丁香酚對(duì)鯉魚(yú)腦和脊髓中鈉鉀泵活性的抑制效果

孫文淵，呂世明＊，譚艾娟，林艷紅，安 苗，華 夏，李博巖，焦亞琴

（1.貴州大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng)550025；2.貴州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng)550025）

鈉鉀泵簡(jiǎn)稱(chēng)鈉泵，也稱(chēng)Na＋－K＋－ATP酶，是一種鑲嵌在膜脂質(zhì)雙層中具有ATP 酶活性的蛋白質(zhì)，廣泛分布于各類(lèi)細(xì)胞質(zhì)膜上，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，Na＋－K＋－ATP酶具有較高的生物活性。有研究表明，Na＋－K＋－ATP酶可能具有信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用[1－2]。丁香酚是一種有機(jī)化合物，主要用于抗菌、降血壓等，且對(duì)多種水生動(dòng)物有較好的麻醉作用[3]，其麻醉時(shí)間長(zhǎng)、蘇醒快，藥物殘留量少，對(duì)人和魚(yú)均安全，但對(duì)其全麻作用的確切部位及分子機(jī)制仍不清楚，影響其在動(dòng)物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的深度開(kāi)發(fā)和廣泛應(yīng)用。因此，為探明Na＋－K＋－ATP 酶是否為丁香酚作用的靶位之一，研究了鯉魚(yú)在丁香酚麻醉下各腦區(qū)Na＋－K＋－ATP酶的變化，以期為了解丁香酚的作用機(jī)制和進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器

試劑：丁香酚（Xiya Reagent），吐溫80（Solar－bio），司班80（Xiya Reagent），無(wú)水乙醇（天津市武清區(qū)大良鎮(zhèn)工業(yè)園），ATP酶試劑盒、考馬斯亮蘭蛋白測(cè)定試劑盒（南京建成生物工程研究所）。

儀器：722 分光光度計(jì)（上海欣茂儀器有限公司），高速低溫離心機(jī)（德國(guó)Eppendor）。

1.2 丁香酚乳劑的配制

參照呂世明等[3]的方法配制，即吐溫80∶司班80∶無(wú)水乙醇∶丁香酚＝4∶2∶1∶2。

1.3 動(dòng)物分組與處理

取體重900～1 000g、體長(zhǎng)40～45cm 的鯉魚(yú)40尾，先喂養(yǎng)7d以適應(yīng)環(huán)境，水溫20～22℃，試驗(yàn)前停食1d，隨機(jī)分為對(duì)照組（10尾）、丁香酚處理組（30尾）。對(duì)照組：將鯉魚(yú)放入不含丁香酚乳劑水溶液中藥浴10min后取出，采集腦組織和脊髓，在生理鹽水冰面上迅速分取大腦、中腦、小腦、間腦、延腦和脊髓，立即液氮冷凍保存?zhèn)溆谩６∠惴犹幚斫M：將鯉魚(yú)放置于含40mg／L丁香酚乳劑的水溶液中藥浴，分別采集處于誘導(dǎo)期、麻醉期和麻醉恢復(fù)期的各10尾鯉魚(yú)腦組織和脊髓，按對(duì)照組方法處理，液氮冷凍保存?zhèn)溆?。魚(yú)麻醉分期標(biāo)準(zhǔn)參照李思發(fā)[4]的方法執(zhí)行。

1.4 Na＋－K＋－ATP酶活性測(cè)定

參照南京建成生物工程研究所提供的ATP 酶活力測(cè)定方法制備樣品勻漿，考馬斯亮蘭法測(cè)腦組織的蛋白濃度，分光光度法測(cè)Na＋－K＋－ATP 酶活力，酶活力單位以每小時(shí)每毫克組織蛋白中ATP酶分 解ATP 產(chǎn) 生1 μmol 無(wú) 機(jī) 磷 的 量 表 示，即μmol／（mg·h）。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 17.0數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行LSD多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同腦區(qū)和脊髓中Na＋－K＋－ATP酶活性

從表1看出，對(duì)照組鯉魚(yú)各腦組織中Na＋－K＋－ATP酶活性不同，以脊髓中最高，為（8.12±0.70）μmol／（mg·h）；小腦最低，為（4.87±0.05）μmol／（mg·h）。經(jīng)丁香酚藥浴后鯉魚(yú)各腦和脊髓中的Na＋－K＋－ATP酶活性均不同程度下降，抑制作用隨麻醉程度加深而加強(qiáng)，在麻醉期時(shí)抑制作用最強(qiáng)。與對(duì)照組相比，各腦和脊髓在麻醉期的Na＋－K＋－ATP酶活性均極顯著下降；誘導(dǎo)期的大腦、間腦和脊髓的Na＋－K＋－ATP 酶活性均極顯著下降，小腦的酶活性顯著下降，中腦和延腦的酶活性下降但差異不顯著。與麻醉期相比，恢復(fù)期除間腦和延腦外，其余各腦組織中Na＋－K＋－ATP酶活性均呈極顯著升高，但仍低于對(duì)照組。

表1 試驗(yàn)鯉魚(yú)不同腦區(qū)和脊髓中Na＋－K＋－ATP酶的活性Table 1 Activity of Na＋ －K＋ －ATPase in different brain region and spinal cord of tested C.carpio

2.2 不同腦區(qū)和脊髓中Na＋－K＋－ATP 酶活性的抑制率

從表2看出，在誘導(dǎo)期，丁香酚對(duì)大腦和脊髓的Na＋－K＋－ATP酶活性抑制率大，分別達(dá)33.7%和37.6%；中腦和延腦的較小，分別為10.0%和12.4%。在麻醉期，丁香酚對(duì)脊髓的Na＋－K＋－ATP酶活性抑制率最大，達(dá)53.9%；對(duì)大腦、中腦、小腦和間腦的酶活性抑制率較接近，為32.5%～37.6%；對(duì)延 腦 的Na＋－K＋－ATP酶活性抑制率最小，為23.8%。在恢復(fù)期，各腦組織中Na＋－K＋－ATP 酶活性抑制率又降低，其中小腦中的降幅最大，其次是延腦和脊髓，大腦和間腦中的降幅較小。

表2 試驗(yàn)鯉魚(yú)不同腦區(qū)和脊髓中Na＋－K＋－ATP酶活性的抑制率Table 2 Inhibition rate of Na＋－K＋－ATPase activity in different brain region and spinal cord of tested C.carpio

3 結(jié)論與討論

Na＋－K＋－ATP酶主要分布于機(jī)體具有分泌性和興奮性的組織中，神經(jīng)系統(tǒng)中含量尤為豐富。Na＋－K＋－ATP酶可通過(guò)改變細(xì)胞構(gòu)象實(shí)現(xiàn)離子轉(zhuǎn)運(yùn)，產(chǎn)生并維持細(xì)胞膜電位，對(duì)維持神經(jīng)細(xì)胞的興奮產(chǎn)生和傳導(dǎo)具有重要作用，并對(duì)神經(jīng)遞質(zhì)的釋放和信息傳遞也具有重要意義[5－6]。 另外，Na＋－K＋－ATP 酶也可借助Na＋／Ca2＋交換間接調(diào)節(jié)胞內(nèi)Ca2＋濃度以調(diào)控神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，影響神經(jīng)細(xì)胞及神經(jīng)細(xì)胞與肌肉或腺體細(xì)胞之間的信息傳遞[7－8]。所以，麻醉藥影響Na＋－K＋－ATP 酶活性必將對(duì)神經(jīng)元的電興奮活動(dòng)和信息傳遞產(chǎn)生影響。麻醉藥對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)Na＋通道、Na＋／Ca2＋交換及Na＋－K＋－ATP酶有抑制作用，通過(guò)擾亂Na＋，K＋，Ca2＋離子的穩(wěn)定發(fā)揮其麻醉作用[9－11]。

研究結(jié)果表明，丁香酚可降低鯉魚(yú)各腦區(qū)和脊髓中Na＋－K＋－ATP酶活性，隨麻醉程度的增加（從誘導(dǎo)期到麻醉期）抑制逐漸增強(qiáng)；酶活性抑制程度的變化與鯉魚(yú)被丁香酚麻醉后出現(xiàn)的觸覺(jué)喪失，魚(yú)體平躺，直至靜止水中的行為學(xué)變化相平行；從麻醉期到恢復(fù)期，丁香酚對(duì)各腦區(qū)和脊髓中Na＋－K＋－ATP酶活性的抑制逐漸減輕，酶活性逐漸恢復(fù)，與之平行的行為學(xué)變化表現(xiàn)出鯉魚(yú)觸覺(jué)恢復(fù)，游動(dòng)越來(lái)越平穩(wěn)靈活。表明，丁香酚對(duì)鯉魚(yú)的麻醉作用與其抑制腦Na＋－K＋－ATP酶活性有關(guān)，即Na＋－K＋－ATP酶可能是丁香酚全麻作用的靶位之一。

全麻藥的分子機(jī)制是一個(gè)非常復(fù)雜的過(guò)程，涉及跨膜細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞內(nèi)信息轉(zhuǎn)導(dǎo)和離子通道等方面的諸多內(nèi)容[12－13]。目前，未見(jiàn)國(guó)內(nèi)外有關(guān)丁香酚麻醉魚(yú)類(lèi)的分子機(jī)制研究報(bào)道。本研究結(jié)果在細(xì)胞跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)方面揭示了丁香酚的全麻作用機(jī)制，其確切分子機(jī)制還有待進(jìn)一步全面深入研究。

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