小麥鎘脅迫相關microRNA的差異表達

邱宗波，袁萌萌，張曼曼，張 亮，郭君麗

（河南師范大學 生命科學學院，河南 新鄉(xiāng)453007）

microRNAs（miRNAs）是一類長度為21～24個核苷酸（nt）的非編碼單鏈RNA 分子，廣泛存在于植物、線蟲和人類等真核生物細胞中[1－2]，而且在真核生物生長發(fā)育、形態(tài)建成、信號轉導、脅迫響應等重要生命過程中起著關鍵的調控作用，是最主要的轉錄后調控因子之一[3－4]。miRNA 通過與靶基因mRNA 序列互補結合來介導mRNA 的降解或抑制mRNA 的翻譯，主要在轉錄后水平負調控靶基因的表達。此外，植物miRNA 還具有保守性、時序性和組織特異性[5]，在個體發(fā)育的不同時期或不同組織中有不同的表達模式。研究miRNAs的表達常用Northern雜交、microarray、半定量RT－PCR和實時定量PCR（qRT－PCR）等，qRT－PCR 檢測基因表達靈敏度高、快捷、高效。目前，qRT－PCR 在基因表達研究中已成為最重要的方法之一。

研究表明，miRNA 在植物對重金屬鎘脅迫的響應過程中發(fā)揮重要作用[4，6－8]。Xie等[8]用表達序列標簽及生物信息學方法預測甘藍型油菜（Brassicanapus）中的21個miRNA，并且采用RT－PCR方法發(fā)現miR156、miR171、miR393 和miR396a的轉錄受重金屬鎘的抑制，暗示這幾個miRNA 在重金屬鎘脅迫響應中發(fā)揮作用。利用miRNA 微陣列芯片技術，Fang等[9]鑒定了經鎘處理和未處理的大豆（Glycinemax）株系中miRNA 表達模式的差異，共鑒定出26個與鎘應激相關的miRNA，其中有9個miRNA 在2 個 株 系 中 均 有 發(fā) 現，有5 個 和12 個miRNA 分別在鎘耐受型和鎘敏感型大豆中特異表達。這些研究結果表明，不同植物參與響應鎘脅迫應答過程的miRNA 存在多樣性。目前miRNAs脅迫表達的研究主要集中在擬南芥、水稻和毛白楊等模式植物上，對小麥鎘脅迫相關miRNAs的研究鮮有報道。為此，筆者等在前期已完成的小麥鎘脅迫miRNA 表達譜高通量測序的基礎上，結合其他植物中已報道的與鎘脅迫相關的miRNAs，選擇9條可能與鎘脅迫相關的小麥miRNA 進行研究，并對其靶基因進行預測及功能分析，以期為進一步明確這些miRNAs的表達調控機制以及揭示小麥體內miRNA 響應鎘脅迫的作用機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

供試小麥（TriticumaestivumL.）品種為鄭麥4號，由河南省農業(yè)科學院提供。

1.2 脅迫處理

選取籽粒飽滿、大小均勻的種子用0.1%HgCl2消毒1min后用去離子水沖洗30min，自然干燥，然后置于25℃恒溫箱中浸種36h，播種在鋪有2 層濾紙的培養(yǎng)皿中催芽，80 粒／皿，出芽后培養(yǎng)于（25±1）℃人工氣候室內，澆以Hoagland’s 營養(yǎng)液，12h／d光照，相對濕度70%。待幼苗長生長7d（1葉一心）時，開始鎘脅迫處理。設置營養(yǎng)液中CdCl2濃度為150μmol／L，每天更換1次培養(yǎng)液，試驗設3次重復。鎘脅迫處理0h、6h、12h、24h和48h后分別取小麥幼苗葉片和根，立即用液氮處理，－80℃保存。

1.3 總RNA提取

用Concert Plant RNA Reagent（Invitrogen，美國）提取鎘脅迫小麥幼苗的葉片和根為材料的總RNA，總RNA 用Promega 公 司 的RNase－free Dnase I去除污染的DNA。取3μL 總RNA 溶液，用常規(guī)瓊脂糖凝膠電方法檢測其完整性。通過230 nm、260nm 和280nm 波長的光吸收值測定，檢驗所提取RNA 純度和濃度。

1.4 實時定量PCR擴增

1.4.1 實時定量PCR 引物設計 選擇小麥中9個 保 守 miRNAs （miR167，miR169，miR171，miR319，miR395， miR396， miR397， miR399，miR444）進行檢測，包括之前報道過的植物鎘脅迫相關miRNAs或小麥中高度保守的miRNAs，內參基因選用小麥延伸因子1a－亞基 （TEF1）（GenBankaccession No.M90077.1）。引物設計（表1）中盡可能使所有引物具有相同的Tm 值，以便同一批檢測。對于GC含量較高或較低的miRNAs，可通過增加或減少引物長度使Tm 值相近或一致，引物合成均在北京六合華大基因科技有限公司進行。

表1 Real－time PCR中使用的引物Table 1 Primers of Real－time PCR

1.4.2 實時定量PCR 擴增 應用Ncode miRNA第一鏈cDNA 合成試劑盒（MIRC－50；Invitrogen）和1μg純化后的總RNA 進行cDNA 合成。采用Toyobo’s Thunder bird SYBR qPCR 試劑盒進行定量分析。反應體系為20μL，2μL 1∶10稀釋的cDNA 作為模板，引物濃度為0.3μM。每個樣品均重復3 次，熒光定量PCR 儀為Rotor－Gene 3000。PCR 循環(huán)條件為95℃預變性30s，95℃變性5s，58℃退火15s，72℃延伸20s，共40個循環(huán)，PCR 擴增之后，用熱變性循環(huán)測定熔解曲線驗證擴增的特異性。以小麥TEF1為內參基因，擴增的結果用比較Ct方法分析[10]，即采用公式2－ΔΔCt（Ct代表循環(huán)閾值）。miRNA 表達水平用TEF1 基因的表達水平進行校正，在CK 中的表達水平設為1。

1.5 miRNA靶基因預測

基于網站程序psRNATarget 進行小麥保守miRNA 靶基因的預測。靶基因數據庫為小麥的unigene序列 [DFCI Gene Index（TAGI），version 12，ftp：／／occams.dfci.harvard.edu／pub／bio／tgi／data／Triticum＿aestivum／TAGI.release12.zip]。選擇功能3 和默認參數，進行miRNA 靶基因預測[11]。

2 結果與分析

2.1 不同處理小麥幼苗總RNA提取

試劑盒提取總RNA 后，用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性。從圖1看出，不同處理樣品的28SrRNA 和18SrRNA 電泳條帶分離清晰，無擴散現象，且28SrRNA 條帶的亮度約為18SrRNA 條帶亮度的2倍。說明，所提取的總RNA 完整性好，沒有明顯降解，能夠用于qRT－PCR 的后續(xù)研究。

2.2 qRT－PCR熔解曲線

圖2給出了部分qRT－PCR 程序分析得到的熔解曲線。可以看出，10個基因呈現的熔解曲線均為顯著的單一峰，擴增曲線清晰可辨。說明，cDNA 擴增產物非常專一，可用于后續(xù)定量分析實驗。

圖1 不同處理小麥幼苗總RNA的瓊脂糖電泳圖譜Fig.1 Agarose gel electrophoresis of total RNA isolated from wheat in different treatment

圖2 10個基因的Real－time PCR熔解曲線Fig.2 Real－time PCR melting curves of 10genes

2.3 鎘脅迫小麥幼苗葉片中miRNA的相對表達量

從表2看出，在鎘脅迫6h后，miR169、miR171和miR319表達上調，而miR397和miR399的表達下調。在鎘脅迫12h 后，miR319 的表達上調，而miR397、miR399 和miR444 的表達下調。在鎘脅迫24h 后，miR319、miR396 和miR397 的 表 達 上調，miR399 的表達下調。在鎘脅迫48h后miR319和miR396的表達上調，miR397和miR399的表達下調。其中，miR319在鎘脅迫處理各時間段的表達均上調，而miR399在鎘脅迫處理各時間段的表達均下調。說明，在同一鎘脅迫時間下，不同miRNA在小麥幼苗葉片中的表達量有很大的差異。

2.4 鎘脅迫小麥幼苗根中miRNA的相對表達量

從表2看出，在鎘脅迫6h 后，miR169、miR396和miR397的表達上調，而miR167和miR171的表達下調；在鎘脅迫12h后，miR396和miR397的表達上調，而miR167的表達下調；在鎘脅迫24h后，miR169、miR171、miR319 和miR397 的表達上調，miR167和miR444的表達下調；在鎘脅迫48h 后，miR169、miR397 和miR399 的表達上調，miR167、miR171和miR444 的表達下調。其中，miR167 在鎘脅迫處理各時間段的表達均下調，而miR397在鎘脅迫處理各時間段的表達均上調。說明，在同一鎘脅迫時間下，不同miRNA 在小麥幼苗根中的表達量有很大的差異。

表2 小麥幼苗葉片和根中鎘脅迫相關miRNA的相對表達量Table 2 Relative expression（fold difference）of cadmium stress related microRNA in leaves and roots of wheat seedlings

表3 鎘脅迫相關miRNA的靶基因Table 3 Targets of cadmium stress related microRNA

2.5 小麥鎘脅迫相關miRNA靶基因的預測

植物miRNA 與靶基因的高度互補有利于預測靶基因。除miR169和miR399沒預測出相應的靶基因外，其他6條小麥miRNAs共預測出7個潛在的靶基因（表3）。其中，miR167靶基因為生長素應答因子，參與生長素信號途徑的調控；miR171靶基因為超氧化物歧化酶，在清除超氧化物的過程中發(fā)揮重要作用；miR319靶基因為2個MYB轉錄因子基因，參與植物逆境脅迫應答響應[12]；miR395靶基因腺苷5′三磷酸硫酰酶，參與硫的吸收與同化[13]；miR444和miR397的靶基因鈣調素結合蛋白，參與鈣－鈣調素信號傳導途徑的調控[14]。

3 結論與討論

1）本研究利用實時定量PCR 方法，對9 個miRNAs在小麥鎘脅迫不同時間段的表達模式進行分析，初步發(fā)現9個miRNAs參與了小麥鎘脅迫響應 的 調 控。 其 中，miR167、miR171、miR399 和miR444在鎘脅迫后的小麥幼苗的根或葉中表達呈下調趨勢，而miR319、miR396和miR397在小麥幼苗根和葉片中的表達呈上調趨勢。表明，miRNAs參與了小麥鎘脅迫響應的調控，對鎘脅迫不同時間段的響應呈現出動態(tài)變化的過程，且多數miRNAs的表達具有組織特異性。

有研究表明，miRNA 參與各種各樣的調節(jié)途徑，包括激素調節(jié)、生長發(fā)育、信號轉導以及逆境環(huán)境的適應能力等[3－4]。在植物中，干旱、鹽堿、重金屬等非生物脅迫能影響基因在植物內轉錄及轉錄后水平的表達調控[15]。鎘是毒性最強的重金屬之一，可以使植物細胞內產生活性氧（ROS）從而導致氧化脅迫，或者使細胞內蛋白質的羧基或硫醇基失活，從而嚴重影響植物細胞的生長發(fā)育[16]。miRNA 在植物對重金屬脅迫的響應過程中發(fā)揮重要作用，在重金屬脅迫下，植物miRNA 表達量發(fā)生顯著上調或下調，以響應重金屬脅迫[17－18]。Zhou等[19]在豆科的模式生物蒺藜苜蓿（Medicagotruncatula）中，應用實時定量PCR 方法發(fā)現了部分miRNA 的表達可受重金屬鎘的誘導與調節(jié)，其中，miR171、miR319和miR529 在鎘脅迫下表達上調，而miR167、miR399則表達下調。

2）植物miRNA 功能的發(fā)揮主要通過下游靶基因的表達調節(jié)而實現。miR167的靶基因是生長素響應因子ARF6 和ARF8[20]，鎘處理下miR167在小麥幼苗根中的表達減弱，推測miR167可能通過影響生長素信號途徑而在抵抗鎘脅迫等過程中發(fā)揮重要作用。miR395 通過調節(jié)ATP 硫酸化酶的表達而參與硫酸鹽同化和分配[21]。缺硫能夠誘導擬南芥miR395的表達[22]，本研究也證實鎘脅迫同樣能誘導小麥幼苗葉和根中miR395 的表達。Sunkar等[23]發(fā)現，擬南芥在高銅、高鎘脅迫下，miR398 表達降低，其所調控的Cu／Zn 超氧化物歧化酶表達上調，從而提高了擬南芥對重金屬脅迫的耐受性。在小麥中，經過鎘脅迫處理后的miR171的表達在脅迫處理時間段的表達趨勢整體下調，而其在小麥中的靶基因是超氧化物歧化酶。當小麥遭遇鎘脅迫時，miR171表達下調，而其靶基因超氧化物歧化酶的表達上調，從而提高了小麥對重金屬脅迫的耐受性。另外在預測結果中也發(fā)現miR319靶基因為2個MYB轉錄因子基因，miR444靶基因鈣調素結合蛋白和miR397靶基因鈣調素結合蛋白。丁艷菲等[7]研究發(fā)現，miR444d 在鎘脅迫下表達下降，暗示其靶基因鈣調素結合蛋白表達上升。本研究表明，miR444在鎘脅迫小麥幼苗根中的表達呈下降趨勢，暗示其靶基因鈣調素結合蛋白表達上升，這一結果首次通過miRNA 將鈣信號與鎘脅迫應答網絡聯系起來。miRNA 處于基因表達調控的中心位置，在植物對重金屬脅迫的應答過程中起著重要調控作用。

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