槲皮素對宮頸癌裸鼠模型腫瘤生長及其對乙酰肝素酶表達的關系研究

魏瑋，劉婷，丁波，曹樹穩(wěn)

(1.江西省宜春職業(yè)技術學院 醫(yī)學院，江西 宜春 336000；2.江西省宜春職業(yè)技術學院附屬醫(yī)院藥學教研室，江西 宜春 336000；3.南昌大學 生命科學學院，江西 南昌 330000)

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槲皮素對宮頸癌裸鼠模型腫瘤生長及其對乙酰肝素酶表達的關系研究

魏瑋1Δ，劉婷1，丁波2，曹樹穩(wěn)3

(1.江西省宜春職業(yè)技術學院 醫(yī)學院，江西 宜春 336000；2.江西省宜春職業(yè)技術學院附屬醫(yī)院藥學教研室，江西 宜春 336000；3.南昌大學 生命科學學院，江西 南昌 330000)

目的 研究槲皮素對宮頸癌生長的作用，及其對乙酰肝素酶表達的關系，初步探討槲皮素抑制宮頸癌作用的可能機制。方法 建立宮頸癌裸鼠模型，將植瘤成功的30只裸鼠進行如下隨機分組：25 mg/kg槲皮素組、50 mg/kg槲皮素組、100 mg/kg槲皮素組和PI-88陽性對照組及空白對照組；觀察各組透射電鏡下血管內(nèi)皮細胞超微結(jié)構(gòu)的變化；以Western blot蛋白免疫印記技術檢測癌瘤中乙酰肝素酶蛋白質(zhì)水平改變，將空白組做為灰度參照，計算出各組間相對灰度值，進行統(tǒng)計學分析。結(jié)果 50 mg/kg、100 mg/kg槲皮素組及PI-88組較空白組中宮頸癌生長體積小(P<0.05)；50 mg/kg組可見腫瘤組織中血管內(nèi)皮細胞和線粒體腫脹等改變，100 mg/kg組可見膜性結(jié)構(gòu)的消失及胞質(zhì)邊集等改變，PI-88組可見管腔閉鎖，液泡狀滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和死亡的細胞；50 mg/kg組和100 mg/kg組宮頸癌植瘤瘤體組織中乙酰肝素酶表達較空白對照組減少(P<0.05)，PI-88組較50 mg/kg組和100 mg/kg組乙酰肝素酶表達減少(P<0.01)，而25 mg/kg組較空白對照組差異無統(tǒng)計學意義。結(jié)論 50、100 mg/kg槲皮素可抑制宮頸癌細胞生長，其可導致宮頸癌植瘤瘤體內(nèi)血管內(nèi)皮細胞細胞超微結(jié)構(gòu)的改變。槲皮素對宮頸癌的抑制作用可能與降低乙酰肝素酶蛋白表達有關。

槲皮素；乙酰肝素酶；宮頸癌

宮頸癌(cervical cancer)是最常見的婦科惡性腫瘤之一，嚴重威脅著婦女的健康，每年約有51萬例新發(fā)病例，每2分鐘就有1例宮頸癌發(fā)生[1]。更加值得注意的是，宮頸癌死亡率高，其主要原因是腫瘤的高生長性、高復發(fā)性、高轉(zhuǎn)移性[2]。因此，如何抑制腫瘤生長、復發(fā)和轉(zhuǎn)移，降低死亡率，延長患者的無病生存期，提高其生活質(zhì)量是當下需要解決的關鍵問題[3]。然而，目前腫瘤的治療藥物其不良反應較大，療效有限，研制低毒性、高療效的抗癌活性成分已成為國內(nèi)外學者研究癌癥治療的熱點。硫酸化寡聚多糖(PI-88)為近年研究的熱點腫瘤抑制劑之一，在體外小鼠試驗中發(fā)現(xiàn)該腫瘤抑制劑具有抑制乙酰肝素酶表達的作用[4]。本研究分析槲皮素對宮頸癌生長的作用及其對乙酰肝素酶表達的關系，初步探討槲皮素抑制宮頸癌作用的可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 細胞系：HeLa細胞系(上海信裕生物科技有限公司)。

1.1.2 實驗動物：30只健康 BALB/c/nu 雌性裸鼠，6～8周齡，體質(zhì)量18～20 g(北京維通利華實驗動物技術有限公司，合格證號：SCXK京2012 -0001)；飼養(yǎng)于SPF 級屏障系統(tǒng)的潔凈層流架內(nèi)，室溫在 25 ℃，相對濕度40% ～60%。

1.1.3 主要藥品與試劑：槲皮素(Sigma公司，貨號CAS6151-25-3)；1RPMI-1640培養(yǎng)基(美國Invitrogen公司)；胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)；胰蛋白酶(美國Invitrogen公司)；青鏈霉素(美國Invitrogen公司)；HPA抗體(美國Santa Cruz公司)；Actin抗體(美國Santa Cruz公司)；PI-8(澳大利亞Progen公司)；無水乙醇，國產(chǎn)分析純；NC膜(美國Millipore公司)；預染蛋白，Marker(美國Fermentas公司)；辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗(美國Pierce公司)；Co-tail抑制劑(美國Roche公司)；PBS干粉(武漢博士徳公司)。

1.1.4 實驗儀器：倒置顯微鏡(香港先達分析儀器有限公司，型號：XD50R)；電子天平(鄭州萬博儀器設備有限公司，型號：HZX-JA100)；凝膠成像分析系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)；725N紫外可見分光光度計(上海精密儀器設備廠)；Elix純水系統(tǒng)(美國Millipore公司)；Platiunm 500超低溫冰箱，(意大利MASSA MARTANA公司)； 1200EX透射電子顯微鏡(日本電子株式會社)。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)：宮頸癌HeLa細胞生長于含有10%小牛血清及100 μg/mL的青鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液中，置于37 ℃、5%CO2、95%飽和濕度條件下的恒溫密閉培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。每天仔細觀察所培養(yǎng)的細胞，觀測是否有污染或發(fā)生細胞變性等，一經(jīng)發(fā)現(xiàn)立即丟棄。當培養(yǎng)液顏色由紅色轉(zhuǎn)為黃色時或細胞密度較大時，更換培養(yǎng)液。一般2～3天更換一次。

1.2.2 不同槲皮素濃度的配制方法：槲皮素(Sigma 公司，貨號 CAS6151- 25- 3)，加入0. 3 g的槲皮素至離心管，加入DMSO至10cc，振動至溶解，濃度為 0.1 mol/L(貯備原液)，分裝各1 mL至ependorf避光小管中，于-20 ℃冰箱保存。

1.2.3 構(gòu)建裸鼠模型：將30只6～8周，體重量約18～20 g的BALB/c雌性裸鼠隨機分成5組，分別為空白對照組、25 mg/kg槲皮素組、50 mg/kg槲皮素組、100 mg/kg槲皮素組及PI-88陽性對照組。在每只裸鼠的右后肢背部皮下注入1×106/mL HeLa細胞，6 d后，可見每只裸鼠腫瘤細胞注射部位都長出米粒大小的腫塊，第7天起，分別對5組裸鼠注射100 μL 90%玉米油+10%的乙醇、25 mg/kg槲皮素、50 mg/kg槲皮素、100 mg/kg槲皮素及20 mg/kg的PI-88，共注射15 d。

1.2.4 測定腫瘤生長：給藥第6天起，每3天用游標卡尺測量瘤塊的的長徑和短徑，直至第15天，并計算瘤塊的體積。體積公式為V =π/ 6LW2(L為長徑，W為短徑)。

1.2.5 腫瘤標本處理：透射電鏡將取下來的腫塊浸沒在冷2.5%戊二醛中固定，再以1%餓酸固定(pH 7.2)，梯度乙醇脫水，Epon812包埋后切片，選取銀灰色的超薄切片，用醋酸雙氧鈾-檸檬酸鉛雙染色后在透射電子顯微鏡(10萬倍)下觀察并照相。

1.2.6 Western blot檢測：①清洗玻璃板然后用去離子雙蒸水沖洗3次后，放入烘箱中烤干；②配制12%分離膠；③去除無水乙醇；④配制5%濃縮膠；⑤注入濃縮膠后，應立即插入梳子；⑥取制備好的蛋白樣本，根據(jù)所需蛋白總質(zhì)量上樣；⑦SDS- PAGE 電泳：在電泳槽內(nèi)加入1×電泳緩沖液，先使用恒定電壓70 V，進行Western blot檢測。

凝膠圖象分析：將Actin蛋白表達水平作為內(nèi)參照，將各組與Actin進行比較，保證各組蛋白加樣量相等。用凝膠圖象處理系統(tǒng)對膠片進行成像，分析各組別樣本灰度值和相應Actin蛋白灰度。以各樣本灰度值與Actin蛋白灰度值求比后，與對照組灰度值進行比較，求得相對灰度值，進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果

2.1 槲皮素抑制腫瘤生長 給藥后第6、9、12、15天，25 mg/kg槲皮素組與空白對照組相比，腫瘤體積差異無統(tǒng)計學意義。而50、100 mg/kg槲皮素組及PI-88陽性對照組的腫瘤體積顯著減小(P<0.01)。而從第9 天開始到第12、15天，50、100 mg/kg槲皮素組及PI-88組與25 mg/kg 槲皮素組進行比較，腫瘤體積明顯減少(P<0.05)；結(jié)果提示50、100 mg/kg槲皮素可以抑制宮頸癌植瘤瘤體的生長。在給藥后的第9、12、15天期間，與PI-88陽性對照組比較，50 mg/kg槲皮素組數(shù)據(jù)有統(tǒng)計學意義 (P<0.05)。值得注意的是，100 mg/kg組與PI-88比較，差異無統(tǒng)計學意義，提示PI-88組與100 mg/kg槲皮素組對宮頸癌生長的可能存在類似抑制效果。隨著槲皮素作用時間的增加，50、100 mg/kg槲皮素抑制宮頸癌組織的抑制作用更為明顯。見表1。

表1 各組裸鼠腫瘤體積大小測定

*P<0.05，與空白對照組相比，compared with blank control group；#P<0.05，與PI-88 組比較，compared with PI-88 positive control group；ΔP<0.05，與25 mg/kg槲皮素組比較，compared with 25 mg/kg quercetin group

圖1 各組裸鼠腫瘤生長曲線(n=6)Fig.1 Nude mice tumor growth curve(n=6)

2.2 槲皮素導致血管內(nèi)皮細胞超微結(jié)構(gòu)的變化 結(jié)果顯示，槲皮素可導致裸鼠宮頸癌植瘤瘤體血管內(nèi)皮細胞超微結(jié)構(gòu)的變化，這種變化與槲皮素的劑量呈相關性(見圖1)。25 mg/kg 槲皮素組中血管內(nèi)皮細胞無顯著變化。但在50 mg/kg 槲皮素組中，可以觀察到血管內(nèi)皮細胞和線粒體的腫脹，核糖體、滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、一些膜性結(jié)構(gòu)的消失、變形的紅細胞和細胞間連接的分解。在100 mg/kg 槲皮素組中，可以發(fā)現(xiàn)膜結(jié)構(gòu)、細胞器的消失和細胞質(zhì)的邊集。而在PI-88組中，在瘤體組織中可觀察到血管管腔發(fā)生閉鎖，空泡樣滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及其周邊的死亡細胞，見圖2。由圖2中可知，50 mg/kg 槲皮素可引起內(nèi)皮細胞腫脹，而100 mg/kg 槲皮素可導致血管內(nèi)皮細胞的退化，同時PI-88可以導致管腔閉鎖。

圖2 電鏡下血管內(nèi)皮細胞超微結(jié)構(gòu)的變化(×10萬)Fig.2 Changes of the ultrastructure of vascular endothelia cells under electron microscope(×10萬)

2.3 槲皮素導致宮頸癌中乙酰肝素酶蛋白表達下降 乙酰肝素酶多克隆抗體有2種亞型，活性亞型(50 kDa)和非活性亞型(65 kDa)。用Western blot 檢測宮頸癌裸鼠瘤體組織中乙酰肝素酶蛋白的表達，宮頸癌腫瘤組織中活性亞型和非活性亞型的乙酰肝素酶均有表達，且HeLa細胞系中非活性亞型表達量較活性亞型表達量高。見圖3、表2。

圖3 Western blot檢測各組移植瘤乙酰肝素酶蛋白的表達Fig.3 Expression of transplantation tumor of heparanase by Western blot

對條帶進行灰度分析并繪制相對灰度柱狀圖，見表2。由表2可知，發(fā)現(xiàn)在非活性亞型中：與空白對照組相比，25 mg/kg 槲皮素組的表達量無顯著性差異；而50、100 mg/kg槲皮素組、PI-88陽性對照組的表達量明顯減少(P<0.01)； 與PI-88 陽性對照組相比，25、50、100 mg/kg槲皮素組的表達量明顯減少(P<0.05)。 在活性亞型中：25 mg/kg組分別與空白對照組、50 mg/kg組比較，均無顯著性差異；將25 mg/kg組分別與100 mg/kg組、PI-88組比較，發(fā)現(xiàn)差異有顯著性(P<0.01)；將50 mg/kg組、100 mg/kg 組與PI-88組進行組間比較，發(fā)現(xiàn)差異亦具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。 這些結(jié)果表明50、100 mg/kg槲皮素可以抑制宮頸癌裸鼠植瘤瘤體中乙酰肝素酶蛋白的表達。

表2 各組乙酰肝素酶蛋白表達比較Tab.2 Comparison of expression of heparanase protein of each group(±s,n=6)

*P<0.05，與空白對照組相比，compared with blank control group；#P<0.05，與PI-88 組比較，compared with PI-88 positive control group；ΔP<0.05，與25 mg/kg槲皮素組比較，compared with 25 mg/kg quercetin group

3 討論

槲皮素(quercetin)是自然界分布最廣泛的天然黃酮類物質(zhì)，其能通過抑制腫瘤細胞增殖、誘導凋亡、調(diào)節(jié)細胞周期等發(fā)揮抗腫瘤作用已被一系列實驗研究所證實[5]。Parish CR等[6]的進一步研究也發(fā)現(xiàn)：槲皮素能抑制HeLa細胞的粘附、遷移和侵襲，其抑制作用與槲皮素作用劑量呈正相關。

本研究結(jié)果顯示，50、100 mg/kg 槲皮素組及 PI-88陽性對照組與空白對照組相比較，發(fā)現(xiàn)腫瘤體積顯著縮小(P<0.01)。同時，50、100 mg/kg槲皮素組及PI-88 組與25 mg/kg槲皮素組進行比較，腫瘤體積明顯減小(P<0.05)。25 mg/kg 槲皮素組與空白對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義。結(jié)果提示50、100 mg/kg 槲皮素可以抑制宮頸癌腫瘤組織的生長。這與楊洋等[7]前期在細胞水平的研究存在相似性：槲皮素對宮頸癌細胞存在明顯抑制作用，且隨著槲皮素劑量的增加對宮頸癌細胞的抑制作用增強。

同時，本研究還顯示，給藥后第6、9、12、15天，空白對照組與25 mg/kg槲皮素組相比，均無統(tǒng)計學意義，這表明25 mg/kg濃度槲皮素對腫瘤組織的抑制作用甚微，而25 mg/kg濃度槲皮素組在電鏡下也未顯現(xiàn)形態(tài)學變化，這2者是相吻合的。而從給藥后第9天開始，50、100 mg/kg槲皮素組及PI-88組與25 mg/kg 槲皮素組及空白對照組進行比較，差異具有統(tǒng)計學意義，50 mg/kg槲皮素與PI-88陽性對照組比較,差異具有統(tǒng)計學意義，提示PI-88陽性對照組比50 mg/kg槲皮素作用強，100 mg/kg槲皮素組與PI-88陽性對照組比較，組間差異未表現(xiàn)出統(tǒng)計學意義，提示 100 mg/kg 槲皮素組與PI-88陽性對照組對腫瘤的抑制作用相似，并且隨著作用時間的延長，100 mg/kg槲皮素對宮頸癌生長的抑制作用更為明顯。PI-88是硫酸化磷酸甘露低聚糖混合物之一，由于其與乙酰肝素酶底物結(jié)構(gòu)極為類似。通過競爭性抑制的機制，PI-88可以與乙酰肝素酶相結(jié)合，降低乙酰肝素酶的活性，從而抑制腫瘤的發(fā)展[8]。而本研究中100 mg/kg槲皮素組與PI-88陽性對照組對腫瘤的抑制作用效果相似，為闡明槲皮素對宮頸癌生長抑制作用的機制提供了可能的解釋途徑。槲皮素對腫瘤組織生長的抑制作用中可能涉及到乙酰肝素酶表達量的調(diào)控，甚至有可能與PI-88有類似的對乙酰肝素酶的競爭性抑制作用，這有待進一步研究。

PI-88是硫酸化磷酸甘露低聚糖混合物之一，是目前較為公認的具有抑制乙酰肝素酶活性作用的合成物。由于其與乙酰肝素酶底物結(jié)構(gòu)極為類似，它能夠與乙酰肝素酶的反應底物相競爭，減少乙酰肝素酶與其正常底物接觸的機會，消耗組織內(nèi)部乙酰肝素酶表達量，使得乙酰肝素酶的活性下降或失活，從而達到抑制腫瘤發(fā)展的作用[9]。從研究結(jié)果可知，在給藥第 9 天開始到給藥第 15天結(jié)束期間，100 mg/kg 槲皮素組與 PI-88 陽性對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義，這表明100 mg/kg槲皮素與PI-88在總體上對腫瘤體積的抑制作用相似。介于 PI-88對乙酰肝素酶活性的競爭性抑制作用，本研究假設槲皮素對腫瘤組織生長的抑制作用中也可能涉及到對乙酰肝素酶表達量的影響，故此對乙酰肝素酶的蛋白表達進行了進一步檢測。然而，槲皮素對乙酰肝素酶的抑制作用中是否與PI-88對乙酰肝素酶的競爭性抑制作用相類似，本研究中尚未涉及，這有待進一步研究。

為了研究槲皮素注射后腫瘤組織血管內(nèi)皮細胞超微結(jié)構(gòu)是否發(fā)生變化，本研究使用透射電鏡對裸鼠植瘤瘤體組織血管內(nèi)皮細胞進行觀察。結(jié)果顯示，50 mg/kg 槲皮素組中瘤體血管內(nèi)皮細胞及線粒體腫脹，核糖體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的消失；而在100 mg/kg槲皮素組中瘤體血管內(nèi)皮細胞胞漿邊集，細胞器消失，最后在PI-88組可見管腔閉鎖及死亡的細胞。這些超微結(jié)構(gòu)的變化與細胞凋亡表現(xiàn)類似，這表明槲皮素抑制腫瘤組織生長的可能原因與介導血管內(nèi)皮細胞發(fā)生凋亡，抑制血管內(nèi)皮細胞的生成有關。而前期黃麗瓊等[10]的研究也表明，槲皮素對宮頸癌細胞的凋亡有促進作用，但其中的機制有待進一步研究。

細胞外基質(zhì)(extracellular matrixc，ECM)和基底膜(basement membrane，BM)的侵襲破壞以及新生血管的形成是腫瘤細胞擴散和轉(zhuǎn)移的重要步驟，而硫酸乙酰肝素蛋白多糖(heparan sulfate proteoglycan，HSPG)是 ECM 的主要組成部分。乙酰肝素酶(heparanase，HPA)是迄今為止在哺乳動物中發(fā)現(xiàn)的唯一一種裂解HSPG 中乙酰肝素酶硫酸鏈(heparanase sulfate chains，HS)的糖苷酸內(nèi)切酶。不同種類哺乳動物的正常細胞與腫瘤細胞 HPA 的高度同源性證實所有的哺乳動物只表達一種基因克隆的 HPA，這使HPA 作為治療的靶向目標成為可能[11]。HPA不僅能調(diào)控多種細胞生長因子和細胞因子活性，還可破壞ECM的完整性，誘導腫瘤血管生成，從而在腫瘤細胞的生長和轉(zhuǎn)移進程中發(fā)揮重要作用。研究顯示[12]，宮頸癌組織中HPA 蛋白表達水平較正常宮頸組織及宮頸上皮內(nèi)瘤變(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)中HPA 蛋白表達水平高，并且隨著宮頸癌臨床期別的增高，HPA 蛋白表達水平也逐漸增高；在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中HPA 蛋白的表達顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組。另有研究者提出[13]，乙酰肝素酶在宮頸癌中的表達可能促進了癌細胞的生長、侵襲以及血管生成，抑制該酶的活性可能具有治療宮頸癌的作用。鑒于乙酰肝素酶在腫瘤生長中起著重要的促進作用，本研究檢測了宮頸癌腫瘤組織中乙酰肝素酶蛋白的表達。結(jié)果顯示活性亞型(50 kDa)和非活性亞型(65 kDa)在腫瘤組織中均有表達，而非活性亞型表達水平較活性亞型表達水平高。這表明乙酰肝素酶蛋白與槲皮素抑制宮頸癌腫瘤細胞的生長有關。而本研究中未闡明槲皮素是直接亦或間接影響到乙酰肝素酶的表達。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)50、100 mg/kg槲皮素可以抑制宮頸癌組織的生長、影響血管內(nèi)皮細胞超微結(jié)構(gòu)，這種作用可能與降低乙酰肝素酶蛋白水平有關。這為槲皮素成為抑制宮頸癌的藥物提供了理論依據(jù)。然而，本研究僅僅說明槲皮素抑制宮頸癌與乙酰肝素酶有相關性，但其中所涉及到的確切通路仍需要進一步研究。

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(編校：王冬梅)

Study on relationship of quercetin on cervical carcinoma in nude mice model of tumor growth and the expression of heparanase

WEI Wei1Δ, LIU Ting1, DING Bo2, CAO Shu-wen3

(1. Medical School, Yichun Vocational and Technical College of Jiangxi Province, Yichun 336000, China; 2. Department of Pharmacy, Affiliated Hospital of Yichun Jiangxi Vocational and Technical College of Jiangxi Province, Yichun 336000, China; 3. College of Life Science, Nanchang University, Nanchang 330000, China)

ObjectiveTo explore effect of quercetin on growth of cervical cancer,and its relationship to expression heparanase, and to investigate the possible mechanism of the inhibition effect of quercetin on cervical cancer.MethodsHeLa cells were injected into nude mouse to establish the model of cervical cancer. 30 nude mice with palpable tumors were randomly assigned to five groups: 25,50,100 mg/kg quercetin groups,PI-88 positive group and blank control group. Transmission electron microscope was used to observe the ultrastructural changes of the vascular endothelial cells in each group. The expression of heparanase protein was detected by Western blot. Used blank control group for grey reference, relative grey value of each group was calculated for the further statistical analysis.Results50,100 mg/kg quercetin groups and group of PI - 88 made the volume of tumor tissues smaller. In 50 mg/kg quercetin group, swelling of VEC and mitochondria in tumor tissues was observed. In 100 mg/kg quercetin group, the disappearance of membraneaceous structures was found. In PI-88 positive group, the atresia of lumen, vacuole-shaped smooth endoplasmic reticulum and a dead cell were observed. 50 and 100 mg/kg quercetin groups decreased the heparanase protein levels significantly(P<0.05). Furthermore, PI-88 positive group could decrease the heparanase protein levels significantly(P<0.05), compared to 50 and 100 mg/kg quercetin groups. However, the difference between the 25 mg/kg quercetin group and blank control group showed no statistical significance.ConclusionThe growth of cervical cancer could be inhibited by 50,100 mg/kg quercetin. Meanwhile, the ultrastructural changes of tumor endothelial cells could be induced by 50,100 mg/kg quercetin. These changes may relate with the decrease of heparanase protein level.

quercetin; heparanase;cervical cancer

魏瑋，通信作者，男，碩士，講師，藥師，研究方向：藥學，E-mail：ww27w@sina.com。

R737.33

A

1005-1678(2015)11-0026-05