索拉非尼聯(lián)合斑蝥酸鈉對肝癌HepG2細(xì)胞的抑制作用

陳志剛魯號峰朱繼業(yè)黃山鄔國斌黎樂群趙蔭農(nóng)

作者單位：530021南寧1廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院肝膽外科；2廣西醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院

基礎(chǔ)研究

索拉非尼聯(lián)合斑蝥酸鈉對肝癌HepG2細(xì)胞的抑制作用

陳志剛1，2魯號峰1，2朱繼業(yè)1，2黃山1鄔國斌1黎樂群1趙蔭農(nóng)1

作者單位：530021南寧1廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院肝膽外科；2廣西醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院

目的探討索拉非尼聯(lián)合斑蝥酸鈉對肝癌HepG2細(xì)胞的抑制作用及相關(guān)機(jī)制。方法將不同濃度的索拉非尼和斑蝥酸鈉分為索拉非尼組、斑蝥酸鈉組及索拉非尼+斑蝥酸鈉聯(lián)合用藥組（聯(lián)合用藥組），并設(shè)空白對照組，分別作用于肝癌HepG2細(xì)胞。CCK-8法測定兩個單藥組及聯(lián)合用藥組對肝癌HepG2細(xì)胞的抑制作用，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期，Western blot法檢測ERK及pERK蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果索拉非尼組、斑蝥酸鈉組及聯(lián)合用藥組均可抑制肝癌HepG2細(xì)胞的增殖，并具有劑量-時間依賴效應(yīng)，聯(lián)合用藥組細(xì)胞抑制率高于兩個單藥組（P均＜0.05）。索拉非尼濃度為4μmol/L、斑蝥酸鈉濃度為3.88μmol/L聯(lián)合用藥的48 h時段表現(xiàn)為協(xié)同作用，其余大多表現(xiàn)為相加作用。3組G1期細(xì)胞百分比均明顯高于對照組（P均＜0.001），聯(lián)合用藥組較兩個單藥組更高（P＜0.05）；兩個單藥組及聯(lián)合用藥組的ERK蛋白的表達(dá)較對照組無明顯差異（P=0.1），索拉非尼組及聯(lián)合用藥組pERK蛋白的表達(dá)明顯低于對照組的（P＜0.05），斑蝥酸鈉組明顯高于對照組（P=0.023）。結(jié)論索拉非尼和斑蝥酸鈉對肝癌HepG2細(xì)胞均有抑制增殖的作用，聯(lián)合用藥表現(xiàn)為協(xié)同或相加作用，其機(jī)制可能與阻滯細(xì)胞周期及抑制RAF/MEK/ERK信號傳導(dǎo)通路有關(guān)。

肝腫瘤；索拉非尼；斑蝥酸鈉；抑制作用；信號傳導(dǎo)通路

1 材料與方法

1.1 材料

人肝癌細(xì)胞株HepG2購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。斑蝥酸鈉（批號：130906）購于貴州神奇制藥有限公司，CCK-8購于日本同仁化學(xué)研究所，多聚甲醛及吉姆薩染色劑購于武漢博士德生物工程有限公司。周期試劑盒購自南京凱基生物科技有限公司，索拉非尼（批號：08705s000109252013）、ERK1/2及pERK1/2蛋白抗體購自美國Cell Signaling Technology生物公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

將肝癌細(xì)胞株HepG2置于含12%胎牛血清及100 U/ml青鏈霉素的1640培養(yǎng)液中于37℃、5%CO2恒溫箱中培養(yǎng)。每2 d用0.05%胰蛋白酶進(jìn)行消化傳代一次。

1.3 CCK-8法檢測肝癌HepG2細(xì)胞的增殖抑制情況

將處于對數(shù)生長期的細(xì)胞消化、離心制成單細(xì)胞懸液并接種于96孔板，按每孔10 000個細(xì)胞將HepG2細(xì)胞接種于96孔板，取索拉非尼濃度為1μmol/L、2μmol/L、4μmol/L、8μmol/L、16μmol/L、32μmol/L；斑蝥酸鈉濃度為0.97μmol/L、1.94μmol/L、3.88μmol/L、7.76μmol/L、15.52μmol/L、31.04μmol/L分別作用于HepG2細(xì)胞48 h，然后加入CCK-8試劑，每孔10μl，37℃避光孵育1 h后用酶標(biāo)儀在450 nm處測定各孔吸光度值（OD值）。根據(jù)測得的OD值計算抑制率。抑制率（%）=（對照組OD值-實(shí)驗(yàn)組OD值）/對照組OD值×100%，計算50%細(xì)胞生長抑制所需的各藥物濃度（IC50），以確定后續(xù)藥物濃度。根據(jù)索拉非尼及斑蝥酸鈉單藥IC50值設(shè)定聯(lián)合用藥的濃度。依據(jù)上述實(shí)驗(yàn)計算得IC50索拉非尼=5.703μmol/L，IC50斑蝥酸鈉= 4.507μmol/L，以此確定本實(shí)驗(yàn)索拉非尼組濃度為2μmol/L、4μmol/L、6μmol/L、8μmol/L；斑蝥酸鈉組濃度為1.94μmol/L、3.88μmol/L、5.82μmol/L、7.76μmol/L，聯(lián)合用藥組藥物濃度分別為以上索拉非尼組和斑蝥酸鈉組各個濃度之和，每組設(shè)6個復(fù)孔，設(shè)不含藥物對照組。分別培養(yǎng)24 h、48 h及72 h。采用協(xié)同作用q值判斷索拉非尼和斑蝥酸鈉聯(lián)合作用的性質(zhì)。q=Eab/（Ea+Eb-Ea×Eb），式中Ea和Eb為各單藥組抑制率，Eab為聯(lián)合用藥組抑制率。當(dāng)q＞1.15時，認(rèn)為兩藥有協(xié)同作用；0.85≤q≤1.15則為相加作用；q＜0.85為兩藥聯(lián)合表現(xiàn)為拮抗作用。以獲得最佳協(xié)同作用q值的聯(lián)合藥物濃度進(jìn)行細(xì)胞周期檢測及Western blot實(shí)驗(yàn)。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測肝癌HepG2細(xì)胞的細(xì)胞周期

取對數(shù)生長期細(xì)胞懸液接種于6孔板，每孔細(xì)胞數(shù)為5×104個，24 h后加入藥物。培養(yǎng)24 h后分別消化、離心，70%酒精固定過夜后，P月S洗滌3次，加入RNAse A及PI，常溫避光染色30 min后以流式細(xì)胞術(shù)儀檢測細(xì)胞周期。

在借鑒Jackson E L、Crawford D W和Godbey G等休閑制約理論模型基礎(chǔ)上，學(xué)者Walker GJ和Virden R J針對戶外游憩活動提出了戶外游憩制約因素模型 (圖5)。整個模型是一個循環(huán)反饋的過程。尤其是該模型新增加了先行宏觀因素 (包括種族、性別、文化等)和先行微觀因素 (包括個性、需求、態(tài)度和信仰等)［2］240－243和環(huán)境條件3個變量。模型中有利于休閑行為實(shí)現(xiàn)的環(huán)境條件受到微觀因素和宏觀因素的共同影響。休閑制約協(xié)商則受到微觀因素和環(huán)境條件的共同影響。而環(huán)境條件影響休閑偏好、休閑參與決策和實(shí)際參與行為。

1.5 Western blot法檢測肝癌HepG2細(xì)胞ERK、pERK蛋白的表達(dá)

加藥24 h后提取蛋白，測定蛋白濃度，加入上樣緩沖液，100℃煮沸5min后于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｅ渲肧DS-PAGE凝膠，每孔加入蛋白20μg，接通電源常規(guī)電泳、切膠、轉(zhuǎn)膜、月SA封閉。T月ST洗膜3次，孵育一抗（1∶1 000）、4℃過夜，洗膜、孵育二抗1 h后滴加發(fā)光液上機(jī)掃膜并分析結(jié)果。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間及不同時間點(diǎn)間的比較采用方差分析，多重比較時則采用LSD檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 索拉非尼組、斑蝥酸鈉組及聯(lián)合用藥組對肝癌HepG2細(xì)胞生長抑制的影響

CCK-8法檢測結(jié)果顯示，索拉非尼組和斑蝥酸鈉組及聯(lián)合用藥組對肝癌HepG2細(xì)胞的抑制率均隨濃度的增加及時間延長而增加，呈劑量-時間依賴效應(yīng)，而聯(lián)合用藥組抑制作用則較兩個單藥組更明顯，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）。見表1。當(dāng)索拉非尼濃度為4μmol/L、斑蝥酸鈉濃度為3.88μmol/L時q值在各時段內(nèi)均為最大，其中48 h段的q值為1.179（q＞1.15），表現(xiàn)為協(xié)同作用，而其余大多表現(xiàn)為相加作用。見表2。

2.2 索拉非尼組、斑蝥酸鈉組及聯(lián)合用藥組對肝癌HepG2細(xì)胞細(xì)胞周期的影響

在G0/G1期，索拉非尼組、斑蝥酸鈉組及聯(lián)合用藥組的細(xì)胞百分比均明顯高于空白對照組（P均＜0.001），聯(lián)合用藥組明顯高于兩個單藥組（P均＜0.05）。S期、G2期各用藥組則均較空白對照組低。提示兩藥單用及聯(lián)合用藥均可使細(xì)胞阻滯于G1期。見表3。

2.3 索拉非尼組、斑蝥酸鈉組及聯(lián)合用藥組對肝癌HepG2細(xì)胞ERK、pERK蛋白表達(dá)的影響

Western blot法檢測結(jié)果顯示，兩個單藥組及聯(lián)合用藥組ERK蛋白的表達(dá)與空白對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（F=2.928，P=0.100）。而索拉非尼組及聯(lián)合用藥組pERK蛋白的表達(dá)較空白對照組低（P＜0.05），而斑蝥酸鈉組則高于空白對照組（P=0.023）。見圖1。

表1 不同濃度及不同時段索拉非尼組、斑蝥酸鈉組和聯(lián)合用藥組對肝癌HepG2細(xì)胞的抑制率［（±s）%］

表1 不同濃度及不同時段索拉非尼組、斑蝥酸鈉組和聯(lián)合用藥組對肝癌HepG2細(xì)胞的抑制率［（±s）%］

S1、S2、S3、S4分別為索拉非尼2μmol/L、4μmol/L、6μmol/L、8μmol/L；月1、月2、月3、月4分別為斑蝥酸鈉1.94μmol/L、3.88μmol/L、5.82μmol/L、7.76μmol/L。

組別24 h 48 h 72 h單藥組S1 9.25±5.89 23.90±3.74 36.14±2.26 S2 13.07±5.31 37.51±4.73 56.37±2.33 S3 30.64±3.70 59.18±3.58 66.97±1.33 S4 41.30±2.84 62.19±3.98 65.52±2.31月1 9.51±2.70 16.07±4.24 14.84±5.69月2 13.15±2.80 25.65±3.30 36.03±7.16月3 21.63±6.30 46.80±3.44 59.24±2.03月4聯(lián)合用藥組30.67±3.67 63.05±2.40 71.88±1.51 S1+月1 10.17±3.07 36.59±5.29 36.90±2.53 S2+月2 25.44±4.44 63.12±5.44 68.63±1.56 S3+月3 39.41±4.79 71.41±5.16 77.12±0.81 S4+月4 48.10±3.23 75.19±5.26 77.19±0.76

表2 聯(lián)合用藥組對肝癌HepG2細(xì)胞協(xié)同抑制作用的q值

表3 索拉非尼組、斑蝥酸鈉組及聯(lián)合用藥組對肝癌HepG2細(xì)胞細(xì)胞周期的影響［（±s）%］

表3 索拉非尼組、斑蝥酸鈉組及聯(lián)合用藥組對肝癌HepG2細(xì)胞細(xì)胞周期的影響［（±s）%］

索拉非尼組為4μmol/L，斑蝥酸鈉組為3.88μmol/L，聯(lián)合用藥組為索拉非尼4μmol/L+斑蝥酸鈉3.88μmol/L。

組別G0/G1期S期G2期空白對照組49.89±3.30 34.57±3.02 16.98±2.28索拉非尼組64.86±1.44 21.51±0.57 13.62±2.00斑蝥酸鈉組60.68±1.48 27.57±0.44 11.76±1.21聯(lián)合用藥組69.13±1.85 23.79±0.22 7.23±1.46

圖1 索拉非尼組、斑蝥酸鈉組及聯(lián)合用藥組對肝癌HepG2細(xì)胞ERK、pERK蛋白表達(dá)的影響

3 討論

肝癌是我國常見、高發(fā)的惡性腫瘤之一，因其發(fā)病隱匿，大多患者就診時已屬晚期，而全身化療效果較差，故尋找一種新的治療方案在臨床上具有重要意義。索拉非尼作為一種有效的肝癌化療藥物，現(xiàn)已大量應(yīng)用于臨床，其對晚期肝癌患者已顯示出較好的臨床效果［3，4，6］。然而，在使用全劑量索拉非尼治療時也帶來一系列毒副反應(yīng)，如腹瀉、手足綜合征等［7］。此外由于索拉非尼價格昂貴，因而促使研究者們探索用較小劑量聯(lián)合其他常規(guī)化療藥物或治療手段，以取得相同或更好治療效果的同時減少其使用量以減輕毒副反應(yīng)。如索拉非尼聯(lián)合5-氟尿嘧啶、絲裂霉素、順鉑［7，8］等常規(guī)化療藥物，以及塞來昔布［9］、雷公藤［10］等其他藥物，以上研究結(jié)果均發(fā)現(xiàn)聯(lián)合用藥均能增強(qiáng)索拉非尼的抗癌效能，甚至成倍提升抗癌作用。然而，上述與索拉非尼聯(lián)合的藥物較少單用于肝癌的治療，或僅作為局部用藥。目前用于治療肝癌較為理想的聯(lián)合方案仍在探索中。本研究中與索拉非尼聯(lián)合作用的斑蝥酸鈉是斑蟊素的衍生物，其保留了斑蟊素的抗癌能力，而毒副反應(yīng)則較斑蝥素小。斑蟊素是一種蛋白磷酸酶2A（PP2A）抑制劑，可誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞凋亡，包括肺、胃、肝等惡性腫瘤［11］。而PP2A可通過抑制Raf/MEK/ERK信號傳導(dǎo)通路最終下調(diào)pERK1/2的水平［12］，同時去甲斑蟊素可通過抑制PP2A上調(diào)pERK1/2的水平［13］。因而，我們推測斑蝥酸鈉或許可使pERK1/2的表達(dá)上調(diào)，影響其抑制作用，而索拉非尼可靶向性抑制pERK1/2的表達(dá)。因此，根據(jù)此契合點(diǎn)，本文試圖探討、觀察索拉非尼聯(lián)合斑蝥酸鈉對肝癌HepG2細(xì)胞的抑制作用。

通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，索拉非尼、斑蝥酸鈉及二者聯(lián)合用藥時均對肝癌HepG2細(xì)胞產(chǎn)生明顯的抑制增殖作用，且呈劑量-時間依賴效應(yīng)，在索拉非尼濃度為4μmol/L、斑蝥酸鈉濃度為3.88μmol/L的24 h和72 h兩個時間段，兩藥表現(xiàn)為相加作用，在48 h表現(xiàn)為協(xié)同作用；當(dāng)濃度分別為6μmol/L和5.82μmol/L時，則皆為相加作用。由此認(rèn)為，索拉非尼聯(lián)合斑蝥酸鈉是值得探索的聯(lián)合方案之一。

有研究發(fā)現(xiàn)索拉非尼通過抑制周期特異性蛋白cyclin-D1、cyclin-D3及周期蛋白依賴性激酶4（cdk4）和cdk6，使細(xì)胞無法通過G1-S期，因此被阻滯在G1期［14］。而對于斑蝥酸鈉，有研究發(fā)現(xiàn)其類似物去甲斑蝥素可通過下調(diào)cdk6和微小染色體維持蛋白2（Mcm2），阻止肝癌HepG2細(xì)胞進(jìn)入S期，阻滯在G1期［15］。本研究結(jié)果亦發(fā)現(xiàn)索拉非尼及斑蝥酸鈉單藥均可使肝癌HepG2細(xì)胞被阻滯在G1期，而聯(lián)合用藥時，通過上述兩種機(jī)制的影響，雙重阻滯，使更多的細(xì)胞阻滯在G1期，進(jìn)一步印證了上述觀點(diǎn)。

Raf/MEK/ERK促分裂原活化蛋白（MAP）激酶信號傳導(dǎo)通路的激活是肝癌發(fā)生過程中的一個重要變化。當(dāng)此通路被激活后，細(xì)胞的生存及增殖能力得以增強(qiáng)，同時還能通過促進(jìn)血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）和血小板源性生長因子（PDGF）的表達(dá)刺激血管生成，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的生長［7］。因此，Raf/MEK/ERK信號傳導(dǎo)通路成為肝癌的治療靶點(diǎn)之一。Western blot法檢測顯示，索拉非尼及斑蝥酸鈉單藥及聯(lián)合用藥的ERK蛋白表達(dá)與空白對照組相比無明顯差異，但索拉非尼組及聯(lián)合用藥組pERK蛋白的表達(dá)則明顯較空白對照組低，而斑蝥酸鈉組高于空白對照組。這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了本研究前期推論，即斑蝥酸鈉可促進(jìn)pERK蛋白的表達(dá)，而與索拉非尼聯(lián)合用藥時，可減少斑蝥酸鈉所引發(fā)的pERK蛋白的表達(dá)上調(diào)，最終使pERK蛋白的表達(dá)下降。因此，抑制Raf/ MEK/ERK信號傳導(dǎo)通路可能是兩藥聯(lián)合抑制肝癌HepG2細(xì)胞增殖的機(jī)制之一。

隨著分子靶向治療研究的不斷深入，探索有效的治療肝癌聯(lián)合方案成為熱點(diǎn)之一，索拉非尼在單藥治療肝癌取得肯定療效后，本研究通過索拉非尼聯(lián)合中藥斑蝥酸鈉的體外實(shí)驗(yàn)，證明了其具有協(xié)同或相加抑制肝癌HepG2細(xì)胞增殖的作用，可為肝癌的臨床治療提供一定參考。然而，其機(jī)制及聯(lián)合用藥方案和臨床療效還需進(jìn)一步臨床試驗(yàn)加以探索。

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［2014-12-29收稿］［2015-03-02修回］［編輯羅惠予］

Anti-proliferative effects of combining Sorafenib and sodium cantharidinate in HepG2 liver cancer cells

CHEN Zhigang1，2，LU Haofeng1，2，ZHU Jiye1，2，HUANG Shan1，WU Guobin1，LI Lequn1，ZHAO Yinnong1（1Department of Hepatobiliary Surgery，Affiliated Tumor Hospital of Guangxi Medical University；2Graduate School of Guangxi Medical University，Nanning 530021，P.R.China）

ZHAO Yinnong.E-mail：Yinongzhao@263.com

ObjectiveTo investigate the anti-proliferative effects of combining Sorafenib and sodium cantharidinate on HepG2 liver cancer cells.M ethodsHepG2 cells were treated with sorafenib alone，sodium cantharidinate alone or both together；control cells were left untreated.The CCK-8 assay was used to measure antiproliferative effects of different drug concentrations；flow cytometry，to measure cell cycle distribution；and Western blotting，to measure expression of ERK and pERK.Results月oth sorafenib and sodium cantharidinate on their own or together inhibited HepG2 proliferation in a dose-dependentway，with the combination proving significantly more potent than either drug on its own（P＜0.05）.Combining the two drugs led to an additive antiproliferative effect，except at a concentration of 4μmol/L of sorafenib and 3.88μmol/L of sodium cantharidinate at 48 h，when a synergistic effectwas observed.The proportion of cells arrested in G1phase was significantly greater with either drug alone or both together than in the absence of drug（P＜0.001），and itwas significantly higher for the two drugs together than for either drug alone（P＜0.05）.ERK was not significantlyaffected by either drug on its own or by the combination（P=0.1），while pERK levels were significantly lower with sorafenib alone or both drugs together than in the absence of drug（P＜0.05）.Conversely，the pERK levelwas significantly higherwith sodium cantharidinate alone than in the absence of drug（P=0.023）.ConclusionThe combination of sorafenib and sodium cantharidinate can exerta synergistic antiproliferative effect on HepG2 cells，and this effectmay be due to cell cycle arrest and inhibition of the RAF/MEK/ERK signaling pathway.

Liver neoplasm；Sorafenib，Sodium cantharidinate；Anti-proliferative effects；Signaling pathway

R735.7

A

1674-5671（2015）02-05

10.3969/j.issn.1674-5671.2015.02.04

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81360315）；廣西衛(wèi)生廳科研基金資助項(xiàng)目（重2012087）；廣西衛(wèi)生廳自籌經(jīng)費(fèi)科研課題（Z2011228）

趙蔭農(nóng)。E-mail：Yinongzhao@263.com