定量蛋白質(zhì)組學(xué)揭示三角魴和團(tuán)頭魴響應(yīng)嗜水氣單胞菌侵染機(jī)制變化

方獻(xiàn)平, 朱麗敏, 劉凱, 阮松林, 許寶青, 謝楠, 蔡麗娟, 劉新軼, 戴瑜來(lái), 馮曉宇, 李忠全*

(1.杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院生物技術(shù)研究所,杭州310024；2.杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院水產(chǎn)研究所,杭州310024)

定量蛋白質(zhì)組學(xué)揭示三角魴和團(tuán)頭魴響應(yīng)嗜水氣單胞菌侵染機(jī)制變化

方獻(xiàn)平1, 朱麗敏2, 劉凱2, 阮松林1, 許寶青2, 謝楠2, 蔡麗娟2, 劉新軼2, 戴瑜來(lái)2, 馮曉宇2, 李忠全2*

(1.杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院生物技術(shù)研究所,杭州310024；2.杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院水產(chǎn)研究所,杭州310024)

細(xì)菌性敗血癥對(duì)魚(yú)類(lèi)危害嚴(yán)重,為探究魴屬魚(yú)類(lèi)不同抗性品種響應(yīng)病原菌嗜水氣單胞菌的抗性機(jī)制,以三角魴(高抗)和團(tuán)頭魴(易感)肝組織為材料,采用非標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分析其在嗜水氣單胞菌侵染脅迫后3、10和24 h與對(duì)照組0 h(未感染)肝組織蛋白質(zhì)組的變化,對(duì)差異表達(dá)蛋白質(zhì)進(jìn)行質(zhì)譜鑒定、相對(duì)定量和生物信息學(xué)分析。結(jié)果顯示:三角魴和團(tuán)頭魴在嗜水氣單胞菌侵染下,分別有46個(gè)和29個(gè)蛋白質(zhì)在侵染后各時(shí)期的表達(dá)豐度相比對(duì)照都發(fā)生了顯著變化。通過(guò)基因本體(gene ontology,GO)功能注釋發(fā)現(xiàn),相對(duì)于團(tuán)頭魴,三角魴中氧化還原蛋白質(zhì)比例從7%增加到13%,且發(fā)現(xiàn)一類(lèi)新的β-免疫球蛋白(β-globin)在各時(shí)期分別上調(diào)表達(dá)了1.64、3.44和1.93倍。生物信息學(xué)分析進(jìn)一步表明,三角魴在響應(yīng)嗜水氣單胞菌侵染過(guò)程中可能特異性地啟動(dòng)了包括戊糖磷酸途徑、脂肪酸代謝、亮氨酸代謝途徑和β-globin高表達(dá)的協(xié)同抗性機(jī)制,從而抵御病原菌入侵。該研究成果為后續(xù)深入揭示魚(yú)病互作分子機(jī)制及魴屬魚(yú)類(lèi)抗病新品種選育提供了重要的前期理論研究基礎(chǔ)。

三角魴; 團(tuán)頭魴; 嗜水氣單胞菌; 定量蛋白質(zhì)組學(xué)

魴屬(Megalobrama)魚(yú)類(lèi)隸屬鯉形目(Cypriniformes)、鯉科(Cyprinidae)、鲌亞科(Culterinae),主要包括三角魴(Megalobramaterminalis)、團(tuán)頭魴(Megalobramaamblycephala)、厚頜魴(Megalobramapellegrini)和廣東魴(Megalobramahoffmanni)4種。三角魴為魴屬最大個(gè)體種類(lèi)(2+齡),它主要分布于南嶺以北至黑龍江各淡水水系,棲息于中下水層,在自然條件下以黃蜆、螺螄、小蝦等為食,為偏肉食的雜食性魚(yú)類(lèi),在人工養(yǎng)殖條件下可攝食人工配合飼料。目前,團(tuán)頭魴為魴屬魚(yú)類(lèi)中養(yǎng)殖量最大種類(lèi)。近年來(lái),團(tuán)頭魴細(xì)菌性敗血癥頻發(fā),嚴(yán)重影響?zhàn)B殖效益，而三角魴養(yǎng)殖過(guò)程中未發(fā)現(xiàn)有大規(guī)模病害出現(xiàn)。因此,三角魴越來(lái)越受到養(yǎng)殖戶的青睞,在全國(guó)推廣面積不斷擴(kuò)大，而團(tuán)頭魴抗病性差,養(yǎng)殖治病成本高,難以實(shí)現(xiàn)無(wú)公害養(yǎng)殖。

細(xì)菌性敗血癥是團(tuán)頭魴的主要病害,流行季節(jié)長(zhǎng),發(fā)病時(shí)往往造成魚(yú)大批病死,病死率高達(dá)70%以上。據(jù)報(bào)道,此病在湖北、湖南、江西、福建、江蘇和上海等省市均有流行。魚(yú)體長(zhǎng)2.5～15 cm均有發(fā)病,2齡以上的團(tuán)頭魴也有發(fā)病，在水溫20～33 ℃時(shí)發(fā)生流行,最適流行水溫為27～30 ℃。當(dāng)水質(zhì)惡化,水中溶氧低,透明度低,水中總氮、有機(jī)氮、亞硝酸態(tài)氮和有機(jī)物耗氧量高時(shí)最為流行,即使水溫在12 ℃或34 ℃時(shí)也發(fā)病。團(tuán)頭魴感染敗血癥一般分3個(gè)階段：一是潛伏期。在此期間,魚(yú)的外表未顯示出任何癥狀,活動(dòng)與攝食正常。潛伏期的長(zhǎng)短與水溫及細(xì)菌濃度有密切關(guān)系,水溫高,細(xì)菌濃度高,潛伏期短；反之,則長(zhǎng)。二是前趨期。時(shí)間短,僅1～2 d左右,魚(yú)的體色發(fā)暗變黑,離群獨(dú)游,停止攝食。三是發(fā)展期。時(shí)間長(zhǎng)短不一,一般為2～3 d,病魚(yú)表現(xiàn)充血、出血癥狀而病死。

隨著研究的日漸深入及其相關(guān)技術(shù)的不斷完善,蛋白質(zhì)組學(xué)作為當(dāng)今生命科學(xué)的研究熱點(diǎn),已經(jīng)成為生物學(xué)中破譯基因功能、貢獻(xiàn)于育種程序和探討相關(guān)病害抗性機(jī)制的重要途徑。如今,蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)已經(jīng)成為研究外界脅迫誘導(dǎo)動(dòng)植物響應(yīng)機(jī)制的強(qiáng)有力工具[1-2]。陳強(qiáng)等[3]利用雙向電泳技術(shù)對(duì)陸封型和洄游型香魚(yú)體腎組織進(jìn)行差異蛋白質(zhì)組學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)環(huán)境應(yīng)激和能量代謝等層面有明顯的蛋白質(zhì)表達(dá)差異；朱佳杰等[4-5]建立和優(yōu)化了吉富羅非魚(yú)肝蛋白質(zhì)組雙向電泳技術(shù)體系,并進(jìn)一步研究了吉富羅非魚(yú)肝在無(wú)乳鏈球菌脅迫下發(fā)生的蛋白質(zhì)組變化；李明云等[6]研究了低溫脅迫下大黃魚(yú)肝蛋白質(zhì)組變化。由此可見(jiàn),蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)已經(jīng)被廣泛用于各種魚(yú)類(lèi)的生長(zhǎng)發(fā)育和抗逆機(jī)制研究,在魚(yú)類(lèi)的生物化學(xué)及其分子機(jī)制解析中發(fā)揮了重要的作用。

三角魴和團(tuán)頭魴同為魴類(lèi),親緣關(guān)系相近,但兩者的抗病性差異卻很大。因此,本研究試圖利用非標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)比較三角魴和團(tuán)頭魴對(duì)細(xì)菌性敗血癥病菌響應(yīng)的蛋白質(zhì)組表達(dá)差異,找出三角魴對(duì)細(xì)菌性敗血癥病菌特異響應(yīng)的蛋白質(zhì),以期闡明其抗病性機(jī)制,為今后抗病基因克隆和分子育種及生物抗病制劑研發(fā)提供重要研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)用三角魴和團(tuán)頭魴由浙江省杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院水產(chǎn)研究所提供,嗜水氣單胞菌株分離來(lái)自江蘇武進(jìn)某養(yǎng)殖場(chǎng)(經(jīng)過(guò)回歸再分離),采用VITEK-32全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀鑒定。

1.2 致病性實(shí)驗(yàn)

選擇體表無(wú)傷的健康三角魴和團(tuán)頭魴作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,分別設(shè)5組,每組10尾。將分離純化的24 h培養(yǎng)物,用無(wú)菌0.75%氯化鈉溶液洗下菌苔,制成含量為5.0×1010、5.0×108、5.0×106和5.0×104CFU/mL的菌懸液,進(jìn)行腹腔注射感染,注射劑量0.1 mL/尾。同時(shí)設(shè)對(duì)照組,注射0.1 mL/尾的0.75%氯化鈉溶液。置水族玻璃缸飼養(yǎng)24 h,水溫控制在(20±2) ℃,觀察結(jié)果,計(jì)算半數(shù)致死量LD50,用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。經(jīng)實(shí)驗(yàn)計(jì)算確定菌株對(duì)三角魴和團(tuán)頭魴的半數(shù)致死量LD50分別為1.05×108和5.90×106CFU/mL。解剖觀察病死魚(yú),發(fā)現(xiàn)肝腫大,腎、腸道充血,與養(yǎng)殖中發(fā)病癥狀基本相同,對(duì)照組未見(jiàn)明顯異常癥狀,試驗(yàn)魚(yú)活動(dòng)、攝食正常。選擇健康體形大小均一的三角魴和團(tuán)頭魴各20尾,體質(zhì)量130.5～150.5 g,對(duì)魚(yú)體進(jìn)行嗜水氣單胞菌腹腔注射。實(shí)驗(yàn)所用致病菌劑量為108CFU/mL,注射量為0.1 mL/尾,分別于感染0、3、10和24 h各取1次樣,每次(每個(gè)時(shí)間點(diǎn))各取魚(yú)5尾(具體實(shí)驗(yàn)線路見(jiàn)圖1),在冰上進(jìn)行活體解剖后取肝組織,放入凍存管稱量,液氮凍存帶回實(shí)驗(yàn)室-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 肝蛋白質(zhì)的提取及定量

分別將每次樣的5尾魚(yú)的肝組織混合剪碎,盡量去除脂肪組織和結(jié)締組織等非目的組織,加入適量的冰冷磷酸鹽緩沖液洗滌2次后,4 ℃,800 r/min離心2 min,去上清液,取沉淀組織放入研缽中,加入適量液氮進(jìn)行研磨至粉末狀。稱取0.1 g粉末,加入1 mL裂解液(8 mol/L尿素、10 mmol/L二硫蘇糖醇、2 mmol/L乙二胺四乙酸和1 mmol/L苯甲基磺酰氟)中,振蕩混勻,4 ℃放置1 h,期間取出振蕩3～5次；再于4 ℃,13 000 r/min高速離心20 min以沉淀組織碎片,取上清液后用預(yù)冷的丙酮沉淀,再用裂解液復(fù)溶即為肝組織總蛋白質(zhì),用考馬斯亮藍(lán)法蛋白質(zhì)定量并用聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)總蛋白質(zhì)提取質(zhì)量,分裝并保存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4 蛋白質(zhì)溶液內(nèi)酶解與除鹽

取約100 μg蛋白質(zhì)樣本酶解,按1/10體積加入100 mmol/L二硫蘇糖醇(Sigma公司)至最終為10 mmol/L,56 ℃還原反應(yīng)1 h。冷卻至室溫后,按1/10體積加入500 mmol/L碘乙酰胺(Sigma公司)至最終為50 mmol/L,避光反應(yīng)45 min。按1/10體積加入100%的三氯乙酸(Sigma公司)至最終為10%,4 ℃沉淀2 h，用冷丙酮洗3次后離心得沉淀顆粒,溶于100 mmol/L NH4HCO3,超聲5 min。在此蛋白質(zhì)混合物中,按酶與蛋白質(zhì)質(zhì)量比1∶50加入胰酶(Promega公司),37 ℃反應(yīng)12 h，為保證充分酶解,12 h后再按上述比例加入胰酶,37 ℃反應(yīng)4 h。酶解后的肽段經(jīng)凱杰公司的C18柱除鹽,后進(jìn)行真空干燥。

1.5 液質(zhì)鑒定與差異蛋白質(zhì)相對(duì)定量分析

將真空干燥后的肽段,用0.1%甲酸的水溶液復(fù)溶至0.5 μg/μL,在轉(zhuǎn)速為13 000 r/min下離心10 min,除去不溶物質(zhì),每個(gè)組分上樣4 μL(約2 μg蛋白質(zhì))。采用EASY-nLC 1000納升級(jí)液相色譜和Q-Exactive高分辨率質(zhì)譜液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)(Thermo Fisher公司),對(duì)各個(gè)時(shí)期的樣品肽段進(jìn)行LC-MS/MS鑒定。流動(dòng)相A液:含0.1%甲酸(Thermo Fisher公司)的水溶液;B液:含0.1%甲酸的乙腈(Thermo Fisher公司)。線性洗脫梯度(B液):1%～40%,120 min；40%～65%,5 min；65%,保持5 min；65%～1%,1 min；1%,20 min平衡。流速為200 nL/min。Q-Exactive質(zhì)譜掃描范圍m/z為350～1 800,每個(gè)一級(jí)譜圖自動(dòng)選擇3個(gè)最強(qiáng)母離子進(jìn)行二級(jí)掃描,每個(gè)樣品質(zhì)譜鑒定為3次重復(fù)。

鑒于三角魴和團(tuán)頭魴為非模式生物,基因組序列未知,所以蛋白質(zhì)搜庫(kù)為NCBI中斑馬魚(yú)模式生物數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein,Daniorerio,81514 sequences)進(jìn)行同源搜庫(kù)比對(duì),搜庫(kù)鑒定軟件為Proteome Discoverer 1.4,借助Thermo Fisher Sieve 2.2軟件對(duì)差異表達(dá)的蛋白質(zhì)譜峰強(qiáng)度比對(duì),進(jìn)行相對(duì)定量分析(P<0.05)。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析

為了進(jìn)一步了解通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)篩查得到的蛋白質(zhì)對(duì)應(yīng)的mRNA表達(dá)情況,我們選取了蛋白質(zhì)組學(xué)中4個(gè)蛋白質(zhì)(NCBI搜庫(kù)編號(hào)分別為18858695、56744251、41056111和50539724)對(duì)應(yīng)的基因進(jìn)行了mRNA表達(dá)水平的分析。在NCBI中利用BLASTp比對(duì)挑選每個(gè)蛋白質(zhì)的同源序列,利用CODEHOP軟件在保守區(qū)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物(GDP),擴(kuò)增cDNA中間片段,使用軟件Primer 5.0設(shè)計(jì)5′端和3′端的RACE擴(kuò)增特異性引物(GSP)。所有引物均由生工生物工程(上海)有限公司合成。本實(shí)驗(yàn)中所用到的引物序列及相應(yīng)的退火溫度(Tm)見(jiàn)表1。

提取魚(yú)肝總RNA,合成cDNA第1鏈,分別采用各基因的簡(jiǎn)并引物GDP-S和GDP-A擴(kuò)增cDNA中間片段。利用基因特異性引物5′-GSP和3′-GSP繼續(xù)進(jìn)行5′端和3′端的RACE反應(yīng)。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳、切膠純化、連接、轉(zhuǎn)化和測(cè)序,利用軟件拼接各基因全長(zhǎng)cDNA序列。根據(jù)拼接序列設(shè)計(jì)全長(zhǎng)特異上下游引物GFP-S和GFP-A,PCR擴(kuò)增各基因全長(zhǎng)cDNA序列。

分別提取不同病菌處理樣本總RNA,反轉(zhuǎn)錄得到cDNA模板。以磷酸甘油醛脫氫酶基因(登記號(hào)：BC083506)作為內(nèi)參,根據(jù)內(nèi)參基因序列和各基因cDNA全長(zhǎng)序列設(shè)計(jì)定量PCR引物GRTP-S和GRTP-A,利用SYBR Green Realtime PCR Master Mix Kit (Toyobo, Japan)在ABI PRISM 7500實(shí)時(shí)定量PCR儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)。樣本和內(nèi)參分別設(shè)定3個(gè)重復(fù),以0 h處理作為對(duì)照,以各取樣時(shí)間點(diǎn)內(nèi)參基因的表達(dá)量為標(biāo)準(zhǔn)來(lái)確定目標(biāo)基因的相對(duì)表達(dá)量。根據(jù)測(cè)得的CT值,利用2-ΔΔCT法計(jì)算不同侵染時(shí)期各基因的相對(duì)表達(dá)量。

表1 基因RT-PCR引物

1.7 生物信息學(xué)分析

利用Uniprot蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.ebi.uniprot.org)對(duì)所鑒定的各蛋白質(zhì)進(jìn)行基因本體(gene ontology,GO)注釋,依據(jù)細(xì)胞學(xué)組分、分子功能及生物學(xué)過(guò)程屬性,對(duì)三角魴和團(tuán)頭魴不同時(shí)期表達(dá)的共性差異蛋白質(zhì)分別進(jìn)行GO分析。用MultiExperiment Viewer 4.3軟件對(duì)差異蛋白質(zhì)進(jìn)行差異表達(dá)圖譜聚類(lèi)分析。利用KEGG的網(wǎng)絡(luò)信號(hào)數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.genome.jp/kegg/pathway.html)對(duì)鑒定到的重要差異蛋白質(zhì)進(jìn)行匹配,挖掘在病菌侵染下,由差異蛋白質(zhì)表達(dá)變化導(dǎo)致發(fā)生改變的重要代謝信號(hào)通路(P<0.05)。總體實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)思路如圖1。

圖1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)流程圖Fig.1 Flow chart of experimental design

2 結(jié)果

2.1 嗜水氣單胞菌脅迫下三角魴和團(tuán)頭魴肝組織蛋白質(zhì)組變化

在嗜水氣單胞菌的侵染下,三角魴肝組織蛋白質(zhì)在侵染后0、3、10和24 h檢測(cè)匹配鑒定到的蛋白質(zhì)數(shù)分別為138、274、243和152個(gè)。其中由于病菌侵染,造成4個(gè)時(shí)期發(fā)生表達(dá)變化的共性差異蛋白質(zhì)為46個(gè)(圖2A,表2)。相應(yīng)在嗜水氣單胞菌的侵染0、3、10和24 h后,團(tuán)頭魴肝組織檢測(cè)鑒定到的蛋白質(zhì)數(shù)分別為192、194、271和125個(gè),其中不同時(shí)期共性應(yīng)答差異蛋白質(zhì)29個(gè)(圖2B和表3)。從三角魴和團(tuán)頭魴應(yīng)答蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量分布范圍來(lái)看,兩者應(yīng)答蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量大小分布類(lèi)似,分子質(zhì)量大部分也都集中在pI 5～11之間；三角魴中應(yīng)答蛋白質(zhì)則更多傾向于堿性蛋白質(zhì),較為明顯地聚集成pI 7～9和pI 9～10的2個(gè)類(lèi)群,而團(tuán)頭魴中應(yīng)答蛋白質(zhì)在此范圍等電點(diǎn)分布較為均勻(圖2C,D)。

A:三角魴在病菌侵染后鑒定到的蛋白質(zhì)個(gè)數(shù)韋恩圖；B:團(tuán)頭魴在病菌侵染后鑒定到的蛋白質(zhì)個(gè)數(shù)韋恩圖；C:三角魴不同時(shí)間點(diǎn)的46個(gè)共性應(yīng)答蛋白質(zhì)分子質(zhì)量及等電點(diǎn)分布示意圖；D:團(tuán)頭魴不同時(shí)間點(diǎn)的29個(gè)共性應(yīng)答蛋白質(zhì)分子質(zhì)量及等電點(diǎn)分布示意圖。 A: Venn chart of the identified proteins in M. terminalis; B: Venn chart of the identified proteins in M. amblycephala; C: Schematic diagram of 46 proteins in M. terminalis based on molecular mass and isoelectric point; D: Schematic diagram of 29 proteins in M. amblycephala based on molecular mass and isoelectric point.圖2 三角魴和團(tuán)頭魴肝在嗜水氣單胞菌侵染不同時(shí)間點(diǎn)應(yīng)答蛋白質(zhì)鑒定個(gè)數(shù)情況圖Fig.2 Summary charts of total identified responsive proteins of M. terminalis and M. amblycephala infected with A. hydrophila at different time points

表2 三角魴肝感染嗜水氣單胞菌不同時(shí)間點(diǎn)的46個(gè)共性差異蛋白質(zhì)表達(dá)變化情況

續(xù)表2 三角魴肝感染嗜水氣單胞菌不同時(shí)間點(diǎn)的46個(gè)共性差異蛋白質(zhì)表達(dá)變化情況

表3 團(tuán)頭魴肝感染嗜水氣單胞菌不同時(shí)間點(diǎn)的29個(gè)共性差異蛋白質(zhì)表達(dá)變化情況

2.2 部分蛋白質(zhì)mRNA在不同侵染時(shí)期的表達(dá)情況

為了進(jìn)一步探索和驗(yàn)證部分發(fā)育相關(guān)蛋白質(zhì)mRNA在不同侵染時(shí)期的表達(dá)變化,我們選取了4個(gè)蛋白質(zhì)進(jìn)行對(duì)應(yīng)mRNA表達(dá)水平分析。實(shí)驗(yàn)表明,在不同發(fā)育階段,丙酮酸羧化酶(圖3A)、過(guò)氧化氫酶(圖3B)和尿酸氧化酶(圖3D)在轉(zhuǎn)錄水平上的變化趨勢(shì)與蛋白質(zhì)表達(dá)水平呈現(xiàn)較好的一致性,而葡萄糖磷酸異構(gòu)酶(圖3C)在蛋白質(zhì)和mRNA的表達(dá)變化趨勢(shì)上并不很一致,甚至出現(xiàn)轉(zhuǎn)錄水平持續(xù)增高,而蛋白質(zhì)卻有表達(dá)程度下調(diào)的情況。出現(xiàn)這一現(xiàn)象原因可能是部分mRNA經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)錄后調(diào)控、降解和翻譯后修飾等的影響,從而導(dǎo)致了后期蛋白質(zhì)翻譯表達(dá)水平的降低。

A:丙酮酸羧化酶；B:過(guò)氧化氫酶；C:葡萄糖磷酸異構(gòu)酶；D:尿酸氧化酶.A: Pyruvate carboxylase； B: Catalase； C: Phosphoglucomutase； D: Uricase.圖3 4個(gè)蛋白質(zhì)與其對(duì)應(yīng)mRNA的表達(dá)變化情況Fig.3 mRNA and protein expression levels of four protein and corresponding genes

圖4 三角魴和團(tuán)頭魴分別響應(yīng)嗜水氣單胞菌侵染的不同時(shí)間點(diǎn)共性應(yīng)答蛋白質(zhì)的基因本體分析餅狀圖Fig.4 Pie charts of common identified responsive proteins of M. terminalis and M. amblycephala infected with A. hydrophila at different time points based on gene ontology

2.3 差異表達(dá)蛋白質(zhì)GO注釋功能分析

對(duì)三角魴和團(tuán)頭魴的差異應(yīng)答蛋白質(zhì)進(jìn)行GO功能注釋。在應(yīng)答蛋白質(zhì)參與生物學(xué)過(guò)程中,發(fā)現(xiàn)2種魚(yú)類(lèi)對(duì)病菌的響應(yīng)蛋白質(zhì)多集中在糖類(lèi)合成代謝、丙酮酸代謝、碳水化合物合成分解、轉(zhuǎn)錄翻譯和氧化還原等生物過(guò)程中；而高抗品種三角魴對(duì)嗜水氣單胞菌的響應(yīng)中出現(xiàn)了更多地參與氧化還原反應(yīng)的蛋白質(zhì)(13%),并且發(fā)現(xiàn)了參與低氧反應(yīng)相關(guān)的蛋白質(zhì)(圖4A,B)。在對(duì)兩者的響應(yīng)蛋白質(zhì)進(jìn)行細(xì)胞組分分析時(shí)發(fā)現(xiàn),差異蛋白質(zhì)往往富集在內(nèi)膜細(xì)胞器、核糖體和核蛋白復(fù)合體等區(qū)域，而團(tuán)頭魴應(yīng)答病菌脅迫過(guò)程中出現(xiàn)了參與中間纖維組成的響應(yīng)蛋白質(zhì),三角魴出現(xiàn)的特異應(yīng)答蛋白質(zhì)中有15%和3%分別富集在無(wú)膜細(xì)胞器和珠蛋白復(fù)合體中(圖4C,D)。在對(duì)兩者響應(yīng)蛋白質(zhì)的分子功能聚類(lèi)時(shí)發(fā)現(xiàn),除了兩者應(yīng)答蛋白質(zhì)中共同參與的結(jié)構(gòu)分子活性、核糖體結(jié)構(gòu)組成、維生素連接和輔酶連接等分子功能之外,嗜水氣單胞菌誘導(dǎo)高抗品種三角魴中參與血紅素連接和氧氣轉(zhuǎn)運(yùn)的相關(guān)蛋白質(zhì)活性發(fā)生了變化(圖4E,F)。

2.4 差異表達(dá)蛋白質(zhì)表達(dá)圖譜聚類(lèi)分析

用MultiExperiment Viewer軟件對(duì)三角魴和團(tuán)頭魴的定量蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)：在嗜水氣單胞菌的侵染下,團(tuán)頭魴肝中約40%的蛋白質(zhì)表達(dá)發(fā)生上調(diào),包括丙酮酸羧激酶、丙酮酸羧化酶和尿酸氧化酶等；其他蛋白質(zhì)如葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶、丙氨酸-乙醛酸轉(zhuǎn)氨酶和β-球蛋白等表達(dá)豐度都發(fā)生了下調(diào)。而三角魴肝約達(dá)70%的蛋白質(zhì)表達(dá)豐度增強(qiáng)(圖5),如有與團(tuán)頭魴中同樣監(jiān)測(cè)到表達(dá)豐度上調(diào)的丙酮酸羧激酶和丙酮酸羧化酶,以及酰輔酶A脫氫酶和存在于線粒體內(nèi)的延胡索酸水化酶等,還有部分蛋白質(zhì)如磷酸葡萄糖變位酶在三角魴中表達(dá)上調(diào),而團(tuán)頭魴中卻呈表達(dá)下調(diào)趨勢(shì)；揭示三角魴在病菌侵染時(shí)可能啟動(dòng)了更多的基因參與翻譯表達(dá)更多的抗性蛋白質(zhì),從而抵御嗜水氣單胞菌的侵染。

紅色表示蛋白質(zhì)表達(dá)上調(diào),綠色表示下調(diào).A:三角魴在不同時(shí)間點(diǎn)46個(gè)共性應(yīng)答蛋白質(zhì)聚類(lèi)分析圖；B:團(tuán)頭魴在不同時(shí)間點(diǎn)29個(gè)共性應(yīng)答蛋白質(zhì)聚類(lèi)分析圖。 Red indicates up-regulation, and green indicates down-regulation. A: Clustering chart of 46 proteins in M. terminalis; B: Clustering chart of 29 proteins in M. amblycephala. 圖5 嗜水氣單胞菌侵染下三角魴和團(tuán)頭魴應(yīng)答蛋白質(zhì)的聚類(lèi)表達(dá)分析圖Fig.5 Clustering charts of common identified responsive proteins of M. terminalis and M. amblycephala infected with A. hydrophila at different time points based on expression level

表示在應(yīng)答蛋白質(zhì)中發(fā)現(xiàn)參與該代謝通路的蛋白質(zhì)個(gè)數(shù)。A:三角魴在病菌不同時(shí)間點(diǎn)共性應(yīng)答蛋白質(zhì)團(tuán)頭魴的響應(yīng)蛋白質(zhì)參與的代謝信號(hào)路徑；B:團(tuán)頭魴在病菌不同時(shí)間點(diǎn)共性應(yīng)答蛋白質(zhì)團(tuán)頭魴的響應(yīng)蛋白質(zhì)參與的代謝信號(hào)路徑。 indicates the number of corresponding proteins found in each pathway. A： Pathway involving in the A. hydrophila-resistence process of M. terminalis； B： Pathway involving in the A. hydrophila-resistence process of M. amblycephala。 圖6 嗜水氣單胞菌侵染下三角魴和團(tuán)頭魴應(yīng)答蛋白質(zhì)參與的代謝通路Fig.6 Pathway involving in the A. hydrophila-resistence process of M. terminalis and M. amblycephala

2.5 病菌侵染下不同的代謝信號(hào)應(yīng)答通路

將非標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果比對(duì)KEGG的信號(hào)通路發(fā)現(xiàn)：在嗜水氣單胞菌的侵染下,團(tuán)頭魴中包括糖酵解與異生、核糖體生成、三羧酸循環(huán)和丙酮酸代謝等多條代謝通路都發(fā)生了變化(圖6)。團(tuán)頭魴和三角魴中鑒定到的甘油醛-3-磷酸脫氫酶、葡萄糖磷酸變位酶、磷酸甘油酸激酶、磷酸丙糖異構(gòu)酶和丙酮酸羧激酶等都參與了糖酵解與糖異生途徑,但是大部分在此途徑中鑒定到的酶類(lèi)如葡萄糖磷酸變位酶和磷酸丙糖異構(gòu)酶在2種魚(yú)類(lèi)應(yīng)答病菌侵染過(guò)程中表達(dá)程度都有所不同。在參與核糖體生成的途徑中,團(tuán)頭魴中鑒定到了核糖體蛋白L7、S14、L18a、S20和S30,三角魴中發(fā)現(xiàn)了核糖體蛋白S3、S19、S23、L18和L19等表達(dá)程度都發(fā)生了明顯變化。在參與三羧酸循環(huán)和丙酮酸代謝過(guò)程中,2種魚(yú)類(lèi)都無(wú)一例外地發(fā)現(xiàn)了丙酮酸羧化酶和羧激酶在病菌侵染后表達(dá)程度發(fā)生了改變(表2,表3)。更為重要的是,三角魴中除了上述幾條共同的應(yīng)答途徑外,還啟動(dòng)了包括戊糖磷酸途徑、脂肪酸代謝和亮氨酸代謝等更多的代謝信號(hào)通路,揭示這些信號(hào)代謝途徑的參與很可能在三角魴抵御嗜水氣單胞菌的侵染過(guò)程中發(fā)揮的重要作用。

3 討論

肝是物質(zhì)代謝、清除毒素和參與各種抗病信號(hào)轉(zhuǎn)換的重要器官。肝除了參與各種代謝外,不僅可以促成多種紅細(xì)胞和血漿蛋白質(zhì)的生成,起到對(duì)外源物質(zhì)的解毒作用,還可以參與脂肪酸代謝,將脂肪酸運(yùn)送到其他部位。由于肝良好的代謝能力和解毒作用,本研究利用非標(biāo)定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)探究了不同魴類(lèi)抗性品種對(duì)嗜水氣單胞菌的抗性機(jī)制。

研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)嗜水氣單胞菌誘使三角魴調(diào)動(dòng)了更多的基因差異表達(dá),引起了更多的蛋白質(zhì)豐度上的差異變化,從而在代謝信號(hào)通路上采取了更多的病菌防御策略,以下著重對(duì)這些病菌侵染下不同響應(yīng)的代謝通路作一討論。

3.1 三角魴和團(tuán)頭魴在嗜水氣單胞菌侵染下共同應(yīng)答的代謝途徑

3.1.1 糖酵解與糖異生途徑 糖酵解是指細(xì)胞在細(xì)胞質(zhì)中分解葡萄糖生成丙酮酸的過(guò)程,而糖異生與糖酵解相反,是由簡(jiǎn)單的非糖前體轉(zhuǎn)變?yōu)樘堑南盗袕?fù)雜過(guò)程。生物體在病菌侵染過(guò)程中,除了核酸、蛋白質(zhì)等發(fā)生快速反應(yīng)之外,糖類(lèi)物質(zhì)也往往參與應(yīng)答過(guò)程中[7-8]。病菌的侵染與宿主對(duì)病菌的抗性抵御反應(yīng)之間所需的能量消耗,必然存在的強(qiáng)烈的競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系,碳水化合物代謝在其中會(huì)起到重要的生理作用,病原菌的侵入往往使宿主體內(nèi)的糖含量發(fā)生明顯改變[9-10]。本研究中發(fā)現(xiàn)無(wú)論在高抗品種三角魴還是易感品種團(tuán)頭魴中,糖代謝是2類(lèi)魚(yú)采取的最為主要的應(yīng)答途徑之一,揭示糖代謝的變化與2類(lèi)魚(yú)的抗病反應(yīng)之間有著密切的關(guān)系,也說(shuō)明糖代謝往往是生物體逆境脅迫過(guò)程的重要應(yīng)答途徑之一[11]。

3.1.2 核糖體生成、三羧酸循環(huán)和丙酮酸代謝 核糖體是生物體內(nèi)合成各種蛋白質(zhì)的重要器官,主要由核糖體RNA和核糖體蛋白組成，核糖體蛋白不僅能參與新蛋白質(zhì)的生物合成,而且能參與DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯過(guò)程中,調(diào)控細(xì)胞凋亡和轉(zhuǎn)化,積極參與動(dòng)植物的逆境脅迫過(guò)程[12]。本研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn),2種魚(yú)類(lèi)肝中有大量的核糖體蛋白(如S20、S30、S23、L18和L19等)表達(dá)豐度在嗜水氣單胞菌的應(yīng)答過(guò)程中都發(fā)生了重要改變,提示核糖體生成很有可能是魚(yú)類(lèi)參與抗病反應(yīng)的因素之一。另外,本研究中還發(fā)現(xiàn),三羧酸循環(huán)和丙酮酸代謝中有關(guān)的酶(丙酮酸羧化酶和羧激酶)活性在病原菌侵染后發(fā)生明顯改變,很可能意味著這些酶活性的改變,可進(jìn)一步誘導(dǎo)和激活體內(nèi)代謝系統(tǒng),從而增強(qiáng)魚(yú)體的抗病性。

3.2 三角魴在嗜水氣單胞菌侵染下特異應(yīng)答的代謝途徑

3.2.1 戊糖磷酸途徑 戊糖磷酸途徑是除了糖酵解和三羧酸循環(huán)途徑以外的另一條非常重要的糖類(lèi)代謝通路。不同于糖酵解和三羧酸循環(huán),戊糖磷酸途徑生成了很多中間產(chǎn)物,如丙糖、丁糖和戊糖等,最后轉(zhuǎn)化為磷酸果糖[13]。在團(tuán)頭魴和三角魴的抗病反應(yīng)中,戊糖磷酸途徑開(kāi)始參與到三角魴抗病反應(yīng)中,這一現(xiàn)象的原因很有可能是三角魴在嗜水氣單胞菌脅迫過(guò)程中,啟動(dòng)了戊糖磷酸途徑在其他糖類(lèi)代謝途徑中的比例,除了供給動(dòng)物本身抗逆反應(yīng)所需的能量之外,還生成很多的中間產(chǎn)物,積極緊密地參與到其他代謝過(guò)程中起到協(xié)同抗性作用,如戊糖磷酸途徑中的磷酸核酮糖是合成DNA的原料,磷酸己糖和磷酸丙糖可以重新進(jìn)入糖酵解途徑。

3.2.2 脂肪酸代謝和氨基酸代謝 脂肪酸對(duì)于維持細(xì)胞膜完整性、調(diào)節(jié)細(xì)胞的免疫功能意義重大。很多研究表明脂肪酸在魚(yú)類(lèi)的抗病免疫中都發(fā)揮著重要作用[14-24]。如脂肪酸值的增大能增加魚(yú)體內(nèi)的過(guò)氧化物酶和超氧化物歧化酶活性[17],往魚(yú)飼料中添加脂肪酸能增加大菱鲆的溶菌酶活性[18],Puangkaew等[21]在虹鱒魚(yú)體內(nèi)增加脂肪酸的實(shí)驗(yàn)中,更是檢測(cè)到了魚(yú)巨噬細(xì)胞中細(xì)菌能力的提高和免疫抗體的增加。本研究中發(fā)現(xiàn)脂肪酸代謝通路中關(guān)鍵酶乙酰輔酶A脫氫酶在病菌侵染后活性持續(xù)增強(qiáng),而乙醛脫氫酶在經(jīng)歷前期的下調(diào)后也開(kāi)始表達(dá)上升,說(shuō)明在三角魴肝中脂肪酸代謝通路中相關(guān)酶活性的高強(qiáng)度表達(dá),是生成相關(guān)脂肪酸產(chǎn)物抵御病菌侵染的積極反應(yīng)。本研究中發(fā)現(xiàn)的參與氨基酸代謝相關(guān)的酶類(lèi),主要集中在亮氨酸和異亮氨酸的代謝通路上,揭示亮氨酸及其異構(gòu)體在三角魴抗病反應(yīng)中可能發(fā)揮一定的作用。

3.3β-球蛋白

目前,對(duì)于草魚(yú)、鱖魚(yú)、牙鲆、石斑魚(yú)和斑馬魚(yú)等都進(jìn)行了相應(yīng)的免疫球蛋白的研究[25-27],免疫球蛋白已經(jīng)被越來(lái)越多的實(shí)驗(yàn)證實(shí)在魚(yú)類(lèi)抗病研究中發(fā)揮著重要作用[28]。如果能針對(duì)免疫球蛋白的抗原表位,制備生產(chǎn)相應(yīng)的單克隆或多克隆抗體,從而對(duì)魚(yú)類(lèi)免疫器官中產(chǎn)生抗體的細(xì)胞或組織進(jìn)行定位研究,探索免疫器官在疾病防御中的響應(yīng)機(jī)制,對(duì)魚(yú)類(lèi)應(yīng)用疫苗的研發(fā)也具有重要的指導(dǎo)意義。本研究中發(fā)現(xiàn)了三角魴肝內(nèi)一類(lèi)重要β-球蛋白在病原菌侵染后各時(shí)期分別比對(duì)照增強(qiáng)表達(dá)了1.64、3.44和1.93倍。β-球蛋白在本研究中高強(qiáng)度表達(dá)有著極為重要的科學(xué)意義,預(yù)示其很有可能是作為嗜水氣單胞菌抗病相關(guān)的一類(lèi)免疫球蛋白,對(duì)其進(jìn)行后續(xù)深入研究具有一定的價(jià)值意義。

4 結(jié)論

綜上所述,本研究定量分析了不同感抗品種團(tuán)頭魴和三角魴感染嗜水氣單胞菌前后4個(gè)時(shí)期肝組織蛋白質(zhì)組的表達(dá)變化,發(fā)現(xiàn)了不同抗性魚(yú)類(lèi)品種之間的差異信號(hào)響應(yīng)通路,預(yù)示了不同抗性魚(yú)類(lèi)品種對(duì)嗜水氣單胞菌的可能抗性應(yīng)答機(jī)制。本研究結(jié)果為進(jìn)一步深入揭示研究嗜水氣單胞菌與魚(yú)類(lèi)的相互作用機(jī)制提供了支撐,為后續(xù)魴魚(yú)類(lèi)細(xì)菌性敗血癥相關(guān)抗體的研制及魚(yú)類(lèi)抗病品種選育奠定了前期理論研究基礎(chǔ)。

[1] Pandey A, Mann M. Proteomics to study genes and genomes.Nature, 2000,405(6788):837-846．

[2] Fang X P, Chen W Y, Xin Y,etal. Proteomic analysis of strawberry leaves infected withColletotrichumfragariae.JournalofProteomics, 2012,75(13):4074-4090.

[3] 陳強(qiáng),陸新江,黃左安,等.陸封型和洄游型香魚(yú)體腎組織的蛋白質(zhì)組學(xué)分析.生物學(xué)雜志,2014,31(2):13-17. Chen Q, Lu X J, Huang Z A,etal. The proteome analysis of the trunk kidney between land-locked type and amphidromous type ayu (Plecoglossusaltivelis).JournalofBiology, 2014,31(2):13-17. (in Chinese with English abstract)

[4] 朱佳杰,沈夏霜,付強(qiáng),等.吉富羅非魚(yú)肝臟蛋白質(zhì)組雙向電泳技術(shù)的建立與優(yōu)化.西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2013,26(5):2122-2126. Zhu J J, Shen X S, Fu Q,etal. Establishment and optimization analysis of two-dimensional electrophoresis system on GIFT tilapia liver.SouthwestChinaJournalofAgriculturalSciences, 2013,26(5):2122-2126. (in Chinese with English abstract)

[5] 朱佳杰,沈夏霜,付強(qiáng),等.吉富羅非魚(yú)感染無(wú)乳鏈球菌后肝臟組織在不同時(shí)期蛋白質(zhì)組的表達(dá)差異.水產(chǎn)學(xué)報(bào),2013,37(12):1821-1828. Zhu J J, Shen X S, Fu Q,etal. Proteome analysis of GIFT tilapia (Oreochromisniloticus) liver in different periods afterStreptococcusagalactiaeinfection.JournalofFisheriesofChina, 2013,37(12):1821-1828. (in Chinese with English abstract)

[6] 李明云,冀德偉,吳海慶,等.低溫脅迫下大黃魚(yú)肝臟蛋白質(zhì)組雙向電泳分析.農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào),2010,18(2):323-328. Li M Y, Ji D W, Wu H Q,etal. 2-DE analysis in liver ofPseudosciaenacroceaduring low temperature stress.JournalofAgriculturalBiotechnology, 2010,18(2):323-328. (in Chinese with English abstract)

[7] Conrath U, Linke C, Jeblick W,etal．Enhanced resistance toPhytophthorainfestansandAltemariasolaniin leaves and tubers of potato plants with decreased activity of the plastidic ATP/ADP transporter.Planta, 2003,217(1):75-83．

[8] Berger S, Papadopoulos M, Schreiber U,etal. Complex regulation of gene expression,photo synthesis and sugar levels by pathogen infect ion in tomato．PhysiologiaPlantarum, 2004,122(4):419-428．

[9] Berger S, Sinha A K, Roitsch T. Plant physiology meets phytopathology: plant primary metabolism and plant-pathogen interact ions.JournalofExperimentalBotany, 2007,58(15/16):4019-4026．

[10] Herbers K, Takahata Y, Melzer M,etal. Regulation of carbohydrate partitioning during the interaction of potato virus Y with tobacco.MolecularPlantPathology,2000,1(1):51-59.

[11] Gupta A K,Kaur N．Sugar signalling and gene expression in relation to carbohydrate metabolism under abiotic stresses in plants.JournalofBioscience, 2005,30(5):761-776．

[12] Warner J R, McIntosh K B. How common are extraribosomal functions of ribosomal proteins?MolecularCell, 2009,34:3-11.

[13] Kruger N J, Schaewen A V. The oxidative pentose phosphate pathway: Structure and organisation.CurrentOpinioninPlantBiology, 2003,6(3):236-246

[14] Blazer V S. Nutrition and disease resistance in fish.AnnalReviewofFishDiseases,1992,2:309-323.

[15] Kiron V, Fukuda H, Takeuchi T,etal. Essential fatty acid nutrition and defense mechanisms in rainbow troutOncorhynchusmykiss.ComparativeBiochemistryandPhysiologyPartA:Physiology, 1995,111(3):361-367.

[16] Chaiyapechara S, Casten M T, Hardy R W,etal. Fish performance, fillet characteristics, and health assessment index of rainbow trout (Oncorhynchusmykiss) fed diets containing in adequate and high concentrations of lipid and vitamin E.Aquaculture, 2003,219:715-738.

[17] Rueda-Jasso R, Concei?ao L E C, Dias J,etal. Effect of dietary non-protein energy levels on condition and oxidative status of Senegalese sole (Soleasenegalensis) juveniles.Aquaculture, 2004,231:417- 433.

[18] 梁萌青,常青,王印庚,等.維生素E及脂肪源對(duì)大菱鲆非特異性免疫的影響.海洋水產(chǎn)研究,2005,26(5):15-21. Liang M Q, Chang Q, Wang Y G,etal. Influences of vitamin E and lipid sources on non-specific immunity of turbot (ScophthamusmaximusLinnaeus).MarineFisheriesResearch, 2005,26(5):15-21. (in Chinese with English abstract)

[19] Irshad Ali, Steele J E. Hypertrehalosemic hormones increase the concentration of free fatty acids in trophocytes of the cockroach (Periplanetaamericana) fat body.ComparativeBiochemistryandPhysiologyPartA:Physiology, 1997,118(4):1225-1231.

[20] Pilarczyk A. Changes in specific carp immune reaction caused by addition of fish oil to pellets.Aquaculture, 1995,129: 425-429.

[21] Puangkaew J, Kiron V, Somamoto T,etal. Watanabe Nonspecific immune response of rainbow trout (OncorhynchusmykissWalbaum) in relation to different status of vitamin E and highly unsaturated fatty acids.Fish&ShellfishImmunology, 2004,16:25-39.

[22] Wu F C, Ting Y Y, Chen H Y. Dietary docosahexaenoic acid is more optimal than eicosapentaenoic acid affecting the level of cellular defence responses of the juvenile grouperEpinephelusmalabaricus.Fish&ShellfishImmunology, 2003,14:223-238.

[23] Pisani L F, Lecchi C, Invernizzi G,etal.Invitromodulatory effect ofω-3 polyunsaturated fatty acid (EPA and DHA) on phagocytosis and ROS production of goat neutrophils.VeterinaryImmunologyandImmunopathology, 2009,131(12):79-85.

[24] Lin Y H, Shiau Y S. Dietary lipid requirement of grouper,Epinephelusmalabaricus, and effects on immune response.Aquaculture, 2003,225:243-250.

[25] Zhang Y A, Nie P, Wang Y P,etal. cDNA sequence encoding immunoglobulin M heavy chain of the mandarin fishSinipercachuatsi.Fish&ShellfishImmunology, 2003,14:477-480．

[26] Srisapoome P, Ohira T, Hirono I,etal. Genes of the constant regions of functional immunoglobulin heavy chain of Japanese flounderParalichthysolivaceus.Immunogenetics, 2004,56:292-300．

[27] Cheng C A, John J A C, Wu M S,etal. Characterization of serum immunoglobulin M of grouper and cDNA cloning of its heavy chain.VeterinaryImmunologyandImmunopathology, 2006,109:255-265．

[28] Danilova N, Hohman V S, Kim E H,etal. Immunoglobulin variable-region diversity in the zebrafish.Immunogenetics, 2000,52:81-91.

DifferentialAeromonashydrophilaresistance mechanisms ofMegalobramaterminalisandMegalobramaamblycephalarevealed by quantification proteomics.

Journal of Zhejiang University (Agric. & Life Sci.)， 2015，41(5)：602-615

Fang Xianping1, Zhu Limin2, Liu Kai2, Ruan Songlin1, Xu Baoqing2, Xie Nan2, Cai Lijuan2, Liu Xinyi2, Dai Yulai2, Feng Xiaoyu2, Li Zhongquan2*

(1.InstituteofBiology,HangzhouAcademyofAgriculturalSciences,Hangzhou310024,China; 2.InstituteofFisheriesResearch,HangzhouAcademyofAgriculturalSciences,Hangzhou310024,China)

Bacterial sepsis is a serious infection for fish. In the past years, the feeding cost ofMegalobramaamblycephalahad been seriously affected by bacterial sepsis. However, bacterial sepsis does not extensively occur during the feeding processes ofMegalobramaterminalis. Therefore,M.terminaliswhich is highly resisted to bacterial sepsis is increasingly favored by farmers.

To study the pathogen resistance mechanism of different varieties ofMegalobramafish in response toAeromonashydrophila, we used label-free based proteomics technology to study the proteome change of the livers ofM.terminalisandM.amblycephalainfected withA.hydrophilaat 0 h, 3 h, 10 h and 24 h.

After identification and relative quantification, 49 and 29 proteins changed at different post-infection time points inM.terminalisandM.amblycephala, respectively. The differentially expressed proteins were deeply analyzed by gene ontology annotation and bioinformatics, and we found that, by comparing withM.amblycephala, the percentage of differentially expressed redox proteins inM.terminalisincreased from 7% to 13%, andβ-globin was up-regulated (1.66, 3.44 and 1.93 times increased at 3 time points). Furthermore, we found thatM.terminalismay specifically induce synergistic pathogen resistance mechanism including the regulation of pentose phosphate pathway, metabolism of fatty acids, leucine metabolism pathway and over-expression ofβ-globin to resist the invasion of pathogens.

In summary, we studied four different stages ofMegalobramaliver proteome expression afterA.hydrophilainfection, and found different pathogen resistance signal response pathway between two fish species, which indicates the resistance mechanism of different fish species afterA.hydrophilainfection. The result is of great benefit to further deeply reveal the molecular mechanisms of fish pathogen interactions and the breeding of pathogen-resistantMegalobramafish varieties.

Megalobramaterminalis;Megalobramaamblycephala;Aeromonashydrophila; quantification proteomics

國(guó)家大宗淡水魚(yú)類(lèi)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(CRS20144453)。

聯(lián)系方式：方獻(xiàn)平(http://orcid.org/0000-0001-7461-9170)，E-mail:fxpbio@163.com

2015-03-04;接受日期(Accepted)：2015-07-23；網(wǎng)絡(luò)出版日期(Published online)：2015-09-18

S 941

A

*通信作者(Corresponding author)：李忠全(http://orcid.org/0000-0002-4620-8750)，E-mail:hznkylzq@sina.com

URL:http://www.cnki.net/kcms/detail/33.1247.s.20150918.1805.022.html