淺析馬傳貧瓊脂擴散試驗方法及影響因素

李亞琴 祝常芬

摘要：馬傳染性貧血?。‥quine Infectious Anemia， EIA，以下簡稱馬傳貧），是由反轉(zhuǎn)錄病毒科慢病毒屬馬傳貧病毒引起的馬屬動物傳染病。我國將其列為二類動物疫病。本病只感染馬屬動物，其中，馬最易感，騾、驢次之，且無品種、性別、年齡的差異。病馬和帶毒馬是主要的傳染源。主要通過虻、蚊、刺蠅及蠓等吸血昆蟲的叮咬而傳染，也可通過病毒污染的器械等傳播。多呈地方性流行或散發(fā)，以7～9月份發(fā)生較多。在流行初期多呈急性型經(jīng)過，致死率較高，以后呈亞急性或慢性經(jīng)過。本文主要是作者在做馬傳貧瓊擴試驗（AGID）過程中的一些方法經(jīng)驗，僅供參考。

關(guān)鍵詞：馬傳貧；試驗步驟；影響因素

一、試驗步驟

（一）、瓊脂板制備

1、 PBS液制備

Na2HPO4.12H2O 2.9克

KH2PO4 0.3克

NaCl 8.0克

蒸餾水加至 1000毫升

2、 瓊脂板

純化瓊脂糖 10克

迭氮鈉 0.2克

加入到配置好的1000毫升PBS液中。

加熱后煮沸10分鐘，待瓊脂完全融化后，倒板，瓊脂板的厚度為3-4mm，凝固后倒置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆茫汤鋮s后也可以直接打孔。

（二）、打孔

反應(yīng)孔現(xiàn)用現(xiàn)打。打孔器為外徑5mm直徑的薄壁型金屬打孔器。在坐標(biāo)紙上畫好七孔型圖案（如示意圖一、圖二）。把坐標(biāo)紙放在帶有瓊脂板的平皿下面，照圖案在固定位置上用金屬管打孔，孔直徑5mm，孔距3mm，最后挑孔，將切下的瓊脂塊取出。

（三）、封板

將挑孔后的瓊脂板放入煮沸的水中封板15秒左右取出，觀察瓊脂板封板后是否有氣泡，有大氣泡的建議淘汰，防止加樣時候漏孔。

（四）、抗原

檢驗用抗原按馬傳貧瓊擴抗原生產(chǎn)制造及檢驗規(guī)程進行生產(chǎn)。

（五）、血清

檢驗用標(biāo)準(zhǔn)陽性血清：能與合格抗原在12小時內(nèi)產(chǎn)生明顯致密的沉淀線的馬傳貧血清，做8倍以上的稀釋仍保持陽性反應(yīng)者為宜，凍結(jié)保存，使用時要注意防止散毒。

受檢血清：來自受檢馬屬動物的不腐敗的血清，勿加防腐劑和抗凝劑。

（六）、編號、加樣

在瓊脂板上端寫上日期及編號等，當(dāng)受檢血清較少時采用打孔示意圖一方法。在示意圖一中⑦孔加抗原，①③⑤孔加樣品血清，②④⑥加入陽性血清。當(dāng)受檢血清較多時采用打孔示意圖二方法，示意圖二中①①①……數(shù)字號孔分別加入受檢樣品血清，②孔加抗原，③孔加陽性血清，加至孔滿為止。

① ②

⑥ ⑦ ③ （示意圖一）

⑤ ④

⑦-抗原，①③⑤-樣品，②④⑥-陽性血清

① ① ① ① ① ① ① ① ① ① ① ①

② ③ ② ③ ② ③ ② ③ ② ③ ② ③ ②

① ① ① ① ① ① ① ① ① ① ① ①

（示意圖二） ①-樣品，②-陽性血清，③-抗原

二、擴散

將加好樣的瓊脂板放置于室溫（18-25℃）反應(yīng)，24小時后借助燈光觀察結(jié)果，并記錄結(jié)果。

三、判定

陽性：抗原與被檢血清孔之間出現(xiàn)一條明顯的沉淀線，而且與標(biāo)準(zhǔn)陽性血清孔的沉淀線完全融合；或者陽性血清的沉淀線末端向毗鄰的受檢血清的抗原側(cè)偏彎者，此種受檢血清判定為陽性。

陰性：抗原與標(biāo)準(zhǔn)陽性之間的沉淀線尖端垂直，受檢血清與抗原孔之間不形成沉淀線，或者標(biāo)準(zhǔn)陽性血清孔與抗原孔之間的沉淀線向毗鄰的受檢血清孔直伸或向受檢血清孔側(cè)偏彎者，此種受檢血清為陰性。

疑似：標(biāo)準(zhǔn)陽性血清孔與抗原孔之間的沉淀線末端，似乎向毗鄰受檢血清孔內(nèi)側(cè)偏彎，但不易判斷時，可將抗原稀釋2倍、4倍、6倍、8倍進行復(fù)試，最后判定結(jié)果。判定結(jié)果時，應(yīng)從不同折光角度仔細(xì)觀察平皿上抗原孔與受檢血清孔之間有無沉淀線。

判斷時要注意非特異性沉淀線：被檢血清與抗原之間出現(xiàn)兩條平行沉淀線，其中一條與標(biāo)準(zhǔn)陽性融合，可能被檢血清中有非特異性物質(zhì)，應(yīng)將被檢血清56-60℃滅能30分鐘，再進行試驗，觀察結(jié)果。

四、影響試驗因素

（一）、瓊脂的質(zhì)量對試驗有一定影響，最好選擇純化瓊脂糖（高級瓊脂糖）。

（二）、瓊脂板是否平整對試驗有一定的影響，倒板時候選擇平整，底部厚度均勻的玻璃平皿。平皿板不平整倒入的瓊脂的厚度也就不均勻，當(dāng)相鄰孔加等量的抗原和陽性血清時，會出現(xiàn)瓊脂板薄的一邊的孔溢出的現(xiàn)象，不等量反應(yīng)會使沉淀線偏移，從而對結(jié)果判定帶來影響。

（三）、打孔是否準(zhǔn)確，打孔時，尤其是連孔型，孔與孔的位置不正會使沉淀線偏位；挑孔時，挑破瓊脂孔邊緣，使?jié)B透度不一致，也會使沉淀線偏位，對結(jié)果判定帶來影響。

（四）、封板的時間。封板時間不易太長或太短，15秒左右為宜。太長會使瓊脂板融化，太短瓊脂板沒有封好，會出現(xiàn)氣泡，加樣時會有漏孔現(xiàn)象，不利于觀察判定結(jié)果。

（五）、反應(yīng)溫度。于室溫（18-25℃）反應(yīng)較為適宜。

參考文獻：

[1] 蔡寶祥.家畜傳染病學(xué).北京：中國農(nóng)業(yè)出版社

[2] 畢遠(yuǎn)龍 李松柏.實驗獸醫(yī)血清學(xué)診斷技術(shù)

[3]馬傳染性貧血防治技術(shù)規(guī)范