優(yōu)良玉米雜交種金玉818指紋圖譜構(gòu)建及其純度鑒定

蘭琴英，陳澤輝，祝云芳，王安貴，郭向陽，胡 興，陳建軍

（1.貴州大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，貴州 貴陽550025；2.貴州省旱糧研究所，貴州 貴陽550006）

種子質(zhì)量是綜合種子不同特性而形成的一種概念，包括品種質(zhì)量（真實性和純度）和播種質(zhì)量（凈、壯、飽、健、干、強等）[1]。品種的真實性和純度是評價種子質(zhì)量的重要指標(biāo)[2]。隨著我國種子市場的開放，部分營銷商在利益驅(qū)動下以劣充優(yōu)，銷售假冒偽劣品種，不僅影響品種優(yōu)良遺傳性狀的充分發(fā)揮，導(dǎo)致作物產(chǎn)量和質(zhì)量下降，還對國家、企業(yè)和農(nóng)民造成巨大損失。品種的真實性檢驗和純度鑒定是防止假冒偽劣種子進(jìn)入市場的重要手段[3]。因此，建立簡便、經(jīng)濟(jì)、快速、準(zhǔn)確的玉米種子真實性和純度鑒定技術(shù)對種子生產(chǎn)經(jīng)營部門和廣大農(nóng)民具有重要意義。傳統(tǒng)的種子真實性和純度鑒定技術(shù)側(cè)重形態(tài)及生理生化特征的區(qū)別，具有簡單、經(jīng)濟(jì)的特點，但是耗時耗力。DNA 分子標(biāo)記技術(shù)的不斷成熟，為在分子水平上鑒定作物品種提供了有力的工具。DNA分子標(biāo)記技術(shù)本質(zhì)上指能反應(yīng)生物個體或種群間基因組中某種差異的特異性DNA 片段[4]，其大多以電泳譜帶的形式表現(xiàn)生物個體之間DNA 差異，因此也稱DNA 指紋圖譜[5]。DNA 指紋圖譜技術(shù)側(cè)重檢測DNA 分子水平差異，可克服常規(guī)鑒定技術(shù)的不足。DNA 指紋技術(shù)所用標(biāo)記有RFLP 標(biāo)記、RAPD 標(biāo) 記、AFLP 標(biāo) 記、ISSR 標(biāo) 記、SSR 標(biāo) 記 和SNP標(biāo)記?；赟SR 標(biāo)記具有數(shù)量幾乎無限，信息含量高，多數(shù)為共顯性標(biāo)記，重復(fù)性好，多態(tài)性檢出的頻率極高，需DNA 樣品量少，對DNA 質(zhì)量要求不高，實驗程序簡單等優(yōu)點，成為鑒定品種真實性和純度最廣泛的分子標(biāo)記[6－7]。

近年來，前人在利用SSR 標(biāo)記構(gòu)建玉米DNA指紋圖譜的研究方面作了大量工作，均認(rèn)為利用SSR 標(biāo)記技術(shù)鑒定玉米品種真實性和純度的方法是可行的。趙久然等[8]從158對SSR 引物中篩選10對核心引物用于構(gòu)建玉米自交系和雜交種指紋庫，為玉米品種鑒定提供了很大方便；李曉輝等[9]用50對SSR 引物構(gòu)建86個玉米雜交種的DNA 指紋圖譜數(shù)據(jù)庫，確定10對核心引物和判別標(biāo)準(zhǔn)用于親子鑒定研究；邱紅波等[10]利用86對SSR 引物分析了36份喀斯特高海拔山區(qū)玉米骨干自交系的多態(tài)性，確立34對核心引物用于該地區(qū)玉米骨干自交系的真實性和純度鑒定；蓋樹鵬等[11]從74對SSR 引物中篩選出10對和20對分別構(gòu)建了35份骨干自交系和19份主栽雜交種的指紋圖譜；劉龍州、沈童偉、郭向陽、王 安 貴 等[12－15]將SSR 標(biāo) 記 用 于 玉 米 品種真實性及純度鑒定研究。

金玉818 是貴州省旱糧研究所用自選系QB506作父本、T32 作母本組配而成的玉米雜交種，2010年通過貴州省農(nóng)作物品種審定委員會審定，2011年通過云南省農(nóng)作物品種審定委員會審定。金玉818具有高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗病性強、耐旱性好和籽粒商品性好等特點，深受農(nóng)民的喜愛。在國家農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化資金和貴州省科技成果重點推廣計劃項目資助下，2011—2014年在貴州及云南的種植面積超過33 000hm2以上。為鑒定市場流通的金玉818種子的真實性和純度，筆者等通過選用40對國家標(biāo)準(zhǔn)SSR 引物對金玉818進(jìn)行DNA 指紋圖譜分析，試圖從中篩選能有效鑒定金玉818真實性和純度的SSR 引物，以期為快速、準(zhǔn)確鑒定金玉818真實性和純度提供依據(jù)，為金玉818品種保護(hù)和規(guī)范其銷售市場提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試材料 標(biāo)準(zhǔn)玉米雜交種金玉818及其親本T32和QB506用于純度鑒定，廢棄的雜交種金玉818用于純度鑒定，供試材料均由貴州省旱糧研究所提供。

1.1.2 主 要 試 劑 dNTP、TagDNA 聚 合 酶、MgCl2、10×緩沖液等購自北京天根生物技術(shù)有限公司，其他試劑均購自上海生工生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 選擇的SSR 引物 農(nóng)業(yè)部指定的玉米SSR 標(biāo)準(zhǔn)引物40對（表1），引物由上海生工生物有限公司（Sangon）合成。

1.2 DNA提取

參考Saghai－Maroof，M.A.等的CTAB 法并加以改進(jìn)[16]。

用于指紋圖譜構(gòu)建的DNA（大量提取）：取標(biāo)準(zhǔn)金玉818及其親本材料種子于25℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)7d，待玉米長到4葉一芯時，稱取20株單株的混合葉片0.2g于研缽加液氮研成粉末，加入1 mL 65℃預(yù)熱好的2%CTAB（含1%β－me），轉(zhuǎn)移到2mL PE管；65℃水浴30 min，期間上下顛倒2 次，取出冷卻至室溫；加入等體積（1 mL）的氯仿：異戊醇（24∶1），上 下 顛 倒10 min，10 000r／min 離 心10min；取上清至新的2mL PE 管中，并加入1mL－20℃預(yù)冷的無水乙醇；用槍頭（已滅菌）挑取析出的DNA 至1.5mL PE 管中，并用70%的乙醇洗2遍，室溫晾干；加50μL ddH2O，置于4℃冰箱過夜。用GeneQuant1300分光光度計檢測DNA 的質(zhì)量和濃度，ddH2O 將DNA 樣品濃度稀釋至50ng／μL作為標(biāo)準(zhǔn)樣品，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

用于純度鑒定的DNA（微量提取）：取金玉818種子500粒于25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7d。待玉米長到4葉一芯時，用0.5mL PE管蓋取葉片，加入3顆不銹鋼珠，加入100μL65℃預(yù)熱好的2%CTAB（含1%β－me），放研磨機上研磨；置65℃烘箱中30min，其間上下顛倒2次，取出冷卻至室溫；加入等體積的（100μL）氯仿∶異戊醇（24∶1），上下顛倒10min，置冷凍離心機上3 000r／min離心10min；分別取上清至PCR 板上，加等體積－20℃預(yù)冷的無水乙醇，靜置10min沉淀DNA，短暫離心，棄乙醇，用70%乙醇洗滌DNA，3 000r／min離心10min，棄乙醇，自然晾干；加200μL ddH2O，4℃保存?zhèn)溆谩?次重復(fù)，每次隨機取樣100個單位作為鑒定樣品。

1.3 SSR分析

擴(kuò)增反應(yīng)在DNA－Engine（美國BIO－RAD公司生產(chǎn)）擴(kuò)增儀上進(jìn)行。

PCR 反應(yīng)體系：ddH2O 4.6μL，10×Buffer 1 μL，2.5 mmol／L Mg2＋1μL，2.5 mmol／L dNTP 0.2μL，5 U／μL TagDNA 聚 合 酶0.2 μL，5μmol／LSSR 引物（F＋R）2μL，50ng／μL DNA 1μL。

PCR 反應(yīng)程序：94℃5 min，1 次循環(huán)；94℃變性40s，60℃退火35s，72℃延伸45s，進(jìn)行35次循環(huán)；終延伸：72℃10min，形成的擴(kuò)增產(chǎn)物于4℃保存。

電泳檢測：用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠分離SSR 擴(kuò)增產(chǎn)物。固定：5%冰醋酸＋10%無水乙醇，蒸餾水洗2次；銀染：0.15%硝酸銀銀染，蒸餾水洗2次；顯影：1.5%氫氧化鈉＋1 mL 甲醛溶液（2 塊膠），蒸餾水洗2次；照相，獲得雜交種和親本的指紋圖譜。

1.4 指紋圖譜構(gòu)建

篩選多態(tài)性好、清晰穩(wěn)定的引物構(gòu)建金玉818指紋圖譜，并對指紋圖譜進(jìn)行數(shù)字化，在相同的遷移位置上（相同的分子量片段）無帶記為0，有帶記為1，建立數(shù)據(jù)庫。參考文獻(xiàn)[17－18]，計算出現(xiàn)相同指紋圖譜的概率，計算公式為P＝1／2n，式中n為等位基因的數(shù)目，2為同一遷移率位點上的等位基因存在“有”、“無”2種關(guān)系。

1.5 種子純度鑒定

根據(jù)構(gòu)建的指紋圖譜，從篩選出適用于金玉818純度鑒定的引物中任選3對對供試金玉818進(jìn)行純度鑒定驗證。

種子純度＝[（供檢測品種種子樣本帶型數(shù)－雜種種子樣本帶型數(shù)）／供檢測品種種子樣本帶型數(shù)]×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 金玉818的指紋圖譜構(gòu)建

2.1.1 SSR 引物分析 40對標(biāo)準(zhǔn)SSR 引物對金玉818及其親本進(jìn)行同源性位點擴(kuò)增和電泳檢測，共檢測到87個等位基因位點，每對引物檢測出1～5個，平均2.42個（表1）。絕大多數(shù)引物在供試自交系中擴(kuò)增出1條片段，但部分引物在某些自交系中擴(kuò)增出2條或更多條帶，這可能與基因組內(nèi)存在多個與引物結(jié)合的靶位點等因素有關(guān)[19]。40對引物中未擴(kuò)增出電泳帶譜的引物4對，擴(kuò)增成功的引物36對，雙親間沒有多態(tài)性的引物11對，表現(xiàn)多態(tài)性的引物有25 對，多態(tài)性頻率檢出率較高（62.5%）。多拷貝引物、差異帶為弱帶或差異不易分辨的引物5 對，雜交種偏母本型引物有4 對（umc2105k3，umc2115k3，umcl23lk4，bnlg490y4），偏父本型的引物為umc2007y4，能夠清晰、穩(wěn)定、準(zhǔn)確地鑒別出金玉818及其親本且雙親呈互補帶型的引物有15 對（umc1335y5，phi053k2，bnlg2305k4，bnlg16lk8，umc1545y2，umc1125y3，bnlg240kl，phi080k15，umc1147y4，umc1429y7，phi299852y2，umc2160k3，umc2084w2，umc1936k4，bnlg2235y5）。

2.1.2 指紋圖譜構(gòu)建 選擇25 對具有多樣性的引物，構(gòu)建金玉818指紋圖譜，共檢測出68個等位基因，每一對引物可以檢測到2～5個數(shù)目不等的等位基因。能作為檢測金玉818品種真實性和純度的引物有15 對，頻率為37.5%。圖1 為部分引物（phi053k2，bnlg2305k4，bnlg16lk8，umc1545y2，umc1125y3，bnlg240kl，umc1147y4，bnlg490y4）的擴(kuò)增結(jié)果，擴(kuò)增片段和農(nóng)業(yè)部提供的參照樣品的擴(kuò)增片段大小一致。這15對引物中片段大小在100～200bp有6對（bnlg16lk8，umc1125y3，umc1147y4，umc1429y7，umc1936k4，bnlg2235y5）；在200～300 bp 有8 對 （umc1335y5，bnlg2305k4，umc1545y2，bnlg240kl，phi080k15，phi299852y2，umc2160k3，umc2084w2）；在 300 ～400 bp 僅 有 1 對（phi053k2）。

表1 玉米SSR40對標(biāo)準(zhǔn)引物的名稱、序列及SSR 檢測的等位基因數(shù)Table 1 The name and sequence of 40primers and the number of alleles detected by SSR

圖1 部分引物對金玉818及其親本的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖譜Fig.1 Partial PCR amplification product electrophoresis of hybrid Jinyu818and its parents identified by SSR primers

bnlg16lk8、umc1125y3和umc1429y7均擴(kuò)增出2條條帶（父本、母本只有1條特異性條帶），清晰、穩(wěn)定、片段間分子量差距較大，片段大小在100～200 bp；phi053k2擴(kuò)增出2條條帶（父本、母本均只有1條特異性條帶），雖然擴(kuò)增片段大小在300～400 bp，但條帶清晰、穩(wěn)定、片段間分子量差距較大、特異性強、易于讀帶；umc1147y4雖然有4條條帶（父本、母本均有2條特異性條帶），但片段大小在100～200bp，且清晰、穩(wěn)定、片段間分子量差距較大、特異性強、易于讀帶；bnlg2305k4 擴(kuò)增出2 條條帶（父本、母本均只有1條特異性條帶），片段大小為100～200bp，且清晰、穩(wěn)定、特異性強。綜合考慮引物擴(kuò)增片段的數(shù)量、片段大小及片段間分子量差異大小等 因 素，bnlg16lk8、umc1125y3、umc1429y7、phi053k2、umc1147y4和bnlg2305k4可作為鑒定金玉818真實性和純度的最佳引物。

2.1.3 指紋圖譜數(shù)字化 將25 對引物擴(kuò)增片段數(shù)字化，使金玉818及其親本的指紋圖譜均用相應(yīng)的數(shù)字表示。由表2 可知，QB506 分別由68 位順序不同的數(shù)字碼組成，出現(xiàn)與其完全相同數(shù)字的概率為3.39×10－21（P＝1／268），即在2.95×1020（268）份自交系中，只有1份自交系具有上述指紋號碼相同。理論上利用這25對核心引物構(gòu)建玉米自交系指紋圖譜文庫是完全可行的。因此，用這25對SSR引物構(gòu)建指紋圖譜，表2 中指紋號碼是自交系QB506、T32和雜交種金玉818特有的號碼，它們構(gòu)成其相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)的數(shù)字化指紋圖譜，可以用于鑒定其真?zhèn)巍?/p>

表2 金玉818及其親本的數(shù)字化指紋圖譜Table 2 The digitization fingerprinting of hybrid Jinyu818and its parents

2.2 種子純度鑒定

可用于金玉818純度鑒定的引物有15對，從中任意選擇3對（phi053k2，bnlg16lk8，umc1429y7）引物對供試金玉818 純度進(jìn)行鑒定。phi053k2、bnlg16lk8和umc1429y7檢測供試金玉818種子純度分別為92.5%、92%和93.5%，平均為92.5%，這些引物純度鑒定結(jié)果吻合度高，說明，篩選出的引物應(yīng)用于金玉818的純度鑒定較為可靠。

從 圖2 看 出，引 物phi053k2、bnlg16lk8 和umc1429y7對1～30 號DNA 的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳檢測結(jié)果，條帶清晰，擴(kuò)增效果較好。phi053k2檢測發(fā)現(xiàn)，2號、11號、26號和29號DNA 的條帶與F1DNA 的條帶不同，并且這4個DNA 條帶也各不相同；2號、11號和29號DNA 存在兩條條帶，其中一條與母本的特異性條帶相同，另一條不同于母本、父本的特異性條帶；26號DNA 的條帶為偏父本型。phi053k2可以檢測出這4 個DNA 的差異，說明phi053k2靈敏度較高。bnlg16lk8檢測結(jié)果表明，2號、11號和29號DNA 的條帶與F1DNA 的條帶不同，且都含有母本特異性條帶，29號為偏母本型。umc1429y7與bnlg16lk8檢測結(jié)果一致。這3對引物檢測2號、11號和29號DNA 的條帶與F1DNA條帶不同，均含有母本特異性條帶，而另一條不同于母本、父本的特異性條帶，說明，2號、11號和29號植株很可能在制種過程中有其他花粉混雜。phi053k2檢測出26 號DNA 的條帶為偏父本型，bnlg16lk8 和umc1429y7 檢 測 出26 號DNA 的 與F1沒有差別，說明26號植株為雜株。

圖2 phi053k2、bnlg16lk8和umc1429y7對1～30號DNA的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測結(jié)果Fig.2 The PCR amplification product electrophoresis of No.1～30DNA identified by SSR primers phi053k2，bnlg16lk8and umc1429y7

3 結(jié)論與討論

1）研究從40對國家標(biāo)準(zhǔn)SSR 引物中篩選25對多態(tài)性好、清晰、穩(wěn)定的引物構(gòu)建金玉818指紋圖譜，共檢測出68個等位基因，每一對引物可以檢測到2～5個數(shù)目不等的等位基因，并進(jìn)行數(shù)字化，出現(xiàn)與所獲相同指紋圖譜的概率為3.39×10－21，理論上利用這些引物構(gòu)建金玉818及其親本的指紋圖譜是可行的。研究所獲相同指紋圖譜的概率高于吳渝生等[17]的研究結(jié)果（6.3×10－30），低于趙久然等[8]的研究結(jié)果。這不僅與供試材料、引物的數(shù)量、多態(tài)性程度有關(guān)，而且與選擇的計算方法有關(guān)。吳渝生等運用的概率計算公式為P＝1／2n（n為等位基因數(shù)目），而趙久然等運用的概率計算公式為P＝1／N（自交系N＝n，雜交種N＝Cn1＋Cn2，n為所用引物的等位基因數(shù)）。目前，從理論上計算所獲圖譜出現(xiàn)概率的研究相對較少，應(yīng)用較多的主要是以上2種計算方式。趙久然等認(rèn)為，利用P＝1／2n計算出現(xiàn)相同圖譜概率偏低，而P＝1／N 公式更接近玉米指紋圖譜的真實情況。實際上生物個體的SSR 指紋圖譜是由不同位點上的、不同類型的等位基因組合而成。等位基因的表型是通過同一個位點上擴(kuò)增、電泳的條帶的有、無及數(shù)量而確定的。玉米品種間具有的多態(tài)性條帶數(shù)目越多，建立的指紋圖譜就越準(zhǔn)確[20－21]。P＝1／2n和P＝1／N 計算出現(xiàn)相同圖譜概率值主要取決于等位基因數(shù)，當(dāng)?shù)任换蜻_(dá)到一定數(shù)目時，上述兩個公式計算出現(xiàn)與之完全相同的另一張圖譜的概率微小，所建圖譜表現(xiàn)出該品種特異性。因此，P＝1／2n和P＝1／N 均可為玉米品種真?zhèn)舞b定的提供依據(jù)。從統(tǒng)計學(xué)理論角度考慮，吳渝生等所用的公式P＝1／2n計算出現(xiàn)相同圖譜概率更為恰當(dāng)。因此，本研究參考吳渝生等的計算方法。

2）指紋圖譜構(gòu)建顯示，15 對引物適用于金玉818品種真實性和純度鑒定，最佳引物是bnlg16lk8、umc1125y3、umc1429y7、phi053k2、umc1147y4 和bnlg2305k4。從15 對候選引物中隨機選擇phi053k2、bnlg16lk8 和umc1429y7 檢測廢棄 金玉818種子純度，其結(jié)果分別為92.5%、92% 和93.5%，平均92.5%，表明，所選引物純度鑒定結(jié)果吻合度高，應(yīng)用于金玉818的純度鑒定較為可靠。

3）研究在純度鑒定技術(shù)中采用微量提取DNA的方法，恒溫烘箱代替水浴鍋溫浴，與傳統(tǒng)提取法相比，不僅節(jié)約稱量和研磨所需時間，而且提取的DNA 質(zhì)量較好，濃度較一致，能大大加快實驗進(jìn)程。所構(gòu)建的指紋圖譜用于金玉818鑒定是可行的，引物篩選和方法的改進(jìn)為快速、準(zhǔn)確的鑒定其真實性和純度提供依據(jù)，對今后優(yōu)化金玉818種子生產(chǎn)環(huán)節(jié)、規(guī)范種子市場和保障企業(yè)和農(nóng)民的合法權(quán)益具有重要意義。

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