兩株植物乳桿菌作為潛在益生菌的體外評價

孟祥晨，李雪，姚蕾，周金雨

（乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實驗室，東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，哈爾濱150030）

兩株植物乳桿菌作為潛在益生菌的體外評價

孟祥晨，李雪，姚蕾，周金雨

（乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實驗室，東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，哈爾濱150030）

采用體外試驗方法，評價兩株植物乳桿菌KLDS1.0391與KLDS1.0706作為益生菌的潛在能力，包括對酸和膽鹽的抗性、免疫活性以及安全性評價。采用活菌計數(shù)法測量其在低酸和膽鹽條件下耐受性，采用MTT法觀察不同劑量活性和熱致死乳桿菌對小鼠脾臟淋巴細(xì)胞增殖能力影響，采用哥倫比亞血平板測定兩株植物乳桿菌溶血性，采用K-B藥敏紙片法測定其抗生素抗性。結(jié)果表明，兩株植物乳桿菌均對酸和膽鹽有較好耐受性；活性、熱致死植物乳桿菌均能促進(jìn)體外小鼠淋巴細(xì)胞增殖，表現(xiàn)出劑量依賴關(guān)系，活性植物乳桿菌作用效果較熱致死乳桿菌更為明顯；兩株植物乳桿菌均無溶血性，對萬古霉素與鏈霉素具有抗性。

植物乳桿菌；溶血性；抗生素抗性；胃腸道耐受性；淋巴細(xì)胞增殖

植物乳桿菌屬于乳桿菌科乳桿菌屬，因多數(shù)分離自植物得名[1]。在代謝過程中，植物乳桿菌能通過競爭性抑制作用在胃腸道內(nèi)占位、定植，抑制致病菌對胃腸道侵害，調(diào)節(jié)腸道菌群平衡。菌株對胃腸道低酸、膽鹽等不良環(huán)境耐受性是其發(fā)揮益生作用先決條件。作為一類人體有益菌群，植物乳桿菌不僅具有調(diào)節(jié)腸道菌群益生功能，還具有免疫調(diào)節(jié)功能，例如能調(diào)節(jié)脾細(xì)胞增殖能力以及影響Th1/Th2細(xì)胞平衡等[2-5]。食品工業(yè)生產(chǎn)中，植物乳桿菌已有較長使用歷史[6]，通常被認(rèn)為是“安全的”[7]，但有些植物乳桿菌存在溶血性、抗生素抗性等安全隱患[8-10]，其安全性不容忽視。

植物乳桿菌KLDS1.0391分離自內(nèi)蒙古自治區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵稀奶油“焦克”，能夠通過代謝合成細(xì)菌素，而植物乳桿菌KLDS1.0706同樣分離自內(nèi)蒙古傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品，但卻不產(chǎn)細(xì)菌素。本試驗以植物乳桿菌KLDS1.391和KLDS1.0706為研究對象，評價其作為潛在益生菌可能性，研究內(nèi)容包括對胃腸道不良環(huán)境抗性、免疫活性及安全性，為后續(xù)試驗奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 試驗菌株

植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）KLDS 1.0391、KLDS1.0706和鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus GG）由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實驗室保存；化膿性鏈球菌（Streptococcus pyogenes）ATCC19615、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）ATCC25923購自上海復(fù)祥生物科技有限公司。

1.1.2 試驗用小鼠

BALB/c小鼠，60只，雌性，6～8周齡，清潔級，購自哈爾濱腫瘤醫(yī)院實驗動物中心。飼養(yǎng)環(huán)境溫度：23±2℃；照明時長：12 h·d-1；飼料：標(biāo)準(zhǔn)小鼠飼料；自由飲水。每組3只作為平行對照，另選3只作為空白對照組。

1.1.3 培養(yǎng)基

Man-Rogosa-Sharp（MRS）培養(yǎng)基、Brian Heart Infusion（BHI）培養(yǎng)基和Tryptone Soya Broth（TSB）培養(yǎng)基。培養(yǎng)基具體配制方法參照文獻(xiàn)[11]方法。

1.1.4 試劑

微生物藥敏試紙，哈爾濱鑫豐生物材料有限公司；哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基，哈爾濱偉業(yè)生物工程有限公司；Roswell Park Memorial Institute（RPMI）1640培養(yǎng)液，美國Gibco公司；胎牛血清，美國Hyclon公司；刀豆蛋白（ConA）、噻唑藍(lán)（MTT）、臺盼蘭、牛膽鹽，美國Sigma公司；二甲基亞砜（DMSO），天津TBD公司。

1.1.5 儀器與設(shè)備

HF90型CO2培養(yǎng)箱，香港力康發(fā)展有限公司；Model 680型酶標(biāo)儀，美國Beckman公司；EL1 04/ 00型電子天平，梅特勒上海公司；2～1 000 μL可調(diào)定量移液器，德國Eppendor公司；96孔培養(yǎng)板，美國Corning Incorporated Costa公司；XW-80A型旋渦混合器、AE-30倒置生物顯微鏡，麥克奧迪實業(yè)集團(tuán)有限公司；VD-1320型潔凈工作臺，北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；LD4-2型低速離心機(jī)，北京醫(yī)用離心機(jī)廠。

1.2 方法

1.2.1 酸耐受性試驗

植物乳桿菌KLDS1.0391與KLDS1.0706以2%接種量接種于液體MRS培養(yǎng)基中，37℃下靜置培養(yǎng)16 h。得到過夜培養(yǎng)物離心（6 000 r·min-1，4℃，10 min），收集菌體，并用pH 7.2磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌2次。洗滌后得到菌體用PBS緩沖液重懸，再用3 mol·L-1的HCL溶液pH分別調(diào)節(jié)至2和3。pH 2時，分別在0、0.5 h時取樣，用移液槍吸取1 mL菌液加入滅菌9 mL生理鹽水中進(jìn)行梯度稀釋。稀釋到適宜濃度時，吸取100 μL涂板并于24 h后菌落計數(shù)。pH 3時，分別在1、2、3 h時取樣，操作方法同上[11]。

1.2.2 膽鹽耐受性試驗

按照以上方法進(jìn)行培養(yǎng)、洗滌及重懸等步驟，并用3 mol·L-1的NaOH溶液調(diào)節(jié)至pH 7。孵育0、4、8 h后取樣，用滅菌后生理鹽水進(jìn)行梯度稀釋，當(dāng)達(dá)到適宜濃度后，吸取100 μL涂板，并于24 h后菌落計數(shù)[11]。

1.2.3 對小鼠淋巴細(xì)胞增殖試驗

參照文獻(xiàn)[5]方法，并以鼠李糖乳桿菌LGG為對照菌株。

1.2.3.1 菌懸液制備

將試驗菌株接種至MRS培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)16 h，將菌液6 000 r·min-1離心10 min后，重懸于0.01 mol·L-1PBS緩沖液中（pH 7.2），所得菌懸液分為活菌組和滅活菌組（100℃，30 min，經(jīng)檢驗證明無活菌存在，仍保持正常細(xì)菌形態(tài)）。將處理后活菌組和滅活菌組菌液6 000 r·min-1離心10 min并棄掉上清，用含10%胎牛血清RPMI1640培養(yǎng)液重懸菌沉淀，并調(diào)整兩組菌懸液濃度均為107cfu·mL-1。

1.2.3.2 小鼠脾臟淋巴細(xì)胞液制備

試驗當(dāng)天頸椎脫臼處死，置75%酒精內(nèi)浸泡2～5 min，置于超凈臺內(nèi)，逐層剪開腹壁，無菌取小鼠脾臟，置于盛有預(yù)冷的RPMI 1640培養(yǎng)液平皿中，剪去結(jié)締組織和脂肪，無菌注射器研磨過200目鋼網(wǎng)過濾到離心管中，4℃1 500 r·min-1離心10 min，繼用紅細(xì)胞裂解液去除紅細(xì)胞，4℃1 000 r·min-1離心10 min后棄上清，用PBS洗2遍，收集細(xì)胞，用含10%FCS的RPMI1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。用臺盼藍(lán)法測定細(xì)胞存活率，要求活細(xì)胞比率在95%以上。計數(shù)后用含10%FCS的RPMI 1640培養(yǎng)液調(diào)成所需細(xì)胞數(shù)培養(yǎng)。

1.2.3.3 乳桿菌體外對淋巴細(xì)胞增殖的影響

在無菌96孔板中，設(shè)空白調(diào)零組（只加培養(yǎng)液200 μL·孔-1）、陰性對照組（終濃度約為1×106個·mL-1的小鼠淋巴細(xì)胞懸液180 μL·孔-1，20 μL培養(yǎng)液·孔-1）、陽性對照組（淋巴細(xì)胞懸液180 μL·孔-1和終濃度為2.5 μg·mL-1的ConA）、乳酸菌對照組（培養(yǎng)液180 μL·孔-1和終濃度分別為105、106、107cfu·mL-1的待測活性和熱致死菌懸液）、乳酸菌試驗組（淋巴細(xì)胞懸液180，20 μL·孔-1不同濃度待測菌懸液，使不同種屬的活性和熱致死乳桿菌與細(xì)胞分別以10∶1、1∶1和1∶10比例共同孵育）。所有試驗均重復(fù)3次。

加樣混勻后，置于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱連續(xù)培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)結(jié)束前4 h，加入5 mg·mL-1的MTT液20 μL·孔-1，反應(yīng)4 h后吸去上清液50 μL·孔-1，加入DMSO 100 μL·孔-1，靜置10 min后用酶標(biāo)儀在570 nm波長處測定OD并計算淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化值。

1.2.4 溶血性試驗

將活化好的兩株植物乳桿菌KLDS1.0391、KLDS1.0706以及對照菌株LGG取出接種于MRS液體培養(yǎng)基中，化膿鏈球菌接種于BHI培養(yǎng)基中，37℃，16 h活化3代后，穿刺接種于哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基，37℃靜置培養(yǎng)16 h，觀察是否有溶血圈出現(xiàn)，以化膿性鏈球菌ATCC19615作為指示菌株，判斷三株乳桿菌是否具有溶血性[12]。

1.2.5 抗生素抗性試驗

操作方法參照文獻(xiàn)[13]方法，將兩株植植物乳桿菌及鼠李糖乳桿菌LGG接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37℃靜置培養(yǎng)16 h，調(diào)整其濃度為108cfu·mL-1。用無菌棉拭子蘸取菌液并在管壁上擠壓出多余菌液。用棉拭子將菌液均勻涂抹在整個MRS培養(yǎng)基表面，反復(fù)3次，每次將平板順時針旋轉(zhuǎn)60°，最后沿周邊繞兩圈。待平板干后，用無菌鑷子取藥敏紙片貼在平板表面，每個平板貼5張紙片，每張紙片間距不小于24 mm，紙片中心距平皿邊緣不少于15 mm。待紙片貼好后，將平板放置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后取出，用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈直徑，抑菌圈邊緣以肉眼看不到細(xì)菌明顯生長為界限。藥敏紙片試驗同時用Streptococcus pyogenes ATCC25923為指示菌，鼠李糖乳桿菌LGG為對照菌。當(dāng)且僅當(dāng)Streptococcus pyogenes ATCC 25923抑菌圈直徑在允許范圍內(nèi)時，測定菌株抑菌直徑結(jié)果才真實有效。

1.3 數(shù)據(jù)分析

每個試驗均獨(dú)立重復(fù)3次，3次獨(dú)立試驗結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，并用SPSS 20.0對結(jié)果進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 對低酸的耐受性

試驗中為更好模擬真實胃酸情況，選取pH 2和pH 3兩個酸度。由圖1A所示，當(dāng)受試菌在pH 2的PBS緩沖液中孵育1 h后，無活菌存活（數(shù)據(jù)未給出）。當(dāng)植物乳桿菌KLDS1.0391在pH 2的PBS緩沖液中孵育0.5 h后，活菌數(shù)維持在4.16 log cfu·mL-1，其活菌存活量顯著高于植物乳桿菌KLDS1.0706（P＜0.05）。對照菌株LGG在pH 2時表現(xiàn)出最好耐受性（P＜0.05）。

由圖1B所示，在pH 3時，所有菌株均表現(xiàn)出對酸良好耐受能力。在pH 3的PBS緩沖液中孵育3 h后，所有菌株存活量仍均超過9 log cfu·mL-1。在孵育1、2、3 h時，植物乳桿菌KLDS1.0391菌株存活量均高于植物乳桿菌KLDS1.0706，且在孵育1、2 h時差異顯著（P＜0.05）。但植物乳桿菌KLDS1.0391在孵育期間段內(nèi)其菌株存活量略小于對照菌株LGG，且在孵育3 h時差異顯著（P＜0.05）。

圖1 乳桿菌對pH 2和pH 3低酸環(huán)境的耐受性Fig.1Tolerance of Lactobacillus strains to pH 2 and pH 3

2.2 對膽鹽的耐受性

由圖2A可知，孵育4 h后，植物乳桿菌KLDS 1.0391活菌數(shù)顯著高于植物乳桿菌KLDS1.0706（P＜0.05），且略高于對照菌株LGG；孵育8 h后，受試菌株活菌數(shù)無顯著差異，且活菌數(shù)均維持在8.0 log cfu·mL-1，說明菌株對0.3%膽鹽具有較強(qiáng)耐受性。

圖2 乳桿菌對0.3%、0.5%和1.0%膽鹽的耐受性Fig.2Tolerance of Lactobacillus strains to 0.3%,0.5%and 1%bile salt

由圖2B可知，孵育4 h后，受試菌活菌數(shù)均維持在8.5 log cfu·mL-1。兩株受試植物乳桿菌活菌數(shù)均高于對照菌株LGG，且植物乳桿菌KLDS1.0706活菌數(shù)略高于植物乳桿菌KLDS1.0391。經(jīng)孵育8 h后，三株菌株活菌數(shù)無顯著差異（P＞0.05），且植物乳桿菌KLDS1.0391活菌數(shù)略高于KLDS1.0706。

由圖2C可知，孵育4 h后，三株菌株活菌數(shù)無顯著差異（P＞0.05），且均保持在8.0 log cfu·mL-1以上，但兩受試菌活菌數(shù)較對照菌LGG偏少。在孵育8 h后，植物乳桿菌KLDS1.0706的活菌數(shù)明顯下降，且顯著低于植物乳桿菌KLDS1.0391與LGG（P＜0.05）。說明植物乳桿菌KLDS1.0706對1.0%膽鹽耐受能力較差。

圖3 活性乳桿菌刺激淋巴細(xì)胞增殖后的OD570Fig.3OD570of lymphocyte proliferation stimulated by viableLactobacillusstrains

淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化值大小可直接反映淋巴細(xì)胞活性高低，是測定T淋巴細(xì)胞免疫功能的重要指標(biāo)之一[14]。由表1可知，活性乳桿菌對體外小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化均有促進(jìn)作用，且呈現(xiàn)計量依賴關(guān)系。小鼠脾臟淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化值隨活性乳桿菌與小鼠淋巴細(xì)胞濃度比值增大而增大。當(dāng)活性乳桿菌與小鼠淋巴濃度比值為10∶1時，淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化值依次為：植物乳桿菌KLDS1.0706＞LGG＞植物乳桿菌KLDS1.0391（P＜0.05）。當(dāng)活性乳桿菌與小鼠淋巴細(xì)胞濃度比值為1∶1時，植物乳桿菌KLDS 1.0706對小鼠淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化值也顯著高于植物乳桿菌KLDS1.0391和對照菌LGG（P＜0.05）；當(dāng)活性乳桿菌與小鼠淋巴濃度比值為1：10時，三株乳桿菌對小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化值雖無差異顯著性，但植物乳桿菌KLDS1.0706轉(zhuǎn)化值仍高于其他兩株，與對小鼠淋巴細(xì)胞增殖結(jié)果一致。

2.3.2 熱滅活乳桿菌作用

由圖4可知，熱致死乳桿菌與小鼠淋巴細(xì)胞濃度比為10∶1時，熱致死乳桿菌OD570顯著高于陽性對照組（P＜0.05），且其中植物乳桿菌KLDS1.0706 OD570最大。說明植物乳桿菌KLDS1.0706對促進(jìn)小鼠淋巴細(xì)胞體外增殖活性最高。其次分別為植物乳桿菌KLDS1.0391、LGG。而當(dāng)熱致死乳桿菌與小鼠淋巴細(xì)胞濃度比為1∶1時，其OD570也與陽性對照組相當(dāng)；當(dāng)熱致死乳桿菌與小鼠淋巴細(xì)胞濃度比為1∶10時，不同種熱致死乳桿菌OD570均顯著低于陽性對照組（P＜0.05）。說明隨熱致死乳桿菌濃度降低，對促進(jìn)小鼠體淋巴細(xì)胞增殖作用減弱。

由表2可知，植物乳桿菌KLDS1.0706對小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化值的影響高于植物乳桿菌KLDS 1.0391和對照菌株LGG，且在乳桿菌與細(xì)胞濃度比為10∶1與1∶10時差異顯著（P＜0.05）。然而，通過對比表1、2可知，熱致死乳桿菌對體外小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化作用雖有一定促進(jìn)作用，但效果不明顯，其大部分作用效果僅約為同一濃度下活性乳桿菌對體外小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化效果的十分之一到幾十分之一，而且在乳桿菌與細(xì)胞比為1∶10時，對照菌株LGG對小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化無促進(jìn)作用。

2.3 乳桿菌體外對小鼠淋巴細(xì)胞的增殖作用

2.3.1 活性乳桿菌作用

由圖3可知，活性乳桿菌與小鼠淋巴細(xì)胞濃度比值越高，OD570越大。說明活性乳桿菌對小鼠淋巴細(xì)胞體外增殖有促進(jìn)作用，且乳桿菌與小鼠淋巴濃度比越大，促進(jìn)作用越明顯。乳桿菌與小鼠淋巴細(xì)胞比值為10∶1時促進(jìn)作用最為明顯，而當(dāng)乳桿菌與小鼠淋巴細(xì)胞濃度比為1∶10時，其增值作用顯著低于ConA（P＜0.05）。兩株受試乳桿菌中，植物乳桿菌KLDS1.0706在不同濃度下對小鼠淋巴細(xì)胞的促進(jìn)作用均顯著高于植物乳桿菌KLDS1.0391（P＜0.05）。而兩株受試菌株與對照菌株LGG相比，兩株受試乳桿菌促進(jìn)作用均高于LGG。

表1 活性乳桿菌刺激小鼠脾臟淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化值(±s,n=3)Table 1Proliferative response of spleen cells induced by viable Lactobacillus strains(±s，n=3)

表1 活性乳桿菌刺激小鼠脾臟淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化值(±s,n=3)Table 1Proliferative response of spleen cells induced by viable Lactobacillus strains(±s，n=3)

注：同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)字母不同表示差異顯著（P＜0.05）。下同。Note：Column data marked with different superscripts mean significant difference(P＜0.05)。The same as below.

菌種Species菌株Strains植物乳桿菌Lactobacillus plantarum植物乳桿菌Lactobacillus plantarum鼠李糖乳桿菌Lactobacillus rhamnosus KLDS1.0391 KLDS1.0706 LGG淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化值（乳桿菌∶細(xì)胞）Converted value of spell cells（Lactobacillus∶cells）10∶1 0.170±0.011c 0.323±0.029a 0.217±0.006b 1∶1 0.051±0.004b 0.065±0.009a 0.047±0.004b 1∶10 0.005±0.004 0.012±0.008 0.009±0.006

圖4 熱致死乳桿菌刺激淋巴細(xì)胞增殖后的OD570Fig.4OD570of lymphocyte proliferation by thermal-inactive Lactobacillus strains

2.4 安全性

2.4.1 溶血性

以化膿性鏈球菌為對照菌株，檢測乳桿菌溶血性?；撔枣溓蚓渲車霈F(xiàn)透明溶血圈（見圖5A），為乙型溶血（β-溶血），對人體的致病力強(qiáng)。乳桿菌KLDS1.0391、KLDS1.0706及對照菌LGG菌落周圍沒有出現(xiàn)溶血圈（見圖5B、C、D），說明植物乳桿菌KLDS1.0391、KLDS1.0706與鼠李糖乳桿菌LGG不具有溶血性。

2.4.2 抗生素抗性

根據(jù)表3，對照菌株Streptococcus pyogenes ATCC25923抑菌圈直徑在允許范圍內(nèi)，所以可知受試菌株抑菌結(jié)果真實有效。

表2 熱致死乳桿菌刺激小鼠脾臟淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化值(x±s,n=3)Table 2Proliferative response of spleen cells induced by thermal-inactiveLactobacillusstrain±s,n=3)

表2 熱致死乳桿菌刺激小鼠脾臟淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化值(x±s,n=3)Table 2Proliferative response of spleen cells induced by thermal-inactiveLactobacillusstrain±s,n=3)

菌種Species菌株Strains植物乳桿菌Lactobacillus plantarum植物乳桿菌Lactobacillus plantarum鼠李糖乳桿菌Lactobacillus rhamnosus KLDS1.0391 KLDS1.0706 LGG淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化值（乳桿菌∶細(xì)胞）Converted value of spell cells（Lactobacillus∶cells）10∶1 0.017±0.0066ab 0.026±0.0093a 0.012±0.0070b 1∶1 0.002±0.0044 0.004±0.0048 0.001±0.0056 1∶10 0.001±0.0048b 0.000±0.0060a -0.005±0.0053b

圖5 化膿鏈球菌、植物乳桿菌KLDS1.0391、KLDS1.0706及鼠李糖乳桿菌溶血性Fig.5Hemolytic properties of Streptococcus pneumoniae,Lactobacillus plantarum KLDS1.0391,KLDS1.0706 and Lactobacillus rhamnosus

表3 抑菌圈解釋標(biāo)準(zhǔn)Table 3Sketch of inhibition zone

由表4可知，KLDS1.0391、KLDS1.0706以及對照菌株LGG均對萬古霉素與鏈霉素具有抗性，且對四環(huán)素敏感。其中，KLDS1.0706對慶大霉素具有抗性，KLDS1.0391、LGG對慶大霉素敏感。

表4 測定抗生素抗性時獲得的抑菌直徑Table 4Inhibition zone diameters of antibiotic(mm)

3 討論

對低酸和膽鹽耐受性試驗表明，植物乳桿菌KLDS1.0391相比植物乳桿菌KLDS1.0706，對酸和膽鹽均有較高耐受性，推測是植物乳桿菌KLDS 1.0391在代謝過程中產(chǎn)生細(xì)菌素所致。有報道稱細(xì)菌素對菌株在腸道內(nèi)的定植及與腸道內(nèi)其他菌株競爭有優(yōu)勢[15-17]，而且，Bove等也曾從基因表達(dá)方面證實這一說法[18]。兩株菌對膽鹽耐受性，除在1%膽鹽中孵育8 h時外，其余條件下活菌數(shù)差異均不顯著（P＞0.05），均能維持在相同數(shù)量級上，并與對照菌LGG抗性相仿。結(jié)果與Yu等和Vinderola等研究結(jié)果接近[19-20]，說明這兩株菌對膽鹽具有較好耐受性。

對淋巴細(xì)胞增殖作用表明植物乳桿菌KLDS 1.0391與植物乳桿菌KLDS1.0706對小鼠脾細(xì)胞均有促進(jìn)增殖作用，且活性植物乳桿菌對脾細(xì)胞的增殖作用要好于熱致死乳桿菌增殖作用。說明植物乳桿菌本身或其代謝產(chǎn)物對小鼠淋巴細(xì)胞增殖作用有促進(jìn)效果，但作用機(jī)理尚待動物試驗和臨床試驗提供依據(jù)。

溶血性是體外對菌株進(jìn)行安全性檢測的重要指標(biāo)之一。根據(jù)溶血特征可將溶血性分為兩類：α溶血，特點(diǎn)是菌落周圍有草綠色溶血圈，對人致病力差；β溶血，其特點(diǎn)是菌落周圍出現(xiàn)透明溶血圈，對人體致病力強(qiáng)。若無溶血性，則沒有溶血圈出現(xiàn)。本試驗發(fā)現(xiàn)三株試驗用菌均無溶血圈出現(xiàn)，說明三株菌均不具有溶血性。Argyri等試驗選取73株乳桿菌，經(jīng)試驗發(fā)現(xiàn)其中69株乳桿菌屬于γ溶血，4株屬于α溶血[21]。而Vidhyasagar等試驗中同樣發(fā)現(xiàn)所選6株含有細(xì)菌素基因的乳桿菌均屬于γ溶血[22]。從而可以看出，雖然溶血性是體外評價益生菌安全性的指標(biāo)之一，但大多數(shù)乳酸菌均不具有溶血性，屬于γ溶血，只有少量乳酸菌具有對人體致病能力較低的α溶血性。而具有溶血性的乳桿菌罕有發(fā)現(xiàn)。

菌株抗生素抗性測定是體外評價益生菌和潛在益生菌的重要手段之一。Argyri等研究發(fā)現(xiàn)所選73株乳酸菌（含37株植物乳桿菌）均對萬古霉素具有抗性[21]，且50%以上乳酸菌對克林霉素具有抗性。Tulumoglu等研究表明，選取20株乳酸菌均對萬古霉素具有抗性，對青霉素和四環(huán)素敏感[23]。本研究發(fā)現(xiàn)，植物乳桿菌KLDS1.0391、KLDS1.0706以及對照菌株LGG均對萬古霉素與鏈霉素具有抗性，且KLDS1.0706對慶大霉素具有抗性，證明乳酸菌是一類耐肽聚糖類（如萬古霉素）細(xì)菌。但對其他抗生素抗性可能具有種屬差異性。兩株植物乳桿菌抗生素抗性基因是否存在轉(zhuǎn)移的風(fēng)險，還需進(jìn)一步從基因角度驗證。

4 結(jié)論

植物乳桿菌KLDS1.0391和KLDS1.0706對低酸和膽鹽有較好抗性，接近LGG；兩株菌對小鼠淋巴細(xì)胞有較強(qiáng)增殖作用；兩株菌均無溶血性，但對萬古霉素與鏈霉素具有抗性，而且，植物乳桿菌KLDS1.0706還對慶大霉素具有抗性。研究結(jié)果初步表明植物乳桿菌KLDS1.0391與KLDS1.0706具有作為益生菌的潛在能力。

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In vitroevaluation of twoLactobacillus plantarumas potencial probiot-ics

/MENG Xiangchen,LI Xue,YAO Lei,ZHOU Jinyu
(Key Laboratory of Dairy Science,Ministry of Education,School of Food Science,NortheastAgricultural University,Harbin 150030,China)

The probiotic potential of twoLactobacillus plantarumstrains KLDS1.0391,KLDS1.0706 was evaluated by a series ofin vitroassays,and then a preliminary evaluation of the two strains of immunological activity was conducted,finally the safety of two strains was evaluated.The tolerance to low pH and bile salt was used the viable counts assay;effect of active and thermal-inactive strains with different amount on the proliferative capacity of the lymphocytes in the mice spleen were assessed by the MTT method;in addition,the hemolytic activity of two strains were determined by Columbia blood agar;the antibiotic resistance of two strains were determined by Kirby-Bauer(KB)antibiotic testing.Results showed that it was indicated that two non-hemolyticLactobacillus plantarumstrains were greatly resistant to harsh environment and had resistance to vancomycin and streptomycin.Though either the activeLactobacillusor the thermal-inactive Lactobacilluswas able to promote the lymphocytes proliferationin vitroand the promoting effect was amount-dependent,activeLactobacilluswere more effective than the thermal-inactive ones.

Lactobacillus plantarum;hemolytic activity;antibiotic resistance;gastrointestinal tolerance;lymphocyte proliferation

TS252.1

A

1005-9369（2015）09-0044-08

時間2015-9-23 10：43：25[URL]http：//www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20150923.1043.022.html

孟祥晨,李雪,姚蕾,等.兩株植物乳桿菌作為潛在益生菌的體外評價[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2015,46(9):44-51.

Meng Xiangchen,Li Xue,Yao Lei,et al.In vitroevaluation of twoLactobacillus plantarumas potencial probiotics[J].Journal of Northeast Agricultural University,2015,46(9):44-51.(in Chinese with English abstract)

2015-03-23

哈爾濱市杰出青年人才基金項目（2014RFYXJ006）；教育部博士學(xué)科點(diǎn)專項科研基金項目（20122325110017）

孟祥晨（1970-），女，教授，博士，博士生導(dǎo)師，研究方向為食品微生物與生物技術(shù)。E-mail：xchmeng@163.com