攜氧技術(shù)在肝移植供肝保存中的應(yīng)用

賈俊君 李建輝，2 張靜 周燕飛 周琳 鄭樹森，2

肝移植是終末期肝病最有效的治療方法，雖然心臟死亡器官捐獻(xiàn)(donation after cardiac death，DCD)、劈離式供肝等應(yīng)用擴(kuò)大了供肝來源，但相對于不斷增加的肝移植等候名單，供肝來源仍然嚴(yán)重不足［1］。供肝保存技術(shù)是保證并進(jìn)一步擴(kuò)展供肝來源的關(guān)鍵，發(fā)展供肝保存技術(shù)的關(guān)鍵是避免移植物損傷，尤其是缺血再灌注損傷(ischemic perfusion injury，IRI)。我們前期對減少供肝IRI 做了較系統(tǒng)的研究及綜述［2-3］。隨著2013 年“杭州宣言”的發(fā)布和2015 年起我國人體器官來源只能采用公民逝世后器官捐獻(xiàn)，我國供肝短缺形勢更加嚴(yán)峻，以DCD 供肝和脂肪肝為代表的擴(kuò)大標(biāo)準(zhǔn)器官捐獻(xiàn)(expand criteria donor，ECD)供器官得到越來越廣泛的應(yīng)用，并且逐漸成為主要供肝來源，但這些供肝對缺血、缺氧更加不耐受［4-5］。

目前，靜態(tài)冷保存(static cold storage，SCS)是肝移植供肝保存的金標(biāo)準(zhǔn)，機(jī)械灌注是供肝保存的新途徑，越來越受到肝移植學(xué)者的重視［6］。針對肝臟離體保存過程中是否需要額外加氧一直存在爭議，組織在深低溫的時(shí)候需氧量非常少，在0 ～4 ℃時(shí)細(xì)胞代謝活力大約降至正常的5% ～10%。部分學(xué)者認(rèn)為溶解在保存液中的氧氣已經(jīng)能夠滿足器官氧耗的需求［7］。而另一部分學(xué)者則認(rèn)為即使在0 ～4 ℃環(huán)境中，離體肝臟仍需要0.27 mol·min-1·g-1的氧氣，而SCS 并不能滿足這個(gè)氧耗需求［8］。另外，研究表明低溫機(jī)械灌注(hypothermic machine perfusion，HMP)過程中肝細(xì)胞缺少氧氣容易導(dǎo)致缺氧空泡產(chǎn)生，而在灌流液中加入氧氣該現(xiàn)象就會消除［9］。

大量研究表明，合適的氧濃度供給有利于增加抗氧化物、維持三磷酸腺苷(ATP)水平和線粒體功能，尤其對于DCD 和ECD 供肝［8，10-11］。攜氧技術(shù)對ECD 供肝顯得尤為重要，本文就攜氧技術(shù)在供肝保存中的應(yīng)用及相關(guān)機(jī)制做一綜述。

1 攜氧載體

醫(yī)用級攜氧載體一般有兩類:(1)血紅蛋白類，包括人類自身及其他物種改良的血紅蛋白;(2)人造血液，主要是指全氟化碳類物質(zhì)(perfluorocarbon，PFC)，包括全氟正辛烷、全氟三丁胺、全氟十氫萘、全氟十四氫菲以及全氟溴辛烷等。

1.1 血紅蛋白類

血紅蛋白類攜氧載體最為常用，但較為稀缺，一直都處于供不應(yīng)求狀態(tài)。目前，許多公司致力于緩解這一矛盾，將現(xiàn)有血紅蛋白進(jìn)行加工或者其他物種血紅蛋白進(jìn)行基因改造，以實(shí)現(xiàn)血制品的長時(shí)間保存和增加血紅蛋白來源，但是這些產(chǎn)品大多在臨床試驗(yàn)階段，真正用于臨床的還很少。這類產(chǎn)品簡要進(jìn)展如下(詳見表1):(1)HBOC-201，是基于牛血紅蛋白改造而來，目前已經(jīng)應(yīng)用于臨床非心臟手術(shù)患者，并取得理想效果［12］;(2)Hemopure，為牛血紅蛋白多聚體，是第1 個(gè)批準(zhǔn)用于臨床的血液代用品［13］，在大鼠DCD 供肝體外保存中效果顯著，優(yōu)于SCS［14］;最近基于Hemopure 配制的攜氧灌流液應(yīng)用于大動物肝移植過程中供肝的機(jī)械灌注，結(jié)果顯示這項(xiàng)氧合技術(shù)供肝保存效果明顯優(yōu)于SCS［15］;(3)M101，由海洋無脊椎動物的血紅蛋白改造而來，有文獻(xiàn)報(bào)道在UW 液中加入M101 可以減少大動物腎移植術(shù)后移植腎纖維化和無功能的發(fā)生［16］，隨后又有文獻(xiàn)報(bào)道M101 結(jié)合UW 液在大動物供肝保存方面優(yōu)于單獨(dú)使用UW 液［17］;(4)此外，血紅蛋白類攜氧載體還包括因?yàn)椴涣挤磻?yīng)顯著而被終止臨床試驗(yàn)的DCLHb-HemAssist 等。

表1 血紅蛋白類攜氧載體介紹

1.2 PFC

血液及血液制品存在HIV、肝炎病毒交叉感染的潛在風(fēng)險(xiǎn)［21］。由于輸血安全性問題、需血量增多以及獻(xiàn)血量減少等原因，迫使人們努力去尋找一種具有與血液功能相同的代用品。PFC 是研究最多的血液代用品，其黏度低于血液而稍高于水，溶氧能力是血液的20 ～25 倍，并且不同于血紅蛋白的溶氧曲線，PFC 遵循亨氏線性法則(Henry＇s linear law)，溫度對PFC 攜氧能力影響并不大，這一點(diǎn)使其尤其適合用于肝臟低溫保存。PFC 最初作為血液代用品用于治療急性出血和貧血，目前其用途已由單獨(dú)血液代用品逐漸擴(kuò)展為需氧治療的輔助劑，在臨床各科室均有潛在的應(yīng)用價(jià)值。PFC 的發(fā)展已歷經(jīng)半個(gè)世紀(jì)，但其臨床應(yīng)用尚非常有限。

目前開發(fā)的氟碳乳劑已有3 代:(1)第1 代氟碳乳劑為Fluosol-DA20，美國食品和藥品管理局許可用于臨床冠狀動脈血管成形術(shù)中，以增加機(jī)體氧氣供應(yīng)，臨床觀察能減少術(shù)中心臟損傷［22］;(2)第2 代氟碳乳劑為Oxygent 和Oxyfluor［23-24］，攜氧能力和穩(wěn)定性均較第1 代有所提高，半衰期24 ～48 h，室溫下可存放1 年多，不影響血液動力學(xué);目前Oxygent在美國、歐洲、加拿大已完成了Ⅲ期臨床試驗(yàn)，但結(jié)果發(fā)現(xiàn)使用Oxygent 的冠狀動脈旁路移植術(shù)患者腦血管事件發(fā)生率升高，試驗(yàn)因此而停止;近期俄羅斯獲準(zhǔn)氟碳類產(chǎn)品Perftoran 為醫(yī)用［25］，其主要成分為氟萘烷和氟甲基一環(huán)己基哌啶;(3)第3 代產(chǎn)品正處在臨床前期開發(fā)階段［26］。詳見表2。

PFC 產(chǎn)品也有一些缺點(diǎn)和不良反應(yīng)［22］:(1)PFC是一種氧溶解劑，必須使用高濃度氧氣(70% ～100%)才能提供足夠的氧氣溶解量;(2)循環(huán)時(shí)間短，使用高濃度(70% ～100%)PFC 可致血黏度升高;(3)流感樣癥狀，輸入時(shí)可出現(xiàn)急性和短暫的面色潮紅、背痛，隨之發(fā)熱和寒戰(zhàn);(4)激活補(bǔ)體系統(tǒng)和吞噬細(xì)胞(第1 代明顯，第2 代產(chǎn)品中尚未發(fā)現(xiàn))，大劑量PFC 可導(dǎo)致肝淤血和短暫的免疫防御功能受損。

表2 全氟化碳類物質(zhì)攜氧載體介紹

2 攜氧方式

2.1 靜脈系統(tǒng)吹氧

最簡單的供氧方式是直接通過靜脈系統(tǒng)向供肝吹入氧氣(venous systemic oxygen persufflation，VSOP)。這種方法一般將肝臟浸沒于冷保存液中，通過肝上下腔靜脈置管接入氧氣，肝下下腔靜脈端暫時(shí)結(jié)扎。利用氧氣進(jìn)入靜脈產(chǎn)生壓力，竇后型小靜脈擴(kuò)張，用27 G 小注射器刺破這些小靜脈釋放氧氣［35］。有兩項(xiàng)大鼠實(shí)驗(yàn)研究證明VSOP 相比于其他供氧方式可以改善肝功能，降低肝酶水平，減少組織壞死、線粒體產(chǎn)生的凋亡，并且可以減少內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激［36-37］，臨床試驗(yàn)也證實(shí)VSOP 可以保護(hù)供肝結(jié)構(gòu)及功能［38-39］。

2.2 氧合器灌流液氧合

最常見的氧合方式是通過氧合器在灌流液中進(jìn)行氧合。根據(jù)氧合器不同又可以分為鼓泡式氧合器和膜式氧合器。一般認(rèn)為膜式氧合較鼓泡式氧合更適用于臨床，因?yàn)楣呐菔窖鹾先菀桩a(chǎn)生氣泡導(dǎo)致氣栓形成。此外，如果用紅細(xì)胞作為攜氧物質(zhì)，鼓泡式氧合容易造成紅細(xì)胞破壞繼而引發(fā)溶血。

2.3 PFC 單層法和雙層法

PFC 為親脂性物質(zhì)，不溶于血液、水及其他介質(zhì)，密度高，表面張力低，因此有其特殊的攜氧方式，學(xué)術(shù)上分為雙層法和單層法:(1)雙層法最常用，應(yīng)用這種方法的器官保存液由兩層組成，上層為常用器官保存液(如UW 液)，下層為PFC，器官置于雙層液體之間，通過不斷給下層PFC 補(bǔ)充氧氣，使氧氣能夠彌散進(jìn)入器官;已有多個(gè)移植中心采用雙層法保存胰腺［40-41］，肝移植領(lǐng)域也有零星報(bào)道［42］;(2)單層法，顧名思義就是將整個(gè)器官置于PFC 中保存，動物實(shí)驗(yàn)表明單層法更有利于器官的保存，尤其是胰腺、胰島保存［43-44］;單層法用于肝臟保存還未見報(bào)道。

3 攜氧技術(shù)相關(guān)機(jī)制和應(yīng)用

氧是ATP 產(chǎn)生的必需物質(zhì)，是細(xì)胞活動的驅(qū)動因素。在肝臟獲取的過程中，血流一旦阻斷，氧氣和營養(yǎng)等物質(zhì)就停止供應(yīng)，ATP 持續(xù)消耗導(dǎo)致鈉鉀泵失功、細(xì)胞內(nèi)外電解質(zhì)濃度差消失，繼而引起細(xì)胞水腫、鈣離子內(nèi)流、磷酸酶活化，最終導(dǎo)致炎癥產(chǎn)生和細(xì)胞死亡［45］。隨著缺氧的持續(xù)，在缺血、缺氧的環(huán)境下，黃嘌呤脫氫酶轉(zhuǎn)化為黃嘌呤氧化酶，而黃嘌呤氧化酶在再灌注階段氧氣存在時(shí)，將堆積的酸性產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為黃嘌呤、次黃嘌呤及活性氧自由基，引起脂質(zhì)過氧化甚至細(xì)胞破壞［46］。對于DCD 供肝，在供肝血流阻斷與肝臟灌洗之間有額外的熱缺血時(shí)間，導(dǎo)致更加嚴(yán)重的ATP 消耗和更長時(shí)間的缺血、缺氧。

過多的活性氧(reactive oxygen species，ROS)是IRI 的核心環(huán)節(jié)，主要包括O2-、H2O2及脂質(zhì)過氧化自由基(ROO-)等。適量的ROS 作為體內(nèi)第二信使，能夠調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子活化、細(xì)胞生長、凋亡及粘附等生理過程［47］。嚴(yán)重缺氧條件下，導(dǎo)致大量的ATP被消耗殆盡，大量的次黃嘌呤在缺氧組織中不斷積累;與此同時(shí)，內(nèi)源性抗氧化劑如超氧化物歧化酶被大量消耗，積累的次黃嘌呤氧化酶催化產(chǎn)生大量ROS。另外，Kupffer 細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的激活、細(xì)胞色素系統(tǒng)功能的失調(diào)以及兒茶酚胺氧化產(chǎn)物的增加，也大大增加了ROS 的釋放，繼而引起細(xì)胞核損傷，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡、壞死。ROS 導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡機(jī)制不詳，可能與以下4 種途徑相關(guān)［48］:(1)ROS導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化，繼而引起促凋亡基因開始活化，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡;(2)大量ROS 攻擊細(xì)胞內(nèi)正常蛋白質(zhì)，引起酶喪失活力;(3)ROS 可直接造成DNA 損傷，導(dǎo)致染色體畸變，DNA 結(jié)構(gòu)發(fā)生改變;(4)ROS 影響細(xì)胞內(nèi)核基因轉(zhuǎn)錄，細(xì)胞表型特征改變，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

臨床實(shí)踐中SCS 往往不進(jìn)行額外供氧，而對常溫和亞低溫機(jī)械灌注提供額外氧氣可增加抗氧化產(chǎn)物、恢復(fù)線粒體功能已經(jīng)基本達(dá)成共識，有研究認(rèn)為應(yīng)維持氧分壓為19.2 kPa 或55.0 kPa，但何為最優(yōu)參數(shù)，還需要進(jìn)一步數(shù)據(jù)支持［49-50］。HMP 過程與SCS 類似，目前對于HMP 過程中的氧合問題仍存在爭議，但對于DCD 或ECD 而言，普遍認(rèn)為添加額外的氧氣有利于供肝保存，總計(jì)為412 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa，下同)的氧分壓可以滿足肝臟代謝需求［50］。由于肝臟由門靜脈(35%)和肝動脈(65%)同時(shí)供氧，因此有學(xué)者認(rèn)為肝動脈268 mmHg和門靜脈144 mmHg 的氧分壓符合肝臟耗氧的生理需求［49］。甚至有學(xué)者提倡用純氧，因其在減少氧化應(yīng)激和改善肝功能方面要優(yōu)于濃度為20%的氧［51-52］。

4 展 望

隨著供肝供需矛盾的加劇，DCD 和ECD 供肝所占比重逐年增加，攜氧技術(shù)的應(yīng)用也必將越來越廣泛。此外，PFC 作為一種有效的攜氧載體用于SCS、肝臟灌洗以及機(jī)械灌注逐漸得到認(rèn)可。越來越多的研究表明應(yīng)用PFC 灌洗供肝或者保存肝臟優(yōu)于傳統(tǒng)的保存液。盡管第1 代PFC 的各種不良反應(yīng)導(dǎo)致其未能在臨床廣泛應(yīng)用，但是隨著PFC 第2 代、第3 代產(chǎn)品的出現(xiàn)及機(jī)械灌注越來越受到重視，今后PFC 在肝臟保存中一定會發(fā)揮越來越重要的作用。進(jìn)一步克服其局限性、拓寬臨床應(yīng)用領(lǐng)域是PFC 今后努力的方向。目前亟需加強(qiáng)臨床和實(shí)驗(yàn)研究，予以證實(shí)PFC 的安全性和有效性。

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