東亞特有植物合被韭和長(zhǎng)梗合被韭遺傳多樣性的ISSR分析

盧利聃，楊敬天，盧 艷，周頌東，何興金

（四川大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都610064）

東亞地區(qū)是全球溫帶植物多樣性最高的地區(qū)之一［1］。第四紀(jì)冰期（≤2.6Ma，Ma＝百萬(wàn)年，全文統(tǒng)一標(biāo)為Ma）時(shí)，該區(qū)域未被冰川完全覆蓋，受全球氣候波動(dòng)影響較小，許多物種得以幸存。因此，這一區(qū)域被認(rèn)為是暖溫帶落葉林植物在第四紀(jì)冰期氣候動(dòng)態(tài)變化過(guò)程中最重要的避難所，擁有大量孑遺、特有植物［2］。

特有種研究不僅在植物地理學(xué)上有極高的重要性，同時(shí)也是植物系統(tǒng)進(jìn)化研究的關(guān)鍵點(diǎn)。以往對(duì)東亞特有種的關(guān)注常集中于一些落葉木本和松科植物上［3］，較少涉及草本。但草本植物生活史短，對(duì)氣候環(huán)境的變化更加敏感，因此探討其遺傳多樣性及擴(kuò)散機(jī)制，能使我們更好地了解東亞現(xiàn)存特有植物的演化歷史［4］。

蔥屬（AlliumL.）植物長(zhǎng)期以來(lái)作為野菜、飼料和優(yōu)良牧草資源利用。其中合被組（Sect.Caloscordum）是蔥屬植物中一個(gè)特殊的類(lèi)群，其花被片基部靠合成管狀，因此稱(chēng)為合被。全組僅3個(gè)種，即合被韭（AlliumtubiflorumRendle）、齒棱莖合被韭（A.inutileMakino）和長(zhǎng)梗合被韭［A.neriniflorum（Herb.）Baker.］都只分布在中國(guó)、日本，即東亞地區(qū)［5］。合被韭為中國(guó)特有，分布于中國(guó)西北及華北地區(qū)；長(zhǎng)梗合被韭在中國(guó)華北、東北及遠(yuǎn)東地區(qū)分布。兩者外部形態(tài)非常相似，并且分布區(qū)有所重疊，因而存在復(fù)雜的進(jìn)化問(wèn)題［6］。作為東亞特有植物的典型代表，合被韭和長(zhǎng)梗合被韭是研究第四紀(jì)氣候變化對(duì)東亞暖溫帶落葉林植被變遷的理想模型。但目前對(duì)其研究尚未深入，僅通過(guò)核型研究證實(shí)了兩者存在緊密親緣關(guān)系［7］。

本研究運(yùn)用ISSR 分子標(biāo)記［8］，通過(guò)分析不同居群合被韭和長(zhǎng)梗合被韭DNA 水平的差異和分化，揭示兩個(gè)種的遺傳多樣性水平和遺傳結(jié)構(gòu)，探討片段化生境對(duì)居群遺傳多樣性和遺傳分化的影響，以期為解決特有種親緣關(guān)系和物種遷移模式提供依據(jù)，從而指導(dǎo)制定保護(hù)策略，實(shí)現(xiàn)對(duì)東亞特有植物資源的保護(hù)和合理利用。

1 材料和方法

1.1 材 料

基于前人研究及標(biāo)本記錄，自2012年起共采集到合被韭16個(gè)居群154個(gè)個(gè)體，長(zhǎng)梗合被韭14個(gè)居群133個(gè)個(gè)體，基本覆蓋這兩個(gè)種在中國(guó)整個(gè)地理分布范圍（表1）。

1.2 DNA 提取和PCR 擴(kuò)增

采用植物基因組DNA 試劑盒（天根生化科技有限公司，北京）提取葉片總DNA。DNA 樣品用0.8%瓊脂糖凝膠檢測(cè)，紫外分光光度計(jì)確定純度及濃度，稀釋至40ng／L，－20℃保存。優(yōu)化后體系為20μL，其中含25ng 模板DNA，1×PCR Buffer，Mg2＋1.5 mmol／L，dNTPs 0.2 mmol／L，引 物0.5 μmol／L，1.0U DNATaq聚合酶。引物從UBC 第9套序列中篩選（Invitrogne公司合成），PCR 反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃5min預(yù)變性；94 ℃45s變性，特定退火溫度51～57 ℃（45s）退火，72℃1 min延伸，40個(gè)循環(huán)；72 ℃10min延伸；4 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物以Marker DL2000作為分子量標(biāo)記，在含有GoldenView（Biomed基因技術(shù)有限公司，北京）的2%瓊脂糖凝膠中電泳，緩沖液為1×TBE（pH 8.3）。100V恒壓電泳1h，在凝膠成像系統(tǒng)儀（Bio－Rad Gel Doc XR＋imaging system）中拍照。

表1 材料來(lái)源Table1 Sources of the material

1.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

電泳圖譜的每條帶都為一個(gè)分子標(biāo)記，代表引物的一個(gè)特異結(jié)合位點(diǎn)。以“1”和“0”標(biāo)示同一引物在相同遷移位置譜帶的有無(wú)，構(gòu)造數(shù)據(jù)矩陣，并記錄多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)（n）。采用POPGENE 1.32 計(jì)算分析遺傳變異各項(xiàng)參數(shù)［9］，包括多態(tài)位點(diǎn)百分率（PPB）、平均每個(gè)位點(diǎn)上的觀察等位基因數(shù)（Na）、平均每個(gè)位點(diǎn)的有效等位基因（Ne）、Nei’s基因多樣度指數(shù)（H）、Shannon多樣性信息指數(shù)（Ho）、群體總的基因多樣度（Ht）、居群內(nèi)基因多樣度（Hs）、居群間遺傳分化系數(shù)（Gst）、基因流（Nm）和Nei’s遺傳距離（D）和遺傳一致度（I）。利用NTSYS－pc 2.1軟件構(gòu)建聚類(lèi)圖［10］，對(duì)合被韭及長(zhǎng)梗合被韭群體間的遺傳關(guān)系進(jìn)行分析。采用AMOVA 1.55分子變異分析軟件，分析遺傳變異在居群內(nèi)及居群間的分布情況［11］；遺傳距離和地理距離之間的相關(guān)性運(yùn)用TFPGA 1.3軟件進(jìn)行Mantel檢驗(yàn)［12］。

2 結(jié)果與分析

2.1 遺傳多樣性水平

共篩選出譜帶清晰、重復(fù)性好的6 個(gè)ISSR 引物（表2）對(duì)合被韭及長(zhǎng)梗合被韭進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，平均每個(gè)引物擴(kuò)增出17條帶，所得的片段長(zhǎng)度在100～2 500bp之間。

合被韭16居群154個(gè)體共計(jì)擴(kuò)增出100個(gè)清晰可重復(fù)的有效位點(diǎn)，其中多態(tài)位點(diǎn)98 個(gè)。結(jié)果（表3）顯示：在物種水平上，合被韭的多態(tài)位點(diǎn)百分率（PPB）為98.00%，有 效 等 位 基 因（Ne）為1.419 0，Nei’s基因多樣性指數(shù)（H）為0.264 8，Shannon多樣性指數(shù)（Ho）為0.415 3，表明DNA 片段多態(tài)性比較豐富。各居群PPB為20.00%～64.00%，平均值為49.75%。平均有效等位基因（Ne）為1.253 4，平均Nei’s基因多樣性指數(shù)（H）為0.153 1，平 均Shannon 多 樣 性 指 數(shù)（Ho）為0.234 9，各參數(shù)值均低于物種水平。居群的遺傳多樣性綜合比較表明，居群古武當(dāng)山（GWDS）、懷柔（HR）各項(xiàng)指標(biāo)大大超過(guò)平均值，遺傳多樣性最為豐富，而居群麥積山（MJS）、龍池曼（LCM）則相反，呈現(xiàn)低遺傳多樣性。

以同樣6個(gè)引物對(duì)長(zhǎng)梗合被韭進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，共得到90個(gè)清晰可重復(fù)的有效位點(diǎn)，86個(gè)為多態(tài)位點(diǎn)。物種水平上，長(zhǎng)梗合被韭PPB為95.56%，Ne為1.401 6，H為0.253 9，Ho為0.399 8，顯示了較高的遺傳多樣性。居群水平上，PPB居于26.67%～63.33%，平均為48.33%；H變化范圍為0.071 8～0.182 4，平均為0.145 1；Ho變化范圍為0.114 0～0.280 1，平均為0.223 8，各居群內(nèi)多樣性均低于物種水平。其中，居群海坨山（HTS）、金閣山（JGS）、上方山（SFS）、碣石山（JSS）呈現(xiàn)較高遺傳分化。

表2 ISSR 引物序列和最佳退火溫度Table2 Primers and optimal annealing temperature

表3 合被韭與長(zhǎng)梗合被韭居群的遺傳多樣性Table3 Genetic diversity of A.tubiflorumand A.neriniflorumpopulations

2.2 居群的遺傳分化與基因流

合被韭16個(gè)居群總基因多樣度（Ht）為0.264 7，居群內(nèi)基因多樣度（Hs）為0.153 1，Nei’s基因分化系數(shù)（Gst）為0.421 8（表4），即42.18%的變異存在于居群之間，57.82%的遺傳變異存在于居群內(nèi)。AMOVA 分子變異分析顯示，變異率為38.95%（P＜0.001），說(shuō)明有38.95%的遺傳變異發(fā)生在居群之間，61.05%的遺傳變異存在于居群內(nèi)（表5）。此結(jié)果與POPGENE分析結(jié)果一致，均表明遺傳變異主要存在居群內(nèi)?；蛄鳎∟m）為0.685 4，結(jié)果反映每代居群間遷移數(shù)目小于1，居群間隔離程度較大，不足以防止遺傳漂變導(dǎo)致的居群分化。

而長(zhǎng)梗合被韭居群總基因多樣度（Ht）為0.302 5，居群內(nèi)基因多樣度（Hs）為0.176 3，Nei’s基因分化系數(shù)（Gst）為0.430 1，變異率為39.17%（P＜0.001），同樣表明居群內(nèi)的遺傳分化大于居群間?；蛄鳎∟m）為0.662 4，居群之間基因流水平也較低。

2.3 種間及居群間的遺傳一致度和遺傳距離分析

合被韭16個(gè)居群任意兩兩居群的Nei’s遺傳一致度（I）范圍在0.760 2～0.936 7，遺傳距離（D）范圍在0.065 4～0.274 2，居群間平均遺傳距離為0.151 6，反映出種內(nèi)遺傳分化較大（表6）。長(zhǎng)梗合被韭任意兩兩居群的Nei’s遺傳一致度（I）范圍在0.789 1～0.925 3，遺傳距離（D）范圍在0.077 6～0.236 9，變化趨勢(shì)和合被韭基本一致（表7）。

對(duì)2 種共30 個(gè)居群進(jìn)行UPGMA 聚類(lèi)分析（圖1），合被韭16個(gè)居群和長(zhǎng)梗合被韭14個(gè)居群能明顯分開(kāi)，說(shuō)明分子水平上兩者出現(xiàn)了明顯分化。但在各自種內(nèi)，ISSR 標(biāo)記并沒(méi)有把各個(gè)居群明顯的聚為幾支，這反映出合被韭和長(zhǎng)梗合被韭具有豐富的遺傳變異。

Mantel檢驗(yàn)揭示居群間地理距離和遺傳距離沒(méi)有 顯 著 的 相 關(guān) 性（合 被 韭r＝0.164 1，P＝0.719 4；長(zhǎng)梗合被韭r＝0.102 7，P＝0.632 2）。但從居群的地理分布上看，隨緯度的變化，地理距離較近的居群聚在了一起。但在居群較為集中的區(qū)域，遺傳距離與地理距離相關(guān)性較小，聚類(lèi)呈現(xiàn)無(wú)規(guī)律狀態(tài)。

表4 合被韭與長(zhǎng)梗合被韭居群多樣性Nei’s分析Table4 Nei’s analysis of gene diversity in A.tubiflorumand A.neriniflorumpopulations

表5 合被韭與長(zhǎng)梗合被韭的AMOVA分析Table5 Analysis of molecule variance（AMOVA）of A.tubiflorumand A.neriniflorumbased on ISSR data

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圖1 合被韭和長(zhǎng)梗合被韭居群的UPGMA 聚類(lèi)圖Fig.1 UPGMA dendrogram of A.tubiflorumand A.neriniflorum

3 討 論

3.1 遺傳多樣性水平分析

本研究中合被韭及長(zhǎng)梗合被韭的PPB均達(dá)到95.00%以上，明顯高于Nybom 和Bartish 總結(jié)的物 種普遍的平均遺傳多樣性PPB值（71.02%）［13］。同時(shí)，物種水平的基因多樣性指數(shù)均高于單子葉植物的平均值0.19［14］，說(shuō)明兩者在物種水平上都具有很高的遺傳多樣性。

新種形成［15］、繁育系統(tǒng)［16］、多次奠基者效應(yīng)［17］、冰期殘余種［18］等諸多因素，都有可能導(dǎo)致區(qū)域特有物種具有高水平遺傳多樣性。蔥屬是一起源相對(duì)古老的類(lèi)群［19］，遺傳變異豐富，相當(dāng)于被子植物其他類(lèi)群的科或亞科級(jí)水平［20］。合被組所在的蔥屬第二進(jìn)化支，起源于始新世晚期（約34.93 Ma）。漸新世晚期和中新世早期（約21.23 Ma），合被組祖先類(lèi)群開(kāi)始分化。此時(shí)青藏高原隆升到相當(dāng)高度，東亞季風(fēng)氣候形成，中國(guó)北方出現(xiàn)強(qiáng)烈的干旱，一直延伸到中國(guó)東部的沿海地帶［19，21］。在野外調(diào)查中，我們觀察到合被韭具有二次生長(zhǎng)的特性，正是其對(duì)惡劣環(huán)境的適應(yīng)性進(jìn)化。因此，合被韭及長(zhǎng)梗合被韭種級(jí)水平上很高的遺傳多樣性，可能與其復(fù)雜的遺傳背景及生境有關(guān)。

但在居群水平上，兩者的平均多態(tài)位點(diǎn)百分率低于50.00%，均低于物種水平，表明兩者居群內(nèi)部的遺傳多樣性明顯不足。這種現(xiàn)象的成因可能是由于合被韭與長(zhǎng)梗合被韭具有以鱗莖分裂無(wú)性繁殖的生活史特性；也可能是由于近年中國(guó)北方干旱氣候不斷加劇，植被破壞嚴(yán)重，導(dǎo)致生境片段化，從而造成的野生居群間基因流受阻。

3.2 遺傳結(jié)構(gòu)與進(jìn)化機(jī)制

基于POPGENE和AMOVA 統(tǒng)計(jì)分析均顯示兩個(gè)種的遺傳變異主要存在于居群內(nèi)。兩者遺傳分化系數(shù)Gst均高于Nybom 統(tǒng)計(jì)的植物ISSR 遺傳分化系數(shù)的平均值0.34［22］，表明其已形成異質(zhì)居群結(jié)構(gòu)。

前人研究表明長(zhǎng)梗合被韭中存在雜合現(xiàn)象，隨體呈雜合狀態(tài)，同一個(gè)細(xì)胞既有末端隨體，又有居間隨體［7］。同時(shí)，該研究顯示，合被韭與長(zhǎng)梗合被韭核型基本一致，普遍為二倍體，但合被韭北京的一個(gè)居群為四倍體，表明該類(lèi)群在擴(kuò)大生存空間過(guò)程中不僅出現(xiàn)了染色體結(jié)構(gòu)變異，還出現(xiàn)了染色體加倍［7］。普遍認(rèn)為雜合優(yōu)勢(shì)和多倍化是蔥屬植物進(jìn)化的主要驅(qū) 動(dòng)力［23－24］。因此，結(jié)合本研究ISSR遺傳多樣性和前人的核型資料，認(rèn)為合被韭和長(zhǎng)梗合被韭的遺傳結(jié)構(gòu)變異和遺傳分化，是通過(guò)雜交和染色體加倍的方式實(shí)現(xiàn)的。通常認(rèn)為，異交物種的遺傳變異主要分布在居群內(nèi)［25］，而雜交和染色體加倍過(guò)程中會(huì)使得育性降低、居群縮小。但蔥屬植物中絕大多數(shù)物種均利用鱗莖、根狀莖或珠芽等繁育方式［24］，來(lái)彌補(bǔ)多倍化和雜交的不利作用。合被韭和長(zhǎng)梗合被韭均具鱗莖，且野外考察中發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)種往往多株成叢生長(zhǎng)。因此認(rèn)為合被韭和長(zhǎng)梗合被韭的進(jìn)化驅(qū)動(dòng)力是雜交和多倍化，兼行無(wú)性繁殖則可克服育性降低帶來(lái)的居群個(gè)體數(shù)量下降，保存其變異。合被韭與長(zhǎng)梗合被韭復(fù)雜的遺傳背景和多樣化的繁育方式極可能是導(dǎo)致居群內(nèi)遺傳分化顯著的重要因素。

基因流一直被視為是使居群遺傳結(jié)構(gòu)均質(zhì)化的主要因素之一［26］。當(dāng)基因流小于1時(shí)，就不足以抵制居群內(nèi)因遺傳漂變而引起的遺傳分化［27］。本研究中，兩種東亞特有植物的基因流Nm均小于1，遠(yuǎn)低于Hamrick 總結(jié)的一般廣布種植物的基因流（Nm，1.881）［28］，因此種群隔離引起的遺傳漂變也是影響其遺傳分化的重要因素。

3.3 合被韭和長(zhǎng)梗合被韭的分化中心和遺傳多樣性中心

對(duì)居群的遺傳多樣性綜合指標(biāo)進(jìn)行比較，結(jié)果表明，燕山山脈、太行山脈及鄰近地區(qū)的合被韭（居群GWDS、HR）遺傳多樣性最為豐富，同一區(qū)域的長(zhǎng)梗合被韭（居群HTS、JGS、SFS、JSS）也同樣呈現(xiàn)較高的遺傳分化。這一地區(qū)不僅是合被韭和長(zhǎng)梗合被韭遺傳多樣性最豐富的地區(qū)，也恰好是兩者分布的重疊區(qū)。UPGMA 聚類(lèi)顯示，合被韭在這一區(qū)域（居群GWDS、HR）親緣關(guān)系接近，長(zhǎng)梗合被韭在該區(qū)域（居群HTS、JGS、SFS、JSS），以及鄰近的環(huán)渤海灣區(qū)域（居群CD、NH）也表現(xiàn)出很緊密的親緣關(guān)系。根據(jù)蔥屬系統(tǒng)發(fā)育研究資料［21］，合被韭與長(zhǎng)梗合被韭在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中始終聚為一個(gè)獨(dú)立的單系分支。從種級(jí)水平上看，此單系分支中這兩個(gè)種互為姊妹類(lèi)群。本研究UPGMA 聚類(lèi)也支持兩者為單系，說(shuō)明合被韭與長(zhǎng)梗合被韭應(yīng)擁有一個(gè)最近的共同祖先類(lèi)群，且這個(gè)祖先類(lèi)群的分布區(qū)域應(yīng)是合被韭和長(zhǎng)梗合被韭的分布重疊區(qū)域。2個(gè)種豐富的遺傳變異，暗示其祖先類(lèi)群亦具豐富的遺傳基礎(chǔ)。因此，燕山山脈、太行山脈及鄰近地區(qū)可能是合被韭及長(zhǎng)梗合被韭的分化中心和遺傳變異中心。

遺傳多樣性是植物對(duì)遺傳基礎(chǔ)和生境的響應(yīng)，顯示高水平遺傳多樣性的地區(qū)，通常暗示著該區(qū)域歷史上曾是物種的冰期避難所［29］。氣候波動(dòng)時(shí)，冰期避難所相對(duì)穩(wěn)定的生態(tài)環(huán)境和氣候，能促使生長(zhǎng)在該區(qū)域的物種積累豐富的遺傳多樣性［30］。在野外調(diào)查中發(fā)現(xiàn)合被韭具有休眠，或者說(shuō)二次生長(zhǎng)的特性。這暗示其進(jìn)化史上可能經(jīng)歷了生態(tài)環(huán)境大的改變，比如干旱、低溫等，迫使其不得不進(jìn)入休眠狀態(tài)，在嚴(yán)苛的生境中保存繁殖能力。古植被的重建顯示，中國(guó)東部－日本南部－朝鮮半島曾被一條長(zhǎng)的溫帶落葉林覆蓋［1］。古孢粉學(xué)證據(jù)也顯示，中國(guó)東部海岸被淹沒(méi)的大陸架存在溫帶落葉林的冰期避難所［2］。目前雖然并沒(méi)有研究證實(shí)燕山山脈及太行山脈地區(qū)曾存在冰期避難所，但由于該地區(qū)地貌在燕山期（約199.6～133.9 Ma）已經(jīng)形成，受喜馬拉雅造山運(yùn)動(dòng)及第四紀(jì)冰川作用的影響相對(duì)較弱，在氣候波動(dòng)下，可能會(huì)有較適宜植物存活的溫度。

合被韭與長(zhǎng)梗合被韭的外部形態(tài)非常相似［6］，說(shuō)明祖先性狀得到了充分保留。進(jìn)化史上相似的遺傳背景，則使得兩者進(jìn)化出了相似的遺傳適應(yīng)策略，在適宜生存的地區(qū)保留更高的遺傳多樣性，沒(méi)有表現(xiàn)出顯著的表型分化。而因?yàn)樯矫}、溝谷等小地形的差異，表現(xiàn)出居群內(nèi)遺傳多樣性的強(qiáng)烈變化。

目前，合被組僅有的3個(gè)種中，本研究尚未涉及齒棱莖合被韭（A.inutile）也只分布于東亞。但該種在中國(guó)鮮有報(bào)道，僅有1條資料顯示在安徽滁縣瑯琊山有分布［31］，其余記錄均來(lái)自于日本。筆者及實(shí)驗(yàn)室研究團(tuán)隊(duì)曾在3年間（2012～2014）的盛花期多次赴安徽滁縣，但未見(jiàn)其蹤影。推測(cè)合被組祖先類(lèi)群在擴(kuò)張的過(guò)程中，曾產(chǎn)生了一些親緣關(guān)系非常近的類(lèi)群，但受第四紀(jì)地質(zhì)氣候變化的影響及生境片斷化的不斷加劇，這些類(lèi)群經(jīng)歷了嚴(yán)重的滅絕和重?cái)U(kuò)張過(guò)程。其中一些類(lèi)群已經(jīng)絕滅，而齒棱莖合被韭原有分布區(qū)逐步坍縮，形成島嶼間斷分布格局。

因此，雖然物種水平上，合被韭和長(zhǎng)梗合被韭尚保留其祖先豐富的總體遺傳多樣性，但在居群內(nèi)其遺傳基礎(chǔ)已逐漸趨于一致，并且居群間基因流有限，這使其不能有效地維持目前的遺傳多樣性水平。高遺傳多樣性的物種，如果不能有效維持居群大小和自然更新，同樣可能引起居群的退化甚至滅絕［32］。

居群衰退是特有植物普遍存在的威脅。東亞地區(qū)擁有大量孑遺、特有植物，更應(yīng)高度重視氣候和環(huán)境變化對(duì)這一區(qū)域植物遺傳多樣性的影響，維持這一地區(qū)的穩(wěn)態(tài)。為保持豐富的物種遺傳多樣性水平，維持生物多樣性，應(yīng)盡可能避免人為加速生境的片段化。這對(duì)于降低物種瀕危機(jī)率，保護(hù)特有類(lèi)群，實(shí)現(xiàn)對(duì)東亞特有植物資源的保護(hù)和合理利用有著長(zhǎng)遠(yuǎn)的意義。

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