間充質(zhì)干細(xì)胞治療肝移植術(shù)后難治性急性移植物抗宿主病臨床研究

汪國營 唐暉 易慧敏 張英才 易述紅 陳文捷 楊卿 姜楠 傅斌生張琪 楊揚(yáng) 陳規(guī)劃

移植物抗宿主病(graft-versus-host disease，GVHD)是肝移植術(shù)后發(fā)生的以發(fā)熱、皮疹、腹瀉以及骨髓抑制等為主要表現(xiàn)的全身性免疫疾病，患者最終常因全身感染或骨髓衰竭而死亡。肝移植術(shù)后發(fā)生GVHD 很罕見，其發(fā)生率為0.1% ～0.2%，顯著低于骨髓移植后GVHD 的發(fā)生率，但病死率極高，常超過75%［1-2］。由于其發(fā)病率極低，目前國內(nèi)外尚未形成肝移植術(shù)后GVHD 統(tǒng)一的診斷標(biāo)準(zhǔn)和治療方案。

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一類具有自我更新及向間葉細(xì)胞起源的各種細(xì)胞系分化潛能的非造血系干細(xì)胞。MSCs 所具有的低免疫原性和免疫調(diào)節(jié)特性，為其作為臨床治療免疫相關(guān)性疾病提供了可能。目前，無論是自身免疫性疾病還是造血干細(xì)胞移植后GVHD 的治療，MSCs都顯示出良好的療效。作為一種新的治療手段，MSCs 治療移植相關(guān)的免疫性疾病已受到國內(nèi)外專家的廣泛關(guān)注，也有多個(gè)在研的臨床研究［3-4］。本文總結(jié)了中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院肝臟移植中心應(yīng)用MSCs 治療肝移植術(shù)后GVHD 的1 例成功經(jīng)驗(yàn)，經(jīng)檢索國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)，本文為國際上第1 篇關(guān)于MSCs 治療肝癌肝移植后發(fā)生GVHD 的研究，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 臨床資料

患者男性，60 歲，既往有乙型肝炎史18 年，恩替卡韋(博路定)抗病毒治療3 年余。2011 年曾行“脾切除+賁門血管離斷術(shù)”。2013 年10 月18 日因“發(fā)現(xiàn)肝臟占位性病變7 月余”入院?；颊? 個(gè)月前因“乙肝肝硬化”復(fù)查腹部彩超示:肝硬化聲像，右肝稍小，肝內(nèi)散在斑片狀低回聲區(qū)，較前次超聲檢查明顯增大，考慮小肝癌可能;遂行上腹部MRI示:肝S7/8 段占位病變，考慮為海綿狀血管瘤可能;未予處理。此次入院前10 d 復(fù)查甲胎蛋白:4.96 ng/mL;腹部彩超示:肝S4/8 高回聲團(tuán)較前次檢查明顯增大;上腹部MRI 示:肝S7/8 段占位病變，考慮為原發(fā)性塊狀型肝癌，大小約44 mm ×29 mm。入院查體:皮膚、鞏膜輕度黃染，結(jié)膜無蒼白，肝掌征陽性，胸前見蜘蛛痣，腹部正中可見一長約15 cm 的陳舊性手術(shù)瘢痕，淺表淋巴結(jié)未觸及腫大，腹平坦，未見胃腸蠕動波，全腹軟，無壓痛、反跳痛，未觸及腫大膽囊，肝、脾未觸及，移動性濁音陰性。實(shí)驗(yàn)室檢查血常規(guī)、肝功能、甲胎蛋白基本正常，乙型肝炎DNA 定量小于100 IU/mL。入院診斷:肝細(xì)胞癌、乙肝后肝硬化失代償期、脾切除+賁門血管離斷術(shù)后、慢性膽囊炎。

入院后完善相關(guān)檢查，排除手術(shù)禁忌證后于2013 年10 月31 日在氣管插管全身麻醉下行改良背馱式肝移植術(shù)(附加腔靜脈整形)，供受者血型相同。術(shù)中見腫瘤大小3.5 cm，術(shù)后病理示中分化肝細(xì)胞癌，未見脈管內(nèi)癌栓。術(shù)后肝功能恢復(fù)順利，免疫抑制方案為糖皮質(zhì)激素聯(lián)合他克莫司。術(shù)后19 d患者出現(xiàn)發(fā)熱、全身皮疹，并出現(xiàn)白細(xì)胞減少癥、口腔潰瘍和腹瀉，但肝功能正常。皮膚活檢病理組織學(xué)檢查見淋巴細(xì)胞浸潤(見圖1)，免疫組化結(jié)果:CMV(-)，特殊染色結(jié)果:PAS(-)，六胺銀(-)，抗酸(-)。根據(jù)臨床表現(xiàn)、實(shí)驗(yàn)室檢查及皮膚病理組織學(xué)結(jié)果，診斷為GVHD。給予停用免疫抑制劑、大劑量糖皮質(zhì)激素沖擊治療、營養(yǎng)支持、大劑量丙種球蛋白等治療后，患者病情無好轉(zhuǎn)，仍持續(xù)發(fā)熱，全身皮疹無消退，遂于術(shù)后第40 天開始周圍靜脈輸注人臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，huc-MSCs)治療。

間充質(zhì)干細(xì)胞的臨床應(yīng)用已通過我院倫理委員會審批。臍帶均來自中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院產(chǎn)科，取自足月妊娠的健康剖宮產(chǎn)婦。產(chǎn)婦術(shù)前簽署知情同意書，自愿將胎盤、臍帶等分娩廢棄物交由醫(yī)院處理或供科研所用。產(chǎn)婦產(chǎn)前艾滋病病毒抗體、乙肝兩對半、丙型肝炎病毒抗體、梅毒螺旋體抗體、支原體等檢測均無異常，確保安全性后方可使用。huc-MSCs 的分離、培養(yǎng)、傳代擴(kuò)增等過程由中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院生物治療中心完成，huc-MSCs 輸注由生物治療中心輔助完成。

huc-MSCs 治療方案為:細(xì)胞數(shù)5 ×107/次，每次間隔1 周，共3 次。huc-MSCs 首次輸注3 d 后患者體溫和白細(xì)胞即恢復(fù)正常，腹瀉好轉(zhuǎn)，皮疹逐漸消退，口腔潰瘍逐漸好轉(zhuǎn)?；颊邿o不適及其他并發(fā)癥發(fā)生，GVHD 獲得完全緩解。患者繼續(xù)給予他克莫司+糖皮質(zhì)激素免疫抑制方案(共停用他克莫司10 d)，于術(shù)后55 d 痊愈出院。隨訪至2015 年8 月(20 個(gè)月)，未觀察到huc-MSCs 輸注相關(guān)不良反應(yīng)發(fā)生，肝、腎功能及甲胎蛋白均在正常參考值范圍內(nèi)，定期復(fù)查肝臟超聲和CT、胸部X 線平片或CT未發(fā)現(xiàn)肝癌復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及新發(fā)惡性腫瘤。

圖1 肝移植術(shù)后急性移植物抗宿主病患者皮膚活檢病理圖［圖1a (HE×200)，圖1b (HE×400)］

2 討 論

肝移植術(shù)后GVHD 主要是因?yàn)楣└蝺?nèi)免疫細(xì)胞被受者的組織相容性抗原激活后增殖分化，引起免疫應(yīng)答，進(jìn)而攻擊受者的皮膚、消化道、骨髓等全身器官［1］，患者病情常危重，預(yù)后差。其發(fā)病機(jī)制尚不明確，目前認(rèn)為其發(fā)生需滿足3 個(gè)基本條件［5］:(1)供者具有免疫活性細(xì)胞;(2)受者擁有供者不具備的組織抗原;(3)受者對供者無免疫反應(yīng)。由于肝移植術(shù)后GVHD 缺乏特異性的臨床表現(xiàn)，早期診斷較為困難。目前主要是根據(jù)受累靶器官(皮膚、消化道、骨髓等)癥狀和體征、組織病理學(xué)檢查結(jié)果以及受者外周血或受累靶器官中存在供者淋巴細(xì)胞的證據(jù)診斷［6］。本例患者肝移植術(shù)后19 d 出現(xiàn)發(fā)熱、全身皮疹，并出現(xiàn)白細(xì)胞減少癥、口腔潰瘍及腹瀉，結(jié)合皮膚活檢病理組織學(xué)檢查見淋巴細(xì)胞浸潤，可診斷為急性GVHD。

各移植中心目前對肝移植術(shù)后GVHD 的治療方案不盡相同，尚未形成統(tǒng)一的規(guī)范。目前臨床治療包括:(1)主要通過減少免疫抑制劑，增加受者自身免疫力，可促進(jìn)清除供者的免疫細(xì)胞，減輕組織損傷，并減少發(fā)生感染的概率;但同時(shí)也存在導(dǎo)致受者發(fā)生急性排斥反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)，也有報(bào)道稱增加或者更換免疫抑制劑能取得良好的效果［7-8］;(2)糖皮質(zhì)激素是經(jīng)典的抗炎藥物，大劑量糖皮質(zhì)激素沖擊治療可中斷炎性因子引起的“瀑布”效應(yīng)，誘導(dǎo)供者免疫細(xì)胞凋亡，改善受者的全身癥狀［9］，但會進(jìn)一步抑制受者免疫力，增加感染機(jī)會［10］;(3)常同時(shí)合并使用抗生素預(yù)防感染。本例患者在診斷為急性GVHD 后立即停用免疫抑制劑，采用大劑量糖皮質(zhì)激素及丙種球蛋白沖擊治療，并加強(qiáng)抗感染治療;但效果不佳，患者病情無好轉(zhuǎn)，仍持續(xù)發(fā)熱，全身皮疹無消退，靶器官損傷無明顯改善。這使得我們必須尋求另一種有效的治療方法。

MSCs 可由骨髓、脂肪組織、胎肝及臍帶血中分離得到，能抑制各種免疫細(xì)胞活性，包括T 淋巴細(xì)胞、B 淋巴細(xì)胞、DC 細(xì)胞及NK 細(xì)胞等。MSCs 的低免疫原性及免疫調(diào)節(jié)性等免疫學(xué)特性為其臨床治療GVHD 提供了可能。2004 年，Le Blanc 等［11］首次嘗試用MSCs 治療1 例糖皮質(zhì)激素耐藥的Ⅳ度腸道和肝臟急性GVHD 患者，療效顯著。隨后，多個(gè)移植中心相繼應(yīng)用MSCs 治療GVHD。Introna 等［12］用MSCs 治療40 例糖皮質(zhì)激素耐藥的GVHD 患者，有效率為67.5%，其中完全緩解為27.5%;此外，研究還發(fā)現(xiàn)Ⅱ級GVHD 患者的完全緩解率高于Ⅱ級以上患者，兒童患者的完全緩解率高于成人患者，1 年和2 年的總生存率分別為50.0%和38.6%。國內(nèi)有研究報(bào)道12 例糖皮質(zhì)激素耐藥的慢性GVHD 患者，在原有免疫抑制劑基礎(chǔ)上聯(lián)合MSCs 輸注，3 例獲得完全緩解，6 例獲得部分緩解，總有效率為75%［13］。

然而，MSCs 究竟是促進(jìn)腫瘤進(jìn)展還是抑制其生長有不同的報(bào)道［14］，MSCs 是否會促進(jìn)肝癌肝移植后的肝癌復(fù)發(fā)仍不清楚，因而限制了其在肝癌肝移植術(shù)后發(fā)生GVHD 患者中的應(yīng)用。MSCs 有助于腫瘤的轉(zhuǎn)化、腫瘤血管生成和腫瘤細(xì)胞的遷移，具有向組織損傷、炎癥部位、腫瘤組織的歸巢能力，與多種腫瘤增殖及侵襲相關(guān)。在炎癥微環(huán)境下，MSCs 可通過TGF-β 信號途徑誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，從而促進(jìn)肝癌轉(zhuǎn)移［15］。而通過上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)，MSCs 可促進(jìn)肝大部分切除術(shù)后肝細(xì)胞再生，更加表明MSCs 歸巢能力與肝細(xì)胞增殖再生能力的密切關(guān)系［16-17］。但MSCs 與肝癌切除術(shù)后以及與肝癌肝移植術(shù)后的肝癌復(fù)發(fā)關(guān)系如何目前未見報(bào)道。

本病例在使用常規(guī)方法治療肝移植術(shù)后GVHD無效的情況下，及時(shí)采用huc-MSCs 作為挽救性治療措施，取得了較好的療效，患者無明顯并發(fā)癥發(fā)生，GVHD 獲得完全緩解。隨訪20 個(gè)月未觀察到huc-MSCs 輸注相關(guān)的不良反應(yīng)發(fā)生，未發(fā)現(xiàn)肝癌復(fù)發(fā)和huc-MSCs 相關(guān)的惡性腫瘤發(fā)生。說明MSCs在治療肝移植術(shù)后GVHD 中有著良好的應(yīng)用前景，可作為難治性GVHD 的一種挽救生命的手段，但仍需進(jìn)一步臨床研究來證實(shí)其安全性，也需要免疫抑制狀態(tài)下MSCs 對肝癌影響的基礎(chǔ)研究。檢索國內(nèi)外文獻(xiàn)，本例為國際上第1 篇關(guān)于MSCs 治療肝癌肝移植后發(fā)生GVHD 的臨床報(bào)道。

3 總 結(jié)

GVHD 是肝移植術(shù)后罕見的并發(fā)癥，死亡率高，但由于臨床病例少，缺乏系統(tǒng)性研究，臨床上主要依靠經(jīng)驗(yàn)性的診斷和治療，尚缺乏統(tǒng)一的規(guī)范和標(biāo)準(zhǔn)。MSCs 由于其特有的免疫調(diào)節(jié)功能，已初步被用于治療移植后出現(xiàn)的難治性GVHD，并有一定的療效。但其是否與肝癌等惡性腫瘤的復(fù)發(fā)有關(guān)，目前仍難以做出結(jié)論，可作為肝移植后難治性GVHD 的一種挽救生命的手段，但其安全性仍需進(jìn)一步研究。另外，MSCs 治療肝移植后GVHD 的輸注細(xì)胞數(shù)、輸注次數(shù)以及療程等問題還需要深入研究。

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