jìn)T淋巴細(xì)胞亞群及NK細(xì)胞水平重新達(dá)到平衡，使機(jī)體免疫狀態(tài)得到改善，進(jìn)一步說明，沙利度胺對(duì)AML患者抑制狀態(tài)的免疫功能起到調(diào)節(jié)作用。此外，2組患者有效緩解率相比，研究組明顯優(yōu)于對(duì)照組(P<0.05)，提示沙利度胺聯(lián)合常規(guī)化療能改善AML患者預(yù)后。

CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞(CD4+CD25+Treg)具有免疫無能性及免疫抑制性，可以抑制效應(yīng)性CD4+細(xì)胞、CTL和NK細(xì)胞，在腫瘤免疫逃逸和抗腫瘤免疫中起著重要的作用。國外研究中發(fā)現(xiàn)血AML患者外周血CD4+CD25+Treg比例明顯升高，其升高程度與病程及預(yù)后呈正相關(guān)[11]。此外，Zhou[12]等發(fā)現(xiàn)在鼠類AML模型中降低CD4+CD25+Treg水平可以提高T細(xì)胞亞群在體外的功能，且有利于提高療效。本研究中治療組和對(duì)照組患者CD4+CD25+Treg比例明顯高于正常組(P<0.05)。經(jīng)沙利度胺之后，治療組患者CD4+CD25+Treg比例較對(duì)照組明顯下降，提示沙利度胺可以下調(diào)患者CD4+CD25+Treg的表達(dá)并解除AML患者的免疫抑制狀態(tài)，阻止腫瘤細(xì)胞的逃逸。

本研究表明沙利度胺聯(lián)合化療可提高AML的緩解率，其主要通過下調(diào)CD4+CD25+Treg水平，改善其它免疫細(xì)胞功能從而發(fā)揮其抗AML作用，同時(shí)這一結(jié)果為尋找新的治療AML的途徑奠定了理論基礎(chǔ)，抑制CD4+CD25+Treg的功能可為AML的治療開辟新的途徑。

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(編校：譚玲)

Effect of thalidomide on peripheral blood regulatory T cells and evaluation of its clinical effect in patients with acute myelocytic leukemia

XIA Yi-zi1Δ, ZHU Bao-ling2, TANG Lu-ming1, XING Chao3, CHEN Hui3, SHAO Mei-juan3

(1.Department of Emergency,The Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wezhou 325027, China;2.Department of Hematology,The Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wezhou 325027, China;3.Department of Laboratory, The Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wezhou 325027, China)

ObjectiveTo evaluate of impact of thalidomide on CD4+CD25+T lymphocytes in patients with acute myeloid leukemia and its clinical curative effect.Methods71 cases of patients with AML were randomly divided into the control group and the experiment group, and 31 healthy people were selected to be the normal group. The experiment group and the control group patients were treated with the same chemotherapy, the experiment group was treated with thalidomide. The levels of CD4+CD25+T lymphocyte, CD3+T lymphocyte, CD4+T lymphocyte, CD8+T lymphocyte, ratio of CD4+/CD8+and NK cells were detected at before treatment, 10 to 14d after treatment, complete remission 6 months follow-up. In normal group, the same index was detected before and after chemotherapy, and 10-14 d. The clinical curative effect of the experiment group and the control group were observed.ResultsThe effective rate of the experiment group was higher than of the control group(P< 0.05); The levels of CD4+CD25+T lymphocyte in the experiment group and control group were significantly higher than in the normal group(P< 0.05), the two groups decreased compared with the control group, the level of CD4+CD25+T lymphocyte in the experiment group was significantly decreased(P< 0.05). And with thalidomide treatment, the experiment group in the CD3+T lymphocytes, CD4+T lymphocytes and ratio of CD4+/CD8+, NK cells were significantly higher than the control group(P< 0.05).ConclusionThalidomide can improve both the immunity cell function and the clinical efficiency in patients with AML. The mechanism is related to reduce the level of CD4+CD25+T lymphocyte.

thalidomide; acute myeloid leukemia; CD4+CD25+T lymphocyte; tumor immunity

2012年度溫州市科技計(jì)劃項(xiàng)目(Y20120051)

夏軼姿，通信作者，女，本科，主治醫(yī)師，研究方向：血液腫瘤學(xué)，E-mail：wenzhouxiayizi@163.com。

R552

A

1005-1678(2015)11-0061-03