轉(zhuǎn)DAS／DAK 基因天竺葵甲醛代謝途徑與吸收能力研究

周升恩，肖素勤，韓 雙，軒秀霞，孫 振，李昆志，陳麗梅

（昆明理工大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院生物工程技術(shù)研究中心，昆明650500）

甲醛（HCHO）污染以其來源廣、污染重、治理難而成為一個(gè)重要的環(huán)境問題。在眾多治理HCHO 污染的方法中，生物凈化法以其簡單自然、經(jīng)濟(jì)、科學(xué)以及持久有效等優(yōu)點(diǎn)受到廣泛關(guān)注。對(duì)生物凈化法的機(jī)理研究發(fā)現(xiàn)微生物和植物都能吸收和 代 謝HCHO［1－5］。雖 然 植 物 能 夠 吸 收 并 代 謝HCHO，但環(huán)境中極低濃度的氣體HCHO 就會(huì)對(duì)植物產(chǎn)生脅迫，導(dǎo)致葉片氣孔傳導(dǎo)率下降，無法快速有效吸收HCHO 供植物代謝［6］。在植物體中過量表達(dá)HCHO 同化途徑的相關(guān)酶能夠提高植物吸收和代謝HCHO 的能力［7－10］。甲基型營養(yǎng)酵母的木酮糖單磷酸途徑（XuMP）能夠同化HCHO，在該途徑中同化HCHO 的關(guān)鍵酶是二羥基丙酮激酶（DAS）和二羥基丙酮合酶（DAK），在DAS作用下，5－磷酸木酮糖（Xu5P）可以固定HCHO，生成三磷酸甘油醛（GAP）和二羥丙酮（DHA），DHA 對(duì)細(xì)胞有毒，但可以通過DAK 的作用形成無毒的磷酸二羥基 丙 酮（DHAP）［11］。該HCHO 固 定 途 徑 中 的Xu5P、GAP和DHAP是植物卡爾文循環(huán)途徑中的關(guān)鍵中間代謝產(chǎn)物。因此，如果在植物葉綠體中過量表達(dá)來自于甲基型營養(yǎng)酵母中的DAS／DAK 基因，也許可以在植物葉綠體中構(gòu)建一條光合HCHO同化途徑（圖1）。為此，Xiao等［12］在模式植物煙草的葉綠體中過量表達(dá)DAS／DAK 基因，結(jié)果表明該途徑能夠在煙草的葉綠體中發(fā)揮作用，并提高了轉(zhuǎn)基因煙草吸收和同化HCHO 的能力。

圖1 在植物葉綠體中過表達(dá)DAS／DAK基因安裝光合HCHO 同化途徑策略Xu5P．5－磷酸木酮糖；DHA．二羥基丙酮；DHAP．磷酸二羥丙酮；RuBP．核酮糖－1，5－二磷酸；GAP．3－磷酸甘油醛；FBP．果糖－1，6－二磷酸；E4P．赤鮮糖－4－磷酸；SBP．景天庚酮糖－1，7－二磷酸；S7P．景天庚糖酮糖－7－磷酸；Gluc．葡萄糖；Fruc．果糖Fig．1 Diagram of strategy for installation of a photosynthetic HCHO－assimilation pathway by overexpressioning DAS／DAK genes in chloroplasts of plant Xu5P．Xylulose－5－phosphate；DHA．Dihydroxyacetone；DHAP．Dihydroxyacetone phosphate；RuBP．Ribulose 1，5－bisphosphate；GAP．Glyceraldehyde3－phosphate，F(xiàn)BP．Fructose－1，6－bisphosphate；E4P．Erythrose－4－phosphate，SBP．Sedoheptulose－1，7－bisphosphate，S7P．Sedoheptulose－7－phosphate；Gluc．Glucose；Fruc．Fructose

天竺葵以其嬌艷的花色、多變的花瓣和較長的花期而逐漸成為室內(nèi)裝飾及露天花壇使用的主要材料之一。它能夠通過組織培養(yǎng)快速繁殖，常被用作轉(zhuǎn)基因操作的材料。本研究以天竺葵為材料，在野生型天竺葵的葉綠體中過量表達(dá)DAS 和DAK 基因，利用13C－NMR 技 術(shù) 對(duì) 液 體H13CHO 脅 迫 下 野生型和轉(zhuǎn)基因天竺葵葉片H13CHO 代謝產(chǎn)物進(jìn)行比較分析，并通過測(cè)定氣體HCHO 脅迫下野生型和轉(zhuǎn)基因天竺葵的生理生化指標(biāo)，分析其對(duì)天竺葵HCHO 抗性、HCHO 吸收效率以及氣孔傳導(dǎo)率的影響，為利用DAS／DAK 基因開發(fā)轉(zhuǎn)基因觀賞植物治理氣體HCHO 污染的技術(shù)提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1．1 天竺葵的轉(zhuǎn)化和培養(yǎng)

無菌野生型天竺葵在MS 培養(yǎng)基（pH 5．7）上培養(yǎng)。天竺葵的轉(zhuǎn)化參照Song等［10］的方法進(jìn)行。含 有pKm－35S－PrbcS－＊T－DAK－PROLD－PrbcS－＊T－DAS［12］表達(dá)載體 的農(nóng)桿菌［Agrobacterium tumefaciens C58C1（pMP90）］培養(yǎng)于含有100μg·mL－1Spe液體LB 培養(yǎng)基中。天竺葵的轉(zhuǎn)化采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉柄共培養(yǎng)方法［13］。在含有50μg·mL－1卡那霉素（Km）的MS（含有1%蔗糖，W／V）培養(yǎng)基上篩選轉(zhuǎn)基因天竺葵小苗。

為了得到天竺葵的無菌苗，抗性芽首先在含有50μg·mL－1Kan的MS培養(yǎng)基上篩選，然后轉(zhuǎn)移到含有3%蔗糖的MS 培養(yǎng)基，并且在25 ℃100 μmol·m－2·s－1恒定光照下培養(yǎng)。將篩選到的具有Km 抗性的天竺葵小苗轉(zhuǎn)移到含有3%蔗糖的MS培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，獲得無菌轉(zhuǎn)基因天竺葵幼苗。此外，獲得的具有Km 抗性且生根的天竺葵小苗轉(zhuǎn)移到含有1／2珍珠巖和1／2有機(jī)土的花盆中培養(yǎng)，獲得土壤栽培的轉(zhuǎn)基因天竺葵植株。

1．2 基因組PCR 和Western blot分析

用CTAB 法［14］從野生型和T1代轉(zhuǎn)基因株系葉片中提取基因組DNA 作為模板。分別用DAS的上下游引物（DAS－F：5′－CATTATCTAGACATGAAGTTCCAC－3′／DAS－R：5′－TAAATGATTTTGATCATGTTTTGG－3′）和DAK的上下游（DAKF：5′－CTGAAGGAAAGCTTGATCTC－3′／DAK－R：5′－CTACAACTTGGTTTCAGATTTG－3′）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測(cè)DAS 和DAK 基因在轉(zhuǎn)基因株系基因組的整合情況。

用Plant Total Protein Extraction kit（Sigma）提取野生型和轉(zhuǎn)基因株系新鮮葉片組織的總蛋白。取15 μg總蛋白通過SDS－PAGE（濃度為12%）分離后轉(zhuǎn)移至PVDF－P膜上。分別以假絲酵母（Candida boidinii S2）和畢赤酵母（Pichia pastoris GS115）制備的粗蛋白（5μg）為陽性對(duì)照（PCK），隨后用C．boidinii S2和P．pastoris GS115的DAS和DAK 蛋白的鼠抗［12］作一抗孵育過夜，再用辣根過氧化酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗室溫孵育2h，洗膜后加入1 mL Luminol／Enhancer solution和1 mL CL Peroxide solution（PIERCE），混勻，浸潤整個(gè)PVDF膜，在凝膠成像系統(tǒng)上用ChemidoeXRS（BIO－RAD）觀測(cè)結(jié)果。

1．3 H13CHO、NaH13CO3 標(biāo)記與13C－NMR分析

H13CHO 和NaH13CO3購 于 美 國CIL 公 司，液體H13CHO 和NaH13CO3處理在組培瓶中進(jìn)行，從無菌培養(yǎng)的天竺葵植株上分別取葉片2g，用2 mmol·L－1液體H13CHO（含5 mmol·L－1KHCO3，0．1% MES，W／V）處理野生型天竺葵（H13CHO／WT）和轉(zhuǎn)基因天竺葵植株P(guān)SK5（H13CHO／PSK5）葉片4h，用5 mmol·L－1NaH13CO3（含5 mmol·L－1KHCO3，0．1% MES）溶液處理野生型天 竺 葵（NaH13CO3／WT）葉 片4 h，以 未 經(jīng) 過H13CHO處理的野生型天竺葵葉片為對(duì)照（CK）。在整個(gè)處理期，于25 ℃的組培室中，24h光照下?lián)u床振蕩（100r·min－1）培養(yǎng)，處理結(jié)束后，分別用預(yù)冷無菌蒸餾水沖洗葉片4～5次，去除葉片表面殘留的H13CHO 和NaH13CO3，無菌吸水紙吸干葉片表面殘留水分，液氮速凍，置于－80 ℃冰箱備用。

13C－NMR 分析如下：取－80 ℃冰箱中凍存的葉片，在液氮中研磨，加3mL 100mmol·L－1磷酸鉀緩沖液（KPB，pH 7．4）抽提可溶性代謝產(chǎn)物，經(jīng)沸水浴加熱處理3 min使酶失活，4 ℃下12 000g離心20min。上清液經(jīng)真空冷凍干燥后，用0．5mL的KPB緩沖液溶解，4℃下12 000g離心3min，取上清裝入核磁管，并加入適量甲酰胺做內(nèi)參和5%2H2O（V／V）。13C－NMR 分 析 在 布 魯 克 核 磁 共 振 儀（DRX 500－MHz）上進(jìn)行，使用相關(guān)參數(shù)如下：寬帶質(zhì)子去耦，5－ms（90°）脈沖，譜寬37 594 Hz，采樣時(shí)間0．5s，延滯時(shí)間1．2s，樣品溫度保持在25℃，每個(gè)樣品采集32 000個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)，掃描1 200次，處理數(shù)據(jù)時(shí)線寬為4 Hz。H13CHO 標(biāo)記樣品中化學(xué)位移時(shí)參照甲酰胺碳原子共振峰（166．66ppm）。NMR譜中共振峰通過和已知化合物13C－NMR 譜進(jìn)行比較鑒定。在計(jì)算不同樣品中各代謝物的相對(duì)含量時(shí)目標(biāo)共振峰以甲酰胺為內(nèi)參進(jìn)行積分。

1．4 測(cè)定項(xiàng)目和方法

1．4．1 天竺葵對(duì)HCHO 抗性分析 將野生型和轉(zhuǎn)基因植株P(guān)SK5幼苗置于含有MS固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶內(nèi)，25 ℃100μmol·m－2·s－1持續(xù)光照培養(yǎng)2周后，在其中加入一個(gè)去蓋的500μL 的離心管，吸取30μL 37%的HCHO 溶液至該離心管中。由于HCHO 極易揮發(fā)，HCHO 氣體很快充滿密閉空間，使整個(gè)瓶中的HCHO 濃度達(dá)到48μg·L－1，繼續(xù)培養(yǎng)15d后觀察天竺葵的生長狀態(tài)并采集圖片。

1．4．2 丙二醛（MDA）、H2O2和蛋白羧基（PC）含量測(cè)定 將野生型和轉(zhuǎn)基因植株P(guān)SK5幼苗置于含有MS固體培養(yǎng)基的密封盒（370 mL）內(nèi)25 ℃100 μmol·m－2·s－1持續(xù)光照培養(yǎng)3～4周生根后，在其中加入一個(gè)去蓋的500μL 離心管，吸取30μL 37% HCHO 溶液，使HCHO 濃度達(dá)到48μg·L－1，處理24h后收集葉片，液氮速凍，置于－80 ℃冰箱備用。參照Gurel等［15］的方法測(cè)定MDA 和PC含量。參照Gay等［16］的方法測(cè)定H2O2含量。

1．4．3 氣體HCHO 脅迫下天竺葵HCHO 吸收效率和氣孔傳導(dǎo)率的測(cè)定 將溫室條件下盆栽培養(yǎng)的生長良好、株齡和長勢(shì)一致的的野生型和轉(zhuǎn)基因植株放入一個(gè)三面由壓縮板材（59×40×48cm）組成、一面有玻璃門的柜子里進(jìn)行24h HCHO 脅迫處理，分別于8：00、13：00、18：00和次日8：00用便攜式甲醛檢測(cè)儀（PPM400 HTV，英國）測(cè)定柜子內(nèi)的HCHO 濃度，以未放入植株的空柜為對(duì)照（CK1），同時(shí)用光合作用測(cè)量系統(tǒng)（CI－340，美國）測(cè)定葉片的氣孔傳導(dǎo)率，以相同光照和溫濕度條件的柜外野生型植株為對(duì)照（CK2）。

1．5 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析

所有生理生化指標(biāo)分析均進(jìn)行3 次重復(fù)。用Microsoft Excel 2003軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和作圖，用DPS 7．05軟件進(jìn)行方差分析和多重比較（Duncan法）；用F檢驗(yàn)差異的顯著性。

2 結(jié)果與分析

2．1 轉(zhuǎn)基因天竺葵的鑒定

為了檢測(cè)具有Km 抗性的天竺葵植株基因組中是否含有目的基因，以野生型和篩選出的轉(zhuǎn)基因株系（PSK1、PSK4和PSK5）基因組為模板進(jìn)行PCR分析，結(jié) 果 表 明，轉(zhuǎn) 基 因 株 系（PSK1、PSK4 和PSK5）可以擴(kuò)增出與陽性對(duì)照（DAS／DAK cDNA編碼區(qū)）相同的目的條帶（約0．5kb），而野生型則沒有擴(kuò)增出任何條帶（圖2，A、B），說明DAS 和DAK 基因均已插入到轉(zhuǎn)基因株系的基因組中。

為檢測(cè)目的基因在轉(zhuǎn)基因株系中的表達(dá)水平，Western blot分析結(jié)果表明，3株P(guān)CR 陽性植株和陽性對(duì)照（PCK）中都能檢測(cè)到非常強(qiáng)的77．4kD 的DAS和66．7kD 的DAK 信號(hào)條帶，而野生型中沒有檢測(cè)到相應(yīng)的信號(hào)條帶（圖2，C、D）。這3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系中PSK5中目的基因的表達(dá)水平最高，PSK4次之，最弱的是PSK1。以上結(jié)果說明DAS／DAK基因在這3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系中能正常表達(dá)，因此可以將這3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行繼代用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2．2 轉(zhuǎn)基因天竺葵的H13CHO 代謝產(chǎn)物分析

為了考察過表達(dá)DAS 和DAK 基因所形成的HCHO 同化途徑是否在轉(zhuǎn)基因天竺葵中引導(dǎo)HCHO代謝流進(jìn)入卡爾文循環(huán)，以及其發(fā)揮作用時(shí)是否改變天竺葵原有HCHO 代謝途徑，13C－NMR分 析 比 較 了 H13CHO／WT、H13CHO／PSK5 及NaH13CO3／WT 處理葉片的代謝譜，并以未經(jīng)任何處理的野生型天竺葵抽提物作為對(duì)照（CK）檢測(cè)葉片的背景13C－NMR信號(hào)水平，通過積分的方法計(jì)算代謝產(chǎn)物的相對(duì)含量。由于過量表達(dá)DAS／DAK基因所形成的HCHO 同化途徑與卡爾文循環(huán)偶聯(lián)，H13CHO／PSK5和NaH13CO3／WT 處理葉片的代謝譜應(yīng)該相似。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明（圖3），H13CHO／PSK5與NaH13CO3／WT 代謝產(chǎn)物相對(duì)含量的變化趨勢(shì)相似。此外，對(duì)［U－13C］Gluc（葡萄糖）和［U－13C］Fruc（果糖）相對(duì)含量分析結(jié)果顯示（圖3，A），與CK 相比，H13CHO／WT 處 理 葉 片 中［U－13C］Gluc和［U－13C］Fruc相對(duì)含量都下降了，以［U－13C］Gluc下 降最為明顯（P＜0．05），下降為CK的57%，可見野生型天竺葵葉片通過消耗內(nèi)源性Gluc和Fruc來響應(yīng)HCHO 脅迫。而H13CHO／PSK5處理葉片中［U－13C］Gluc和［U－13C］Fruc的相對(duì)含量分別增加為H13CHO／WT 處理的1．86和12．19倍，說明過表 達(dá)DAS 和DAK 基 因 成 功 將H13CHO 的13C 代謝流引入卡爾文循環(huán)，使得糖類物質(zhì)的生成量為H13CHO／WT 處理的2．85倍。

進(jìn)一步對(duì)H13CHO 代謝重要產(chǎn)物分析結(jié)果顯示，與CK 相比，H13CHO／WT 處理葉片中［U－13C］Cit（檸檬酸）相對(duì)含量與CK 沒有顯著性差異（P＞0．05，圖3，B）。但是H13CHO／PSK5 處理葉片中［U－13C］Cit的 相 對(duì) 含 量 比H13CHO／WT 處 理 和CK 呈顯著性地降低（P＜0．05，圖3，B）。［1－13C］Gly（甘氨酸）的變化趨勢(shì)與［U－13C］Cit相似，說明過表達(dá)DAS／DAK 基因削弱了轉(zhuǎn)基因天竺葵通過H13CHO 代謝合成［U－13C］Cit和［1－13C］Gly的 途徑。相反，在H13CHO／PSK5 處理葉片中產(chǎn)生了［2－13C］Gly，［2－13C］Mal（蘋果酸）、［3－13C］Ser（絲氨酸）、［2－13C］Glu（谷氨酸）、［3－13C］Asp（天冬氨酸）以及［3－13C］PA（丙氨酸）等有機(jī)酸（圖3，C），而在H13CHO／WT 處理葉片和CK 中大多沒有檢測(cè)到這些有機(jī)酸，說明轉(zhuǎn)基因天竺葵中通過H13CHO 代謝產(chǎn)生這些有機(jī)酸的途徑得到增強(qiáng)。

2．3 氣體HCHO 脅迫下轉(zhuǎn)基因天竺葵的抗性和抗氧化能力分析

環(huán)境中HCHO 污染主要以氣體形式存在。為了考察過表達(dá)DAS／DAK 基因?qū)μ祗每麣怏wHCHO 抗性的影響，用48μg·L－1氣體HCHO 處理野生型和轉(zhuǎn)基因植株P(guān)SK5的無菌苗15d，結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因植株的生長狀態(tài)比野生型的好，葉片白化現(xiàn)象較輕（圖4），這表明過表達(dá)DAS／DAK 增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因植株對(duì)氣體HCHO 的抗性。

H2O2、MDA和PC是細(xì)胞氧化損傷的產(chǎn)物，在植物受到環(huán)境脅迫時(shí)其含量會(huì)明顯增加。可作為氧化脅迫的指標(biāo)，反映植物抗氧化能力的強(qiáng)弱。對(duì)野生型和轉(zhuǎn)基因植株P(guān)SK5葉片中H2O2含量的分析結(jié)果顯示，在48μg·L－1氣體HCHO 脅迫下，野生型和轉(zhuǎn)基因植株葉片中H2O2含量明顯升高（圖5），說明氣體HCHO 對(duì)天竺葵葉片產(chǎn)生氧化脅迫，但是轉(zhuǎn)基因植株葉片中H2O2含量升高的幅度小于野生型，說明過表達(dá)DAS／DAK基因可以緩解氣體HCHO脅迫下天竺葵葉片受到的氧化脅迫。48μg·L－1氣體HCHO脅迫還引起野生型和轉(zhuǎn)基因天竺葵葉片中MDA 和PC（圖5）含量的顯著升高，說明氣體HCHO 脅迫引起天竺葵葉片中膜脂和蛋白質(zhì)的過氧化，但是MDA 和PC 的含量在轉(zhuǎn)基因植株葉片中上升的幅度比野生型小，說明過表達(dá)DAS／DAK 基因減輕了氣體HCHO 脅迫下轉(zhuǎn)基因植株葉片中膜脂和蛋白質(zhì)的過氧化作用。

圖2 DAS 和DAK 基因在轉(zhuǎn)基因株系中整合與表達(dá)的分析A、B表示基因組PCR 檢測(cè)DAS（A）和DAK（B）基因在轉(zhuǎn)基因株系中的整合情況；C、D表示W(wǎng)estern blot分析DAS（C）和DAK（D）基因在轉(zhuǎn)基因株系中的表達(dá)情況；WT．野生型；PSK1、PSK4、PSK5．不同轉(zhuǎn)基因株系；PCK．陽性對(duì)照Fig．2 Analysis of the integration and expression of DASand DAK genes in transgenic lines Genomic PCR analysis to detect the integration of DAS（A）and DAK （B）genes in transgenic lines；Western blot analysis to detect the expression of DAS（C）and DAK （D）genes in transgenic lines；WT．Wild type；PSK1，PSK4，PSK5．Different transgenic lines；PCK．Positive control

圖3 13 C－NMR分析野生型和轉(zhuǎn)基因植株H13 CHO 和NaH13 CO3 代謝產(chǎn)物CK．野生型；H13CHO／WT．2mmol·L－1液體H13CHO 處理野生型；NaH13CO3／WT．5mmol·L－1液體NaH13CO3 處理野生型；H13CHO／PSK5．2mmol·L－1液體H13CHO 處理轉(zhuǎn)基因植株P(guān)SK5；不同字母表示在0．05水平有顯著性差異；下同F(xiàn)ig．3 13 C－NMR analysis of H13 CHO and NaH13 CO3 metabolites in wild type and transgenic plant CK．Wild type；H13CHO／WT．Wild type treated with 2mmol·L－1 liquid H13CHO；NaH13CO3／WT．Wild type treated with 5mmol·L－1 liquid NaH13CO3；H13CHO／PSK5．Transgenic plant PSK5treated with 2mmol·L－1 liquid H13CHO；Different letters indicate significant difference at the 0．05level．The same as below

圖4 氣體HCHO 脅迫下野生型和轉(zhuǎn)基因植株的生長狀態(tài)WT．野生型；PSK5．轉(zhuǎn)基因植株Fig．4 The growth statue of wild type and transgenic plant under gaseous HCHO stress WT．Wild type；PSK5．Transgenic plant

圖5 氣體HCHO 脅迫下野生型和轉(zhuǎn)基因植株葉片H2O2、MDA 和PC含量變化0h／WT．野生型；0h／PSK5．轉(zhuǎn)基因植株；24h／WT．48μg·L－1氣體HCHO 處理24h的野生型；24h／PSK5．48μg·L－1氣體HCHO 處理24h的轉(zhuǎn)基因植株P(guān)SK5Fig．5 Changes of the H2O2，MDA and PC contents in the leaves of wild type and transgenic plant under gaseous HCHO stress 0h／WT．Wild type；0h／PSK5．Transgenic plant；24h／WT．Wild type treated with 48μg·L－1 gaseous HCHO for 24h；24h／PSK5；Transgenic plant treated with 48μg·L－1 gaseous HCHO for 24h

圖6 野生型和轉(zhuǎn)基因株系HCHO 吸收能力（A）和氣孔傳導(dǎo)率（B）分析A．野生型和轉(zhuǎn)基因株系吸收柜內(nèi)氣體HCHO 能力分析；B．柜外處理野生型以及柜內(nèi)處理野生型和轉(zhuǎn)基因株系氣孔傳導(dǎo)率分析；CK1．空柜；CK2．柜外處理野生型，WT．野生型；PSK1、PSK4、PSK5．不同轉(zhuǎn)基因株系Fig．6 Analysis of the HCHO－uptake capacity（A）and stomatal conductances of wild type and transgenic lines（B）A．Analysis of the HCHO－uptake capacity of wild type and transgenic lines in cabine；B．Analysis of the stomatal conductance of wild type out－cabinet and wild type and transgenic lines in cabinet；CK1．Empty cabinet；CK2．Wild type placed out－cabinet；WT．Wild type；PSK1，PSK4，PSK5．Different transgenic lines

2．4 轉(zhuǎn)基因天竺葵吸收環(huán)境污染氣體HCHO 能力的分析

壓縮板在家具家裝中的使用非常廣泛，壓縮板中使用的樹脂脲醛，是室內(nèi)排放HCHO 的最大來源。用壓縮板材做成的柜子內(nèi)有一定濃度的HCHO 污染。為了考察過表達(dá)DAS／DAK 基因天竺葵吸收家具中釋放的氣體HCHO 的能力，對(duì)野生型和轉(zhuǎn)基因植株吸收家具中釋放的氣體HCHO的能力進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，柜內(nèi)的HCHO 濃度從8：00至18：00處理期間，空柜內(nèi)HCHO 濃度（CK1）先隨溫度上升而升高，到晚上溫度下降時(shí)回落至接近早上的水平（圖6，A）。放入天竺葵后柜內(nèi)HCHO 濃度在各個(gè)測(cè)定時(shí)間點(diǎn)都下降了。當(dāng)放入轉(zhuǎn) 基 因 植 株P(guān)SK1、PSK4 和PSK5 時(shí)，柜 子 內(nèi)HCHO 濃度在18：00 分別下降到野生型的63%、69%和58%（圖6，A），可見轉(zhuǎn)基因植株比野生型具有更強(qiáng)的吸收柜內(nèi)HCHO 的能力。

葉片對(duì)氣體HCHO 的吸收主要通過氣孔進(jìn)行，用光合測(cè)量系統(tǒng)測(cè)定了野生型和轉(zhuǎn)基因植株葉片的氣孔傳導(dǎo)率，結(jié)果表明（圖6，B），8：00 時(shí)柜內(nèi)野生型和3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系葉片的氣孔傳導(dǎo)率與柜外野生型（CK2）差別不大（P＞0．05），13：00、18：00和次日8：00測(cè)得的轉(zhuǎn)基因株系PSK1、PSK4和PSK5葉片氣孔傳導(dǎo)率均明顯高于野生型，而以13：00時(shí)差別最明顯，轉(zhuǎn)基因株系PSK1、PSK4 和PSK5 葉片的氣孔傳導(dǎo)率分別是野生型的2．5、2．7 和2．8倍，說明氣體HCHO 脅迫下，過表達(dá)DAS／DAK 基因使轉(zhuǎn)基因植株葉片的氣孔傳導(dǎo)率得以恢復(fù)。

3 討 論

Song等［10］和Xiao等［12］的研究發(fā)現(xiàn)，在植物體中引入與卡爾文循環(huán)相偶聯(lián)的代謝途徑，能夠促進(jìn)植物通過該途徑代謝HCHO，生成大量的糖類物質(zhì)。本研究也發(fā)現(xiàn)，在2mmol·L－1液體H13CHO處理下，轉(zhuǎn)基因天竺葵糖類質(zhì)的生成量大約是野生型的2．85倍，說明過表達(dá)DAS／DAK 基因所形成的HCHO 同化途徑成功將HCHO 代謝流引入卡爾文循環(huán)。但是，目前沒有研究報(bào)道與卡爾文循環(huán)相偶聯(lián)的代謝途徑的引入是否改變植物原有的HCHO 代謝途徑。本研究通過分析了其他重要HCHO 代謝產(chǎn)物在轉(zhuǎn)基因天竺葵葉片中含量的變化發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因天竺葵葉片中的［U－13C］Cit和［1－13C］Gly生成量顯著低于野生型，并且產(chǎn)生了［2－13C］Gly、［2－13C］Mal、［3－13C］Ser、［2－13C］Glu、［3－13C］Asp以及［3－13C］PA 等有機(jī)酸。研究表明，進(jìn)入植物體的HCHO 首先在HCHO 脫氫酶（FALDH）催化HCHO 下氧化為HCOOH，該反應(yīng)是可逆的，且不能直接以游離HCHO 為底物，HCHO 需要和谷胱甘肽（GSH）結(jié)合為加合物S－羥甲基谷胱甘肽（HM－GSH）才能被FALDH 催化，雖然FALDH 對(duì)HM－GSH 的Km 值很小，但HM－GSH 的濃度由細(xì)胞內(nèi)GSH 控制［17］。而DAS催化HCHO 和5－磷酸木酮糖的反應(yīng)是不可逆的，DAS 可以游離HCHO為底物，HCHO 的Km 值約為1．4 mmol·L－1，反應(yīng)不需要任何輔助因子參與就可以啟動(dòng)［18］。由于DAS和FALDH 催化反應(yīng)的生化特性不同，使得二者在同時(shí)競(jìng)爭結(jié)合進(jìn)入細(xì)胞中的HCHO 時(shí)，DAS催化的反應(yīng)更有優(yōu)勢(shì)，使得過表達(dá)DAS／DAK 基因所形成的HCHO 同化途徑發(fā)揮作用，增加了H13CHO 的13C代謝流進(jìn)入卡爾文循環(huán)的量，從而降低H13CHO 進(jìn)入其它代謝途徑的量。據(jù)此推測(cè)［U－13C］Cit和［1－13C］Gly可能是由FALDH 催化的下游代謝途徑所產(chǎn)生，而［2－13C］Gly、［2－13C］Mal、［3－13C］Ser、［2－13C］Glu、［3－13C］Asp以及［3－13C］PA是卡爾文循環(huán)的下游途徑產(chǎn)生的，至于這兩條途徑的下游途徑有待進(jìn)一步的研究。

Song等［10］研究表明，在天竺葵葉綠體中過量表達(dá)rmpAB 編碼的HPS／PHI融合蛋白基因，可以增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因天竺葵對(duì)HCHO 的抗性和吸收效率，Xiao等［12］在煙草葉綠體中過量表達(dá)DAS 和DAK基因也得到了類似的結(jié)果，且HCHO 吸收效率是Song等［10］的1．6倍。本研究發(fā)現(xiàn)，在48μg·L－1氣體HCHO 脅迫下，轉(zhuǎn)基因植株的生長狀態(tài)優(yōu)于野生型，H2O2、MDA 和PC 含量均低于野生型，同時(shí)吸收家具釋放的氣體HCHO 的能力也高于野生型，氣孔傳導(dǎo)率得以恢復(fù)，說明過表達(dá)DAS／DAK基因提高了轉(zhuǎn)基因天竺葵對(duì)HCHO 的抗性和吸收能力，這與前人的研究結(jié)果一致。本研究的結(jié)果再次證實(shí)了在植物葉綠體中過量表達(dá)來自于甲基型營養(yǎng)酵母中的DAS／DAK 基因，構(gòu)建一條光合HCHO 同化途徑提高植物吸收和代謝HCHO 能力的策略是可行的，這為今后開發(fā)轉(zhuǎn)基因觀賞植物治理氣體HCHO 污染的技術(shù)奠定了理論基礎(chǔ)。

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