Ⅱ型膠原基因型變化與 Legg-perthes病發(fā)病的相關(guān)性研究

孟海濤，李林，王翠蘋，曾文超，聶志奎，郭洪敏

(山東省濟(jì)寧市第一人民醫(yī)院骨關(guān)節(jié)科，山東 濟(jì)寧 272011)

Ⅱ型膠原基因型變化與 Legg-perthes病發(fā)病的相關(guān)性研究

孟海濤，李林，王翠蘋，曾文超，聶志奎，郭洪敏

(山東省濟(jì)寧市第一人民醫(yī)院骨關(guān)節(jié)科，山東 濟(jì)寧 272011)

目的 使用mRNA探針檢測(cè)Ⅱ型膠原基因型的變化，酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)血清Ⅱ型膠原抗體濃度，闡明Ⅱ型膠原基因型改變是Legg-perthes病的病因。方法 實(shí)驗(yàn)選用健康雜種幼犬20只(年齡為2個(gè)月，相當(dāng)于人3.5 歲)，雌雄不限，采用自身對(duì)照方法，任選一側(cè)髖為實(shí)驗(yàn)側(cè)，另一側(cè)作為對(duì)照側(cè)，實(shí)驗(yàn)側(cè)股骨頸內(nèi)注射醫(yī)用TH膠1 mL制作Legg-Perthes病動(dòng)物模型，對(duì)照側(cè)注入生理鹽水1 mL。于注膠后4、8、12周時(shí)分批處死取材，采用mRNA探針檢測(cè)Ⅱ型膠原基因型及酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)血清Ⅱ型膠原抗體濃度。結(jié)果 Ⅱ型膠原基因型及血清Ⅱ型膠原抗體濃度測(cè)定發(fā)現(xiàn)在第8～12周時(shí)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間均有極顯著性差異(P<0.01)。結(jié)論 Ⅱ型膠原基因型的改變可能是Legg-perthes病的病因，可能是因?yàn)棰蛐湍z原刺激產(chǎn)生相應(yīng)抗體發(fā)生特異性免疫反應(yīng)，導(dǎo)致自身免疫攻擊，參與Legg-perthe病的發(fā)病過(guò)程。

mRNA探針；醫(yī)用TH膠；幼犬；Legg-perthes病

Legg-perthes病，亦稱為兒童股骨頭軟骨炎，是發(fā)生于兒童股骨頭局部的自愈性自限性疾病，是骨科領(lǐng)域常見的疑難病之一，嚴(yán)重危害兒童的身心健康。其特征是股骨頭缺血及不同程度骨壞死，而骨的壞死與修復(fù)又是同時(shí)進(jìn)行的，其自然病程大約需要2～4年，病變愈合后往往遺留不同程度的關(guān)節(jié)畸形和功能障礙，并可能發(fā)展為早期骨性關(guān)節(jié)炎[1-2]，目前尚無(wú)統(tǒng)一的評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)、早期診斷和治療方法。因此，本研究通過(guò)建立幼犬Legg-perthes病模型，觀察Ⅱ型膠原基因型及其血清抗體濃度的變化以探討Legg-perthes病的發(fā)病機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 動(dòng)物分組 實(shí)驗(yàn)選用健康雜種幼犬20只(年齡為2個(gè)月，相當(dāng)于人3.5 歲)，體重3～5 kg，雌雄不限，采用自身對(duì)照方法，任選一側(cè)髖為實(shí)驗(yàn)側(cè)，另一側(cè)作為對(duì)照。

1.2 Legg-perthes病模型的建立 所有動(dòng)物經(jīng)過(guò)適應(yīng)性喂養(yǎng)2周后開始造模。幼犬腹腔內(nèi)注藥全麻后，仰臥位固定，無(wú)菌操作，實(shí)驗(yàn)側(cè)驅(qū)血帶驅(qū)血后放射監(jiān)控下應(yīng)用骨穿刺套針經(jīng)皮于大轉(zhuǎn)子下方向股骨頸中央穿刺達(dá)股骨頭頸部骺板遠(yuǎn)側(cè)，注入醫(yī)用TH膠1 mL。術(shù)后相同條件下分籠飼養(yǎng)，給予充足活動(dòng)空間，注膠后4周、8周、12周時(shí)分批處死取材。

1.3 指標(biāo)檢測(cè) 動(dòng)物處死后立即取出股骨頭及干骺端，沿冠狀面正中剖開，采用mRNA探針檢測(cè)Ⅱ型膠原基因型及酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)血清Ⅱ型膠原抗體濃度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)由SPSS統(tǒng)計(jì)軟件處理。采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較，各組間差異性檢驗(yàn)的顯著性水平定為P<0.05。

2 結(jié) 果

2.1 Ⅱ型膠原基因型檢測(cè)結(jié)果 采用mRNA探針檢測(cè)Ⅱ型膠原基因型結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組股骨頭冠狀切面Ⅱ型膠原基因型有明顯改變，而對(duì)照組未見該改變。

2.2 血清Ⅱ型膠原抗體濃度 采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)血清Ⅱ型膠原抗體濃度結(jié)果見表1。注射醫(yī)用TH膠后4周，Ⅱ型膠原抗體吸光度較對(duì)照組增大；8周時(shí)Ⅱ型膠原抗體的吸光度較4周時(shí)增大；12周時(shí)可見對(duì)照組的吸光度未見明顯變化，而實(shí)驗(yàn)組的吸光度隨時(shí)間不斷增大，且兩者的吸光度比值也逐漸增大。

表1 各組動(dòng)物血清中Ⅱ型膠原抗體濃度的比較

3 討 論

目前關(guān)于Legg-perthes病的發(fā)病機(jī)理大都局限于局部的血供障礙和脂質(zhì)代謝障礙出現(xiàn)的脂肪栓塞。最近研究認(rèn)為L(zhǎng)egg-perthes病是一個(gè)多種因素共同作用的復(fù)雜疾病，Ⅱ型膠原可能是引起Legg-perthes病的原因之一[3]。Ⅱ型膠原主要分布于軟骨和眼的玻璃體中，是關(guān)節(jié)軟骨的主要組成蛋白。膠原蛋白相當(dāng)于骨骺的軟組織支架，擔(dān)負(fù)著骨骺細(xì)胞的生長(zhǎng)，與其營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)和細(xì)胞間信號(hào)的調(diào)節(jié)密切相關(guān)。骨骺中膠原蛋白主要為Ⅱ型膠原，當(dāng)Ⅱ型膠原出現(xiàn)某種變化時(shí)，便會(huì)導(dǎo)致軟骨局部穩(wěn)定的生理環(huán)境發(fā)生變化，產(chǎn)生相應(yīng)的軟骨病變，長(zhǎng)此以往繼而引起骨質(zhì)病變[4]。

有研究發(fā)現(xiàn)，Ⅱ型膠原是一種組織局限性蛋白，主要存在于關(guān)節(jié)軟骨和骨骺中，它是關(guān)節(jié)軟骨的主要組成蛋白。關(guān)節(jié)損傷或關(guān)節(jié)內(nèi)血流受阻時(shí)，Ⅱ型膠原釋放入血并刺激免疫系統(tǒng)產(chǎn)生自身免疫攻擊，推測(cè)這可能是關(guān)節(jié)軟骨炎發(fā)生機(jī)制之一[5]。Miyamoto等[4]報(bào)告一個(gè)Legg-perthes遺傳特征明顯的家族，家族三代男、女均有發(fā)病。對(duì)家族10位成員的外周血基因分析發(fā)現(xiàn)，編碼Ⅱ型膠原α1鏈的基因變異是引起Legg-perthes的致病因素。Ⅱ型膠原是軟骨細(xì)胞增殖、分化過(guò)程中合成和分泌的重要膠原，也是關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的標(biāo)志分子之一。目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)很多骨骼系統(tǒng)疾病，如成人股骨頭壞死、早期發(fā)生的骨關(guān)節(jié)炎等均與Ⅱ型膠原基因變異有關(guān)[6-7]。最近的研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)對(duì)病變的股骨頭關(guān)節(jié)軟骨行組織學(xué)檢查確定，軟骨組織已經(jīng)發(fā)生了廣范的超微結(jié)構(gòu)異常。組織學(xué)結(jié)果表明，突變體的軟骨的層次結(jié)構(gòu)和嵌入式的軟骨細(xì)胞明顯異常。Ⅱ型膠原的表達(dá)和分布在突變體的軟骨部分不均勻，超微結(jié)構(gòu)檢查發(fā)現(xiàn)在突變體中的軟骨發(fā)生明顯的軟骨細(xì)胞和膠原纖維排列紊亂。這說(shuō)明由于Ⅱ型膠原中的甘氨酸被絲氨酸替代，顯著降低了Ⅱ型膠原的穩(wěn)定性。研究還表明，在Ⅱ型膠原COL2A1中的p.gly1170ser結(jié)構(gòu)突變引起的關(guān)節(jié)軟骨結(jié)構(gòu)明顯改變是發(fā)生新的膠原基因病的原因[8]。Th免疫應(yīng)答是此病發(fā)生所必需的誘因和主要原因，而且Legg-perthes病的病理變化與之極其相似[9]。與以上研究結(jié)果一致，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Ⅱ型膠原基因型及血清Ⅱ型膠原抗體濃度在第8～12周時(shí)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間均有極顯著性差異。由此推測(cè)，Ⅱ型膠原基因變異可能是Legg-perthes的致病因素，對(duì)Ⅱ型膠原及其血清抗體的進(jìn)一步研究可為L(zhǎng)egg-perthes病早期診治提供理論依據(jù)。

Legg-perthes病往往會(huì)遺留不同程度的關(guān)節(jié)畸形和功能障礙，嚴(yán)重危害患兒的身心健康。因此，研究Legg-perthes的病因、發(fā)生機(jī)制具有重要的臨床價(jià)值。

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Changes of Collagen Ⅱ Genotype in Legg-perthes Disease

Meng Haitao，Li Lin，Wang Cuiping，etal

(Department of Joint Sugery，1st People′s Hospital of Jining，Jining 272011，China)

Objective To expore changes of collagen-Ⅱ genotype in Legg-perthes Disease.Methods 20 healthy half-bred young dogs were used.1 ml of TH glue was injected into one hip joint in the experimental group，whereas 1 ml of physiological saline solution was injected into the other hip joint as control.Samples was taken at 4，8 and 12 weeks post injection.mRNA probes was used to detect the collagen genotype changes，and ELISA was used to detect the antibody thickness of collagen-Ⅱ.Results There was an notable difference of collagen-Ⅱ genotype and antibody thickness between the experimental group and the collation group at 8 and 12 weeks post injection (P<0.01).Conclusion The collagen-Ⅱ genotype changes may be one of the causes of Legg-perthes disease.One probable mechamism is that antibody provoked by collagen-Ⅱ lead a immunoreaction and participate in Legg-perthes morbidity process.

mRNA probe；TH glue；young dogs；legg-perthes disease

1008-5572(2015)02-0134-02

R681.8

A

2014-08-25

孟海濤(1976- )，男，主治醫(yī)師，山東省濟(jì)寧市第一人民醫(yī)院骨關(guān)節(jié)科，272011。