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    接種量與通氣比對(duì)印楝懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)及印楝素產(chǎn)量的影響

    2015-07-01 08:01:28張?jiān)浦?/span>鐘秋平
    貴州農(nóng)業(yè)科學(xué) 2015年6期
    關(guān)鍵詞:印楝素發(fā)酵罐通氣

    張?jiān)浦?,鐘秋?/p>

    (海南大學(xué) 食品學(xué)院,海南 ???70228)

    印楝素是印楝植物組織細(xì)胞產(chǎn)生的一種次級(jí)代謝產(chǎn)物[1],具有高效殺蟲(chóng)、拒食、抑制生長(zhǎng)發(fā)育、胃毒、忌避、抑制呼吸、抑制昆蟲(chóng)激素分泌、降低昆蟲(chóng)生育能力及殺滅微生物的作用[2-6],已在農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、環(huán)保、化妝品及食品中廣泛應(yīng)用[7-8]。由于印楝素應(yīng)用范圍廣,高效低毒,是新一代最具有開(kāi)發(fā)價(jià)值的生物農(nóng)藥及食品防腐劑,具有廣闊應(yīng)用前景[9]。植物中印楝素含量低,種子中含量最高,也僅0.3%左右[10]。為了開(kāi)發(fā)利用印楝素,需要通過(guò)植物純化或者人工合成[11-12]得到印楝素。植物純化存在植材耗量大、得率低等缺點(diǎn),人工合成存在耗時(shí)長(zhǎng),得率僅0.000 15%[13],在實(shí)際生產(chǎn)中難以實(shí)現(xiàn),因而不具備現(xiàn)實(shí)意義。

    通過(guò)植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物是目前活性物質(zhì)生產(chǎn)中的一條重要途徑,經(jīng)此途徑得到的目標(biāo)產(chǎn)物與原植株相比具有產(chǎn)出速度快、產(chǎn)量高,生產(chǎn)環(huán)境條件易控制,可周年生產(chǎn)等[14]。印楝懸浮細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)的目的是為了得到大量的印楝素,是其工業(yè)化生產(chǎn)的基礎(chǔ),而生物反應(yīng)器是實(shí)現(xiàn)這一步的前提條件之一。生物反應(yīng)器相對(duì)搖瓶而言,工作體積大,單位生產(chǎn)能力高,可以更好地控制反應(yīng)系統(tǒng);生物反應(yīng)器可以放大,能應(yīng)用于大規(guī)模生產(chǎn)。而國(guó)內(nèi)相應(yīng)的研究主要集中在印楝素的提取分離、作用效果、作用機(jī)制等方面,梁軍等[15]對(duì)印楝細(xì)胞懸浮培養(yǎng)系的建立及懸浮培養(yǎng)條件進(jìn)行了研究,但未見(jiàn)對(duì)其組織細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)方面的研究報(bào)道。為此,筆者等探索接種量與通氣比對(duì)印楝懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)及印楝素產(chǎn)量影響,以期為印楝懸浮細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)提供依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 印楝懸浮細(xì)胞 印楝懸浮細(xì)胞,來(lái)自于印楝籽源經(jīng)固體培養(yǎng)基多次繼代誘導(dǎo)培養(yǎng)產(chǎn)生的生長(zhǎng)旺盛、色澤嫩黃、疏松易碎的組織,接種于種子培養(yǎng)基。將續(xù)代穩(wěn)定的印楝懸浮細(xì)胞按一定接種量轉(zhuǎn)入500mL三角瓶,25℃培養(yǎng)8d后,得到足量的生長(zhǎng)旺盛的印楝懸浮細(xì)胞作為種子細(xì)胞。

    1.1.2 發(fā)酵設(shè)備和藥品 發(fā)酵罐為5L 氣升式發(fā)酵罐,上海寶興生物設(shè)備工程有限公司;所有藥品均為分析純。

    1.1.3 培養(yǎng)基

    1) 種 子 培 養(yǎng) 基。 培 養(yǎng) 基 為 MS +BA2.0mg/L+蔗糖40g/L,pH 6.0。2)發(fā)酵培養(yǎng)基。培養(yǎng)基為MS+BA 2.0 mg/L+蔗糖40g/L,pH6.0,發(fā)酵至第8天加入已優(yōu)化的組合誘導(dǎo)子(水楊酸92.00 mg/L、萘 乙 酸6.0 mg/L、殼 聚 糖54.0mg/L和吲哚丁酸3.0mg/L)。

    1.2 培養(yǎng)方法

    發(fā)酵罐反應(yīng)器經(jīng)空罐消毒后,裝入3L 發(fā)酵培養(yǎng)基,調(diào)節(jié)pH 6.0,經(jīng)消毒后接入一定量的印楝懸浮細(xì)胞種子液。培養(yǎng)期間通入一定量的無(wú)菌空氣,保持溫度(25±2)℃,黑暗培養(yǎng)。

    1.3 細(xì)胞干重測(cè)定

    將培養(yǎng)好的細(xì)胞懸浮液,搖勻后取100 mL,3 000r/min離心20 min,沉淀用蒸餾水清洗2次,50℃烘干至恒重后稱量,即為細(xì)胞干質(zhì)量,生長(zhǎng)速率以g DW/(L·d)表示。

    1.4 印楝素的提取與測(cè)定

    參照文獻(xiàn)[15]的方法用甲醇萃取干細(xì)胞中的印楝素。萃取液用0.45 μm 濾膜過(guò)濾,清液采用HPLC法檢測(cè)樣品中印楝素的含量。色譜條件:C-18柱,乙腈∶水(10∶90)為流動(dòng)相,流速0.5mL/min,檢測(cè)波長(zhǎng)214nm,柱溫30℃。以1g干愈傷組織中印楝素(mg)表示印楝素含量,產(chǎn)量以mg/L 表示,比產(chǎn)率以mg/(g·d)表示。

    1.5 數(shù)據(jù)處理

    數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 與Design Expert 8.0.6統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 接種量與通氣比對(duì)印楝懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)和印楝素產(chǎn)量的影響

    從表中看出,當(dāng)固定通氣比為0.2vvm,不同接種量條件下印楝懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)和印楝素合成的變化情況。當(dāng)接種量為20~60g FW/L時(shí),印楝懸浮細(xì)胞的生長(zhǎng)速率和印楝素的比產(chǎn)率隨接種量的增大而增大,接種量為60g FW/L 時(shí)達(dá)最大,分別為0.75 g DW/(L·d)和0.55mg/(g·d);當(dāng)接種量達(dá)80g FW/L時(shí),印楝懸浮細(xì)胞的生長(zhǎng)速率和印楝素的比產(chǎn)率又開(kāi)始下降,細(xì)胞干重和印楝素含量降低。因此,綜合考慮細(xì)胞生長(zhǎng)和印楝素的累積,接種量為60g FW/L較適宜。

    從表中還可知,當(dāng)接種量為60g/L 時(shí),不同通氣比條件下,細(xì)胞生長(zhǎng)和印楝素的累積隨通氣比的增大呈先升后降的趨勢(shì)。當(dāng)通氣比為0.20vvm時(shí),細(xì)胞生長(zhǎng)量最大和印楝素積累量最多,分別為11.41g DW/L 和8.32 mg/g;當(dāng)繼續(xù)增大通氣比時(shí),細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制,印楝素累積降低。因此,適宜的通氣比為0.2vvm。

    表 不同接種量與通氣比條件下印楝懸浮細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況與印楝素的產(chǎn)量Table Growth of A.indicasuspension cell and azadirachin yield under different inoculum size and compression-ventilation ratio

    2.2 發(fā)酵過(guò)程中培養(yǎng)基pH 變化及加入誘導(dǎo)子后的印楝素產(chǎn)量

    從圖1看出,接種量60g/L、通氣比為0.2vvm時(shí),發(fā)酵過(guò)程中培養(yǎng)基的pH 呈先降后升的變化趨勢(shì)。在發(fā)酵9d左右達(dá)最低值。可能是隨著發(fā)酵時(shí)間的進(jìn)行,培養(yǎng)基中的糖被利用,產(chǎn)生有機(jī)酸,使pH 值降低;隨著發(fā)酵時(shí)間的進(jìn)一步延長(zhǎng),pH 又逐漸回升,可能與后期產(chǎn)生的一些堿性物質(zhì)有關(guān)。整個(gè)發(fā)酵期間,pH 變化范圍在4.8~6.4。

    從圖1還可知,加入誘導(dǎo)子2d內(nèi),隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)印楝素累積量逐漸增加,在誘導(dǎo)子加入后48h,印楝素累積量達(dá)最大,為8.32 mg/g,此后隨著發(fā)酵時(shí)間的進(jìn)一步延長(zhǎng),印楝素累積量略有下降,但降幅很小。

    2.4 發(fā)酵過(guò)程中細(xì)胞的生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)及印楝素的產(chǎn)量變化

    從圖2可知,在發(fā)酵過(guò)程中印楝懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)基本呈S型曲線。與搖瓶發(fā)酵相比,印楝懸浮細(xì)胞在發(fā)酵罐中的生長(zhǎng)略差,在培養(yǎng)9d 時(shí)為搖瓶的90%左右,可能的原因是在發(fā)酵罐中的條件還沒(méi)有達(dá)到最佳狀態(tài),特別是光照,與搖瓶培養(yǎng)存在差異。糖類物質(zhì)消耗,發(fā)酵罐中印楝懸浮細(xì)胞對(duì)糖類物質(zhì)的利用并不完全,在發(fā)酵結(jié)束時(shí)培養(yǎng)基中未被利用的蔗糖為0.8%~1.0%??梢?jiàn),在發(fā)酵罐培養(yǎng)時(shí)可以適當(dāng)降低糖類物質(zhì)的濃度。添加復(fù)合誘導(dǎo)子的細(xì)胞生長(zhǎng)與底物消耗與對(duì)照相比,在誘導(dǎo)子加入后略有差異(P>0.05)。從圖2還可知,在細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)期的末期(第8天)添加復(fù)合誘導(dǎo)子,印楝素的積累效果極顯著。添加誘導(dǎo)子的24h后印楝素產(chǎn)量最,達(dá)94.78mg/L,與對(duì)照相比差異達(dá)極顯著水平(P<0.01)。

    圖1 發(fā)酵過(guò)程中培養(yǎng)基的pH 變化及加入誘導(dǎo)子后印楝素的產(chǎn)量Fig.1 Azadirachin yield of pH variation and inductor during the fermentation process

    圖2 發(fā)酵過(guò)程中細(xì)胞生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)及印楝素的產(chǎn)量Fig.2 Growth dynamic and azadirachtin yield of A.indica suspension cells during the fermentation process

    3 結(jié)論與討論

    1)接種量和通氣比是影響發(fā)酵罐中懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)和產(chǎn)物積累最重要的2個(gè)因素。接種量過(guò)小,不能充分利用發(fā)酵液中的有效成分,在相同的發(fā)酵時(shí)間內(nèi),細(xì)胞增量小,要達(dá)到最大生長(zhǎng)量,會(huì)延長(zhǎng)發(fā)酵時(shí)間,降低設(shè)備的利用率。接種量過(guò)大,細(xì)胞競(jìng)爭(zhēng)有限的營(yíng)養(yǎng)成分,對(duì)懸浮細(xì)胞的生長(zhǎng)不利;通氣比大小影響發(fā)酵液的傳質(zhì)和傳熱。通氣比低,發(fā)酵液的傳熱傳質(zhì)效果不好,影響懸浮細(xì)胞對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收和利用,從而影響懸浮細(xì)胞的生長(zhǎng)和印楝素的合成;通氣比過(guò)大,容易導(dǎo)致細(xì)胞損傷,進(jìn)而影響細(xì)胞生長(zhǎng)量和印楝素的合成。

    2)在細(xì)胞生長(zhǎng)的不同時(shí)期加入誘導(dǎo)子對(duì)產(chǎn)物的積累效果不同。細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)期一般包括延遲期、指數(shù)期和穩(wěn)定期3個(gè)時(shí)期,不同時(shí)期加入刺激劑誘導(dǎo)效果不同。Cu2+對(duì)紅豆杉懸浮培養(yǎng)細(xì)胞中紫杉醇形成的影響最大的是生長(zhǎng)指數(shù)期末期,在指數(shù)生長(zhǎng)期末紅豆杉培養(yǎng)細(xì)胞對(duì)Cu2+誘導(dǎo)處理具有最強(qiáng)的反應(yīng)能力[16]。研究發(fā)現(xiàn),水楊酸、萘乙酸、殼聚糖和吲哚丁酸組合的復(fù)合誘導(dǎo)子對(duì)印楝素的積累具有顯著效果,且最適添加時(shí)期為細(xì)胞的指數(shù)生長(zhǎng)期末期(另文發(fā)表)。誘導(dǎo)子刺激細(xì)胞合成最大目的產(chǎn)物所需要的時(shí)間各不相同,有的時(shí)間較長(zhǎng),有的時(shí)間較短[17]。本研究加入復(fù)合誘導(dǎo)子后獲得最大印楝素含量所需的時(shí)間為48h,與Prakash等人[18]在3L的生化發(fā)酵罐中利用復(fù)合誘導(dǎo)子誘導(dǎo)印楝懸浮細(xì)胞積累最大量印楝素所需時(shí)間一致。

    3)通過(guò)5L 氣升式發(fā)酵罐研究印楝懸浮細(xì)胞初步擴(kuò)大培養(yǎng),探明了適宜的接種量和通氣比分別為60g/L和0.2vvm,在此條件下,懸浮培養(yǎng)基質(zhì)中的pH 變化呈先降后升趨勢(shì),細(xì)胞干重和印楝素產(chǎn)量分別為11.41g DW/L 和8.32 mg/g,添加復(fù)合誘導(dǎo)子后24h,印楝素產(chǎn)量最大值(94.78 mg/L)。在反應(yīng)器中,印楝懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)和印楝素產(chǎn)量呈偶聯(lián)型。

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