急性高原反應(yīng)大鼠模型的建立及多指標(biāo)綜合評價(jià)

王馳，晏沐陽，段晉燕，陳靜雯，黃杰，關(guān)旭，向代軍，姜輝，王成彬

急性高原反應(yīng)大鼠模型的建立及多指標(biāo)綜合評價(jià)

王馳，晏沐陽，段晉燕，陳靜雯，黃杰，關(guān)旭，向代軍，姜輝，王成彬

目的建立大鼠急性高原反應(yīng)模型，探討動物模型的建立條件與各綜合評價(jià)指標(biāo)。方法采用國產(chǎn)低氣壓艙模擬高原環(huán)境，70只雄性Wistar大鼠在常壓常氧環(huán)境(正常對照組)和低壓艙模擬海拔5000m、6000m分別放置12、24、48h，每組10只，觀察大鼠在艙內(nèi)的行為。Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測大鼠空間記憶能力，腹主動脈取血檢測動脈血氧分壓，觀察大鼠肺、腦組織病理學(xué)變化并測定肺組織與腦組織濕/干重比值。結(jié)果大鼠在低氣壓艙內(nèi)活動減少甚至死亡，大鼠動脈血氧分壓明顯低于正常對照組。Morris水迷宮空間探索實(shí)驗(yàn)中，與正常對照組相比，低氣壓艙模擬急性高原反應(yīng)分別在海拔5000m維持24h后與海拔6000m維持12h后的大鼠尋找平臺潛伏期延長、目標(biāo)象限停留時(shí)間縮短、穿越平臺次數(shù)減少(P<0.05)。肺、腦組織在低壓艙模擬兩個(gè)海拔處理48h后均出現(xiàn)病理學(xué)變化，大鼠肺組織、腦組織濕/干重比值均增加。結(jié)論采用低壓艙干預(yù)復(fù)制大鼠急性高原病模型，可出現(xiàn)不同指標(biāo)的異常，且時(shí)間點(diǎn)不同?？刹捎枚鄠€(gè)不同指標(biāo)對此模型進(jìn)行綜合評價(jià)，從而為高原反應(yīng)動物實(shí)驗(yàn)提供依據(jù)和判定方法。

急性高原??；模型，動物；水迷宮

平原人群短時(shí)間內(nèi)進(jìn)入海拔3000m以上地區(qū)時(shí)，因無法在短時(shí)間內(nèi)適應(yīng)高原低氧環(huán)境而出現(xiàn)一系列非特異性癥狀[1]，進(jìn)而發(fā)展為急性高原病[2]。海拔3000～5000m地區(qū)急性高原病發(fā)病率在某些地區(qū)可能高達(dá)50%[3]，可進(jìn)一步發(fā)展為高原肺水腫、高原腦水腫等致命性疾病，對高原地區(qū)經(jīng)濟(jì)發(fā)展、部隊(duì)進(jìn)駐高原地區(qū)執(zhí)行緊急任務(wù)和醫(yī)療救治造成嚴(yán)重影響[4]。目前，極少有以志愿者作為受試對象進(jìn)入低氧環(huán)境來模擬急性高原病的試驗(yàn)研究[5-6]，動物模型是急性高原病研究的主要手段，早在20世紀(jì)40年代就有學(xué)者觀察大鼠在低壓低氧環(huán)境下的生理情況、體重、血流量的變化[7-9]。但對于急性高原病動物模型復(fù)制所采用的缺氧方法、時(shí)間和海拔高度等尚不統(tǒng)一，5000～8000m的海拔高度多見于復(fù)制大鼠急性高原病模型，極限高度可達(dá)9000m[10-11]。

高原地區(qū)的調(diào)查研究表明，在急進(jìn)高原人群中最常見的癥狀是頭痛[12]，提示急性高原病早期腦功能的改變可能在組織損傷或血清學(xué)指標(biāo)變化前就已經(jīng)出現(xiàn)。海馬更易受到低氧的影響，在低氧時(shí)表現(xiàn)出學(xué)習(xí)記憶能力的下降[13]。水迷宮作為最常見的反應(yīng)學(xué)習(xí)記憶能力行為學(xué)實(shí)驗(yàn)，可以用來評價(jià)低氣壓艙處理后大鼠腦功能的改變[14-15]。本研究旨在探索海拔高度與低氧處理時(shí)間對大鼠各項(xiàng)指標(biāo)的影響，為選擇最適海拔和低氧處理時(shí)間進(jìn)行急性高原病模型復(fù)制、在平原地區(qū)進(jìn)行急性高原病預(yù)防治療的分子機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物與分組 SPF級Wistar大鼠70只，雄性，體重220±10g(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心，動物合格證號：SCXK-(軍)2012-0004)。大鼠飼養(yǎng)于動物中心清潔房中，溫度21～24℃，濕度50%～60%，晝夜12h節(jié)律，自由進(jìn)食飲水。自由飼養(yǎng)3d后隨機(jī)分為7組，每組10只。正常對照組(NC group)在低氣壓艙外常壓常氧環(huán)境處理；低氧處理組分為5000m和6000m兩個(gè)海拔高度，于12、24、48h時(shí)間點(diǎn)給予低壓干預(yù)(5000m/12h組、5000m/24h組、5000m/48h組、6000m/12h組、6000m/24h組、6000m/48h組)。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器和設(shè)備 低壓低氧治療艙/實(shí)驗(yàn)動物艙(煙臺冰輪高壓氧艙有限公司，設(shè)備編號：10-UWC800-02)；Morris水迷宮圖像自動采集處理系統(tǒng)(北京Xeye科技有限公司)；電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司，編號400607045105)；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱；全自動血?dú)夥治鰞x(Roche，cobas-b-221)。

1.3 低氣壓艙模擬高原急性缺氧大鼠模型的復(fù)制

采用低氣壓艙進(jìn)行不同海拔與時(shí)間的低氧處理，每組10只。將大鼠放入低氣壓艙，密閉艙門，利用真空泵將艙內(nèi)空氣部分抽出模擬高原低壓低氧環(huán)境，以2m/s速度減壓，模擬上升至海拔5000m或6000m，每隔4～6h給予新鮮空氣流通(換氣過程中保證艙內(nèi)壓力穩(wěn)定)，氧艙維持溫度22～24℃。期間大鼠自由飲食飲水，按照實(shí)驗(yàn)分組完成預(yù)定缺氧時(shí)間后，調(diào)節(jié)進(jìn)氣閥門，以2m/s速度降至海拔4000m，進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，以2m/s速度降至正常海拔高度。觀察各組大鼠在此期間的行為、呼吸頻率、活動量。

1.4 空間記憶功能測試 Morris水迷宮檢測系統(tǒng)由一個(gè)直徑160cm、高60cm的水池和圖像采集分析系統(tǒng)兩部分組成。水池平均劃分為4個(gè)象限，象限池壁圓弧中點(diǎn)為可選的動物入水點(diǎn)，圖像采集分析系統(tǒng)記錄動物游泳軌跡數(shù)據(jù)。

1.4.1 定位航行實(shí)驗(yàn) 所有大鼠在氧艙外常壓常氧環(huán)境下進(jìn)行為期5d的定位導(dǎo)航實(shí)驗(yàn)，每天于固定時(shí)間段訓(xùn)練4次。將平臺置于某一象限，從池壁4個(gè)起始點(diǎn)的任一點(diǎn)將大鼠面向池壁放入水池，由錄像記錄系統(tǒng)記錄大鼠找到平臺的時(shí)間(逃避潛伏期)和游泳路徑圖。規(guī)定每次的實(shí)驗(yàn)時(shí)間為120s，如果大鼠在120s內(nèi)未能找到平臺，則將其引導(dǎo)至平臺，在平臺上停留10s以上，兩次訓(xùn)練時(shí)間間隔在60s以上。以大鼠4次訓(xùn)練潛伏期的平均值作為大鼠當(dāng)日的學(xué)習(xí)成績。

1.4.2 空間探索實(shí)驗(yàn) 撤除原平臺，將平臺所在象限的對側(cè)象限作為大鼠的入水點(diǎn)，所有大鼠必須為同一入水點(diǎn)，記錄大鼠在60s內(nèi)跨越平臺的次數(shù)、目標(biāo)象限內(nèi)停留時(shí)間和尋找平臺潛伏期。NC組大鼠在進(jìn)行完5d的定位航行實(shí)驗(yàn)后24h在常壓常氧環(huán)境下進(jìn)行水迷宮探索實(shí)驗(yàn)，記錄逃避潛伏期、目標(biāo)象限停留時(shí)間和穿越平臺次數(shù)。各低壓低氧處理組大鼠在經(jīng)不同海拔和低氧處理相應(yīng)時(shí)間后，在海拔4000m的安全環(huán)境下，進(jìn)行水迷宮探索實(shí)驗(yàn)，記錄各組大鼠的上述指標(biāo)，與NC組進(jìn)行對比。

1.5 血?dú)鉁y定 各組大鼠在水迷宮探索實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，從艙內(nèi)取出，按照1ml/kg劑量立即給予腹腔注射10%水合氯醛麻醉，大鼠取仰臥位，暴露腹腔后分離出腹主動脈，抽取腹主動脈血約1ml，放入肝素抗凝管，30min內(nèi)進(jìn)行血?dú)夥治觥?/p>

1.6 大鼠肺、腦組織取材 剝離腦組織，觀察腦組織大體病理改變。切取右側(cè)腦組織標(biāo)本，4%多聚甲醛固定24h、石蠟包埋，4μm切片，裱于清潔載玻片上，常規(guī)脫蠟、復(fù)水、PBS洗滌后進(jìn)行HE染色。大鼠麻醉后仰臥位，打開胸腔觀察肺組織大體病理改變，取左側(cè)肺組織固定、包埋，制作切片及HE染色其余步驟同上。

1.7 肺、腦組織濕/干重測定 取剩余左腦組織，準(zhǔn)確稱重后，放入恒溫烘干箱100℃烘烤24h至恒重后，稱取腦干重(精確到0.01g)。取右側(cè)肺組織準(zhǔn)確稱重后，放入恒溫烘干箱烘烤方法同上，稱取肺干重。計(jì)算腦、肺組織濕/干重比值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。符合正態(tài)分布和方差齊的定量資料用表示，采用析因設(shè)計(jì)方差分析，比較模擬海拔和低氧處理的時(shí)間兩個(gè)因素對大鼠水迷宮逃避潛伏期、目標(biāo)象限停留時(shí)間、穿越平臺次數(shù)、血?dú)夂头?、腦組織干濕重是否有交互作用；采用單因素方差分析比較多個(gè)樣本均數(shù)，組間進(jìn)一步兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)；采用t檢驗(yàn)進(jìn)行兩樣本均數(shù)的比較。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠基本情況 正常組大鼠的活動、呼吸全程無明顯變化，不同海拔模擬組均出現(xiàn)呼吸節(jié)律的變化，還可見呼吸暫停，活動減少、行動遲緩、飲食飲水減少。在海拔5000m/48h組、6000m/24h組和6000m/48h組分別出現(xiàn)1只、2只和3只大鼠死亡。

2.2 空間記憶功能測試

2.2.1 水迷宮定位航行實(shí)驗(yàn) 在Morris水迷宮定位航行試驗(yàn)中，大鼠尋找隱藏平臺的逃避潛伏期隨訓(xùn)練天數(shù)增加逐漸下降，表明大鼠在訓(xùn)練過程中的空間學(xué)習(xí)記憶能力是正常的(圖1)。

2.2.2 水迷宮空間探索實(shí)驗(yàn) 兩因素析因分析海拔和低氧處理時(shí)間兩個(gè)因素之間有交互作用(P<0.05)，則固定其中一個(gè)因素(海拔或低氧處理時(shí)間)，分析另一個(gè)因素的單獨(dú)效應(yīng)(表1)。與NC組相比，5000m/12h組大鼠的逃避潛伏期、目標(biāo)象限停留時(shí)間和穿越平臺次數(shù)均無明顯變化(P>0.05)，其他5組大鼠的逃避潛伏期延長(P<0.05)，目標(biāo)象限停留時(shí)間縮短(P<0.05)，穿越平臺次數(shù)減少(P<0.05)。5000m/24h組和5000m/48h組間3項(xiàng)指標(biāo)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。6000m/12h、6000m/24h和6000m/48h組間的大鼠水迷宮各項(xiàng)指標(biāo)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。6000m/12h組與5000m/12h組比較，水迷宮各項(xiàng)指標(biāo)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而5000m/24h組和6000m/24h組、5000m/48h組和6000m/48h組比較，水迷宮各項(xiàng)指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。圖2為各組大鼠Morris水迷宮探索實(shí)驗(yàn)代表性運(yùn)動軌跡圖，用于分析逃避潛伏期、目標(biāo)象限停留時(shí)間和穿越平臺次數(shù)3個(gè)指標(biāo)，NC組大鼠運(yùn)動軌跡集中在平臺周圍，5000m/12h組變化不明顯，其余5組均可見在平臺周圍的軌跡減少。結(jié)果表明，大鼠尋找平臺的能力在低氧處理后下降，與上述指標(biāo)結(jié)果一致。

2.3 肺、腦組織病理學(xué)表現(xiàn) 與NC組相比，腦組織在低氧處理后未觀察到大體形態(tài)改變。光鏡下觀察顯示，NC組腦組織結(jié)構(gòu)正常，細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)完好，5000m/12h、5000m/24h組、6000m/12h組和6000m/24h組大鼠腦組織均未見明顯異常，5000m/48h組與6000m/48h組可見腦組織神經(jīng)元細(xì)胞水腫，神經(jīng)元數(shù)量減少，細(xì)胞和血管周圍間隙增大(圖3)。低氧處理后大鼠肺組織與NC組相比無大體形態(tài)變化，光鏡下可見NC組肺組織形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，肺泡腔中未見滲出液，肺泡壁光滑。5000m/12h組、5000m/24h組、6000m/12h組和6000m/24h組大鼠肺組織未見明顯異常，5000m/48h組與6000m/48h組可見大鼠肺間隔增寬、肺泡壁增厚，可見炎細(xì)胞浸潤，肺泡結(jié)構(gòu)破壞(圖4)。

圖1 大鼠訓(xùn)練期間逃避潛伏期變化Fig.1 Changes of escape latency during training course(1)P<0.05 compared with 1st day; (2)P<0.05 compared with 2nd day; (3)P<0.05 compared with 3rd day; (4)P<0.05 compared with 4th day

表1 各組大鼠Morris水迷宮探索實(shí)驗(yàn)逃避潛伏期、目標(biāo)象限停留時(shí)間和穿越平臺次數(shù)的比較(±s，n=7)Tab. 1 Comparison of escape latency, time spent in target quadrant and frequency of crossing platform among rats of seven groups (x±s, n=7)

表1 各組大鼠Morris水迷宮探索實(shí)驗(yàn)逃避潛伏期、目標(biāo)象限停留時(shí)間和穿越平臺次數(shù)的比較(±s，n=7)Tab. 1 Comparison of escape latency, time spent in target quadrant and frequency of crossing platform among rats of seven groups (x±s, n=7)

(1)P<0.05 compared with NC group; (2)P<0.05 compared with 5000m/24h group; (3)P<0.05 compared with 5000m/12h group; (4)P<0.05 compared with 6000m/12h group; (5)P<0.05 compared with 6000m/24h group

Item NC group 5000m group 6000m group 12h 24h 48h 12h 24h 48h Escape latency (s) 20.45±8.41 23.98±5.02 30.62±8.12(1)36.28±7.79(1)(2)29.33±6.59(1)(3)32.88±5.44(1)(4)40.19±7.29(1)(5)Time spent in target quadrant (s) 29.36±4.54 28.26±3.02 19.48±3.64(1)14.56±3.65(1)(2)21.37±3.38(1)(3)16.54±2.97(1)(4)12.28±3.15(1)(5)Frequency of crossing platform (time) 4.25±1.04 4.13±1.13 2.50±1.20(1) 1.63±0.92(1)(2) 3.00±0.76(1)(3) 2.38±1.06(1)(4) 1.13±0.84(1)(5)

圖2 各組大鼠Morris水迷宮探索實(shí)驗(yàn)代表性運(yùn)動軌跡圖Fig. 2 Representative tack sheet showing memory test of NC group and hypobaric hypoxia groupsA. Normal control group; B. 5000m/12h group; C. 5000m/24h group; D. 5000m/48h group; E. 6000m/12h group; F. 6000m/24h group; G. 6000m/48h group

圖3 各組大鼠腦組織病理觀察(HE×400)Fig. 3 Histopathology observation of cerebrum tissues in rats of seven groups (HE×400)A. Normal structure of normal cerebrum in control group; B. No clear change of cerebrum in 5000m/12h group; C. No clear change of cerebrum in 5000m/24h group; D. Pathological changes of cerebrum in 5000m/48h group, enlarged perivascular space, edematous brain neurons and fewer number of neurons can be observed; E. No clear change of cerebrum in 6000m/12h group; F. No clear change of cerebrum in 6000m/24h group; G. Similar changes of cerebrum in 6000m/48h group compared with that in 5000m/48h

圖4 各組大鼠肺組織病理觀察(HE×200)Fig. 4 Histopathology observation of lung tissues in rats of seven groups (HE×200)A. Normal structure of alveoli in normal control group, with distinct alveolar space and no exudation in the interstitial space; B. No clear changes of alveoli in 5000m/12h group; C.No clear changes of alveoli in 5000m/24h group; D. Pathological changes of alveoli in 5000m/48h group, with hyperemic alveolar wall, hyperplastic alveolar epithelium and inflammatory cells infiltration; E. No clear changes of alveoli in 6000m/12h group; F. No clear changes of alveoli in 6000m/24h group; G. Pathological changes of alveoli in 6000m/48h group, similar to that in 5000m/48h group

2.4 動脈血?dú)獾淖兓?與NC組比較，6個(gè)低壓干預(yù)組大鼠動脈血?dú)庀陆?P<0.05，表2)，5000m/12h組、5000m/24h組和5000m/48h組間大鼠血?dú)獠町愑薪y(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，隨著低氧時(shí)間延長血?dú)庵饾u下降，海拔6000m處理的3組大鼠血?dú)庾兓厔菖c5000m處理相同，即隨時(shí)間延長而下降(P<0.05)。低氧處理12、24h的兩個(gè)海拔組之間動脈血?dú)獠町愑薪y(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表現(xiàn)為6000m/12h組血?dú)獾陀?000m/12h組，6000m/24h組低于5000m/24h組(P<0.05)，而6000m/48h組與5000m/48h組大鼠的動脈血?dú)庵g差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.5 肺、腦組織濕/干重測定 與NC組相比，5000m/12h組、5000m/24h組、6000m/12h組和6000m/24h組大鼠肺、腦組織濕/干重差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。5000m/48h和6000m/48h組大鼠肺、腦組織濕/干重均顯著增加(P<0.05)，且后者高于前者(P<0.05，表2)。

表2 各組大鼠肺組織、腦組織濕/干重和動脈血?dú)庵笜?biāo)PaO2比較(±s，n=7)Tab. 2 Comparison of arterial blood gas PaO2, cerebral wet/dry ratio and lung wet/dry ratio in rats of seven groups (±s,n=7)

表2 各組大鼠肺組織、腦組織濕/干重和動脈血?dú)庵笜?biāo)PaO2比較(±s，n=7)Tab. 2 Comparison of arterial blood gas PaO2, cerebral wet/dry ratio and lung wet/dry ratio in rats of seven groups (±s,n=7)

(1)P<0.05 compared with NC group; (2)P<0.05 compared with 5000m/12h group; (3)P<0.05 compared with 5000m/24h group; (4)P<0.05 compared with 6000m/12h group; (5)P<0.05 compared with 6000m/24h group; (6)P<0.05 compared with 5000m/48h group

Item NC group 5000m group 6000m group 12h 24h 48h 12h 24h 48h PaO2(mmHg) 86.08±5.81 74.37±9.87(1)68.72±10.14(1)(2)60.41±11.43(1)(3)72.49±8.33(1)(2)65.29±9.14(1)(3)(4)59.28±10.52(1)(5)Wet/dry ratio (cerebrum)4.04±0.46 4.18±0.52 4.36±0.68 5.09±0.41(1) 4.22±0.34 4.38±0.37 5.28±0.39(1)(6)Wet/dry ratio (lung) 3.82±0.48 3.89±0.57 3.98±0.36 5.31±0.51(1) 3.94±0.62 4.19±0.45 5.68±0.31(1)(6)

3 討 論

急進(jìn)高原引起的高海拔缺氧使機(jī)體出現(xiàn)組織代謝障礙和各系統(tǒng)功能紊亂。研究高原急性缺氧對機(jī)體損傷的機(jī)制及相應(yīng)的防治措施是當(dāng)前高原醫(yī)學(xué)面臨的迫切問題。開展高原醫(yī)學(xué)研究，需要解決的首要問題是急性高原病動物模型的復(fù)制。目前，對人群急性高原病的診斷采用路易斯湖評分標(biāo)準(zhǔn)或國內(nèi)急性高原病診斷標(biāo)準(zhǔn)[16-18]，主要根據(jù)高原低氧環(huán)境下出現(xiàn)的一系列癥狀，進(jìn)行量化評分來診斷急性高原病。但動物模型復(fù)制后，因?yàn)闊o法像人一樣對動物進(jìn)行癥狀的評分量化，因此需要選擇其他指標(biāo)進(jìn)行動物急性高原病模型成功與否的判斷。

以往研究對急性高原病動物模型采用病理切片觀察來判斷模型復(fù)制效果或用藥治療效果，但組織學(xué)出現(xiàn)改變通常晚于體內(nèi)發(fā)生的代謝改變，因而近幾年有選擇血清或組織中的酶(例如乳酸脫氫酶、ATP酶等)或其他代謝物(例如乳酸、MDA、SOD 等)表達(dá)變化作為急性高原病模型復(fù)制成功與否的判斷[10]，但目前對急性高原病動物模型復(fù)制成功與否的評價(jià)和模擬高原的條件尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。

大腦對高原低氧非常敏感，Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)?zāi)芊从炒笫罂臻g學(xué)習(xí)記憶能力，是記憶量化的良好指標(biāo)，其中空間探索實(shí)驗(yàn)用于測試動物空間記憶的能力。已有文獻(xiàn)顯示低氣壓艙處理大鼠后可導(dǎo)致大鼠尋找平臺的逃避潛伏期縮短、目標(biāo)象限停留時(shí)間縮短和跨越平臺次數(shù)的減少，提示低氧環(huán)境下記憶能力降低[19-21]。本研究采用低氣壓艙模擬不同海拔高度并維持不同的低氧時(shí)間，水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在模擬海拔高度5000m低氧處理12h后大鼠的空間記憶能力與常氧對照組無明顯差異，提示大腦記憶功能未出現(xiàn)下降，說明在此處理?xiàng)l件下尚未出現(xiàn)急性高原反應(yīng)，可能是處理時(shí)間過短，動物未出現(xiàn)低氧反應(yīng)，但仍需要增大樣本量進(jìn)一步探索。模擬海拔高度5000m維持24h后和模擬海拔高度6000m維持12h后，大鼠水迷宮的探索實(shí)驗(yàn)與常氧對照組均出現(xiàn)明顯差異，表現(xiàn)為逃避潛伏期延長、目標(biāo)象限停留時(shí)間縮短和穿越平臺次數(shù)下降，但腦組織在6000m低氧處理12h后尚未見明顯形態(tài)學(xué)改變，可能為組織形態(tài)的變化晚于記憶能力的變化，提示水迷宮反應(yīng)大腦功能的下降比組織形態(tài)更為敏感。

動脈血氧分壓可作為評價(jià)機(jī)體缺氧狀態(tài)的指標(biāo)，在低氧處理后12h已經(jīng)出現(xiàn)變化，表現(xiàn)為低于NC組，且隨著低氧處理時(shí)間的延長，氧分壓下降更明顯，可在低氧早期對大鼠的低氧情況進(jìn)行評價(jià)。

病理切片在低氧處理12、24h組無論是海拔5000m還是6000m都未見明顯異常改變，在低氧處理48h后出現(xiàn)腦、肺組織水腫和肺組織炎性浸潤的病理改變。同樣在低氧處理48h后出現(xiàn)濕/干重增加且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

綜上所述，對于急性高原病大鼠模型復(fù)制的評價(jià)指標(biāo)，水迷宮實(shí)驗(yàn)較病理切片和組織濕/干重比值敏感，在模擬海拔6000m低氧處理12h已經(jīng)出現(xiàn)大腦記憶能力的下降，但該實(shí)驗(yàn)耗時(shí)長且實(shí)驗(yàn)造價(jià)高；組織病理切片和濕/干重在模擬高原環(huán)境短時(shí)間(24h)后均無明顯改變，出現(xiàn)變化的時(shí)間在48h以后。而動脈血?dú)夥治鲈诘脱跆幚碓缙?12h)即出現(xiàn)下降。對于急性高原病模型條件的探索，由于模擬海拔5000m處理12h因?yàn)槟X功能和組織學(xué)均未出現(xiàn)變化；而模擬海拔5000m處理24h后和海拔6000m處理12h后均可認(rèn)為出現(xiàn)腦記憶能力下降，且根據(jù)已有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)(未列出)在模擬海拔6000m，大鼠的水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果存在個(gè)體差異(部分水迷宮提示空間記憶能力變化不明顯，部分出現(xiàn)記憶能力下降)，提示水迷宮作為檢測中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能尤其是記憶能力的一個(gè)敏感指標(biāo)，反映了不同大鼠對低氧敏感性的差異，為進(jìn)一步研究急性高原病個(gè)體差異的動物模型提供依據(jù)。

實(shí)驗(yàn)所用的低氣壓艙為經(jīng)醫(yī)用高壓氧艙改造后的高低壓兩用艙，低壓裝填模擬高原可達(dá)10 000m。本實(shí)驗(yàn)過程中，實(shí)驗(yàn)人員經(jīng)過渡倉進(jìn)入實(shí)驗(yàn)艙內(nèi)，在低氣壓模擬高原環(huán)境下直接開展Morris水迷宮探索實(shí)驗(yàn)進(jìn)行模型動物記憶能力的檢測。減少因干預(yù)條件變化帶來的影響，提供了更為準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)結(jié)果。

本研究針對急性高原病模型復(fù)制過程中大鼠病理組織形態(tài)、大腦空間記憶能力、動脈血?dú)庖约胺?、腦組織干濕重進(jìn)行檢測，根據(jù)查閱的文獻(xiàn)選擇2個(gè)海拔(5000m和6000m)和3個(gè)檢測時(shí)間點(diǎn)(12、24、48h)作為模擬條件，發(fā)現(xiàn)不同指標(biāo)在不同時(shí)間和海拔出現(xiàn)的變化有差異并對各個(gè)方法的優(yōu)點(diǎn)劣勢進(jìn)行評價(jià)，對高原病防治的分子生物學(xué)研究構(gòu)建正確的動物模型有重要意義。

[1]Li M, Gao XB, Yu J,et al. Current situation and progression of objective auxiliary diagnosis for acute mountain sickness[J]. Med J Chin PLA, 2013, 38(9): 777-780. [李明, 高旭濱, 余潔, 等. 急性高原反應(yīng)客觀輔助診斷的現(xiàn)狀及展望[J]. 解放軍醫(yī)學(xué)雜志, 2013, 38(9): 777-780.]

[2]Luks AM, McIntosh SE, Grissom CK,et al. Wilderness medical sacidty practice guidelines for the prevention and treatment of acute altitude illness: 2014 update[J]. Wilderness Environ Med, 2014, 25(Suppl 4): S4-S14.

[3]Netzer N, Strohl K, Faulhaber M,et al. Hypoxia-related altitude illness[J]. J Travel Med, 2013, 20(4): 247-255.

[4]Wu TY, Li SZ, Hou SK. "Rescue the rescuers", how may it be prevented?—A special challenge in high altitude medicine during the Yushu Earthquake[J]. Negative, 2014, 5(2): 1-9. [吳天一, 李素芝, 候世科.“救援救援者”, 如何不再現(xiàn)？—玉樹地震對高原醫(yī)學(xué)的一個(gè)特殊挑戰(zhàn)[J]. 醫(yī)學(xué)爭鳴, 2014, 5(2): 1-9.]

[5]MacInnis MJ, Carter EA, Koehle MS,et al. Exhaled nitric oxide is associated with acute mountain sickness susceptibility during exposure to normobaric hypoxia[J]. Respir Physiol Neurobiol, 2012, 180(1): 40-44.

[6]Colleen GJ, Andrew WS, Ryan CH,et al. Exploratory proteomic analysis of hypobaric hypoxia and acute mountain sickness in humans[J]. J Appl Physiol, 2014, 116(7): 937-944.

[7]Blood FR, Damour FE. Physiology of the rat at high altitudes[J]. Fed Proc, 1946, 5(1): 9.

[8]Reissmann K. Investigations on the mechanism of changes in the blood during high altitude adaptation in parabiotic rats[J]. Q Res Rep, 1948, 60(2): 8.

[9]Altland PD. Effects of discontinuous exposure to 25,000 ft simulated altitude on the body weight and reproductive system of immature rats[J]. Anat Rec, 1946, 96(4): 523.

[10] Ma HP, Wu JH, Gao RM,et al. Establishment of an animal model for acute mountain sickness with a decompression chamber[J]. Pharm J Chin PLA, 2013, 29(4): 301-304. [馬慧萍, 吳金華, 高榮敏等. 低壓氧艙模擬急性高原缺氧動物模型建立的初探[J]. 解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào), 2013, 29(4): 301-304.]

[11] Kanika J, Geetha S, Rajendra P,et al. Upregulation of cytoprotective defense mechanisms and hypoxia- responsive proteins imparts tolerance to acute hypobaric hypoxia[J]. High Alt Med Biol, 2013, 14(1): 65-77.

[12] Javier V O, Eduardo G, Casimiro J,et al. Human behaviour and development under high-altitude conditions[J]. Dev Sci, 2006, 9(4): 400-410.

[13] Charles VV, Michael TW. Morris water maze: procedures for assessing spatialand related forms of learning and memory[J]. Nat Protoc, 2006, 1(2): 848-858.

[14] Barbara SH, Micheal JS, David IW,et al. Hypobaric hypoxia impairs spatial memory in an elevation- dependent fashion[J]. Behavioral and Neural Biology, 1994, 62(3): 244-252.

[15] Vorhees CV, Williams MT. Value of water mazes for assessing spatial and egocentric learning and memory in rodent basic research and regulatory studies[J]. Neurotoxicol Teratol, 2014, 45(9): 75-90.

[16] Burtscher M, Wille M, Menz V,et al. Symptom progression in acute mountain sickness during a 12-hour exposure to normobaric hypoxia equivalent to 4500m[J]. High Alt Med Biol, 2014, 15(4): 446-451.

[17] Ren YS, Fu ZM , Shen WM,et al. Incidence of high altitude illnesses among unacclimatized persons who acutely ascended to Tibet[J]. High Alt Med Biol, 2010, 11(1): 39-42.

[18] Chen GZ, Qin J, Yu J,et al. Incidence of acute mountain sickness in young adults at 3200 meters: comparison of the Lake Louise Scoring and Chinese Scoring Systems[J]. Genet Mol Res, 2013, 12(4): 6790-6801.

[19] Jain V, Baitharu I, Prasad O,et al. Enriched environment prevents hypobaric hypoxia induced memory impairment and neurodegeneration: role of BDNF/PI3K/GSK3b pathway coupled with CREB activation[J]. PLoS One, 2013, 8(5): 1-11.

[20] Hota SK, Barhwal K, Baitharu I,et al. Bacopa monniera leaf extract ameliorates hypobaric hypoxia induced spatial memory impairment[J]. Neurobiol Dis, 2009, 34(1): 23-39.

[21] Zhang YC, Li YM, Jia YY,et al. Influence of simulated high attitude anoxia on rats learning and memory and pathological changes of brain tissue[J]. Med J Nat Def Forces Southwest Chin, 2014, 24(4): 432-435. [張艷超, 李運(yùn)明, 賈玉英等, 模擬高原缺氧對大鼠學(xué)習(xí)記憶的影響及腦組織病理改變[J]. 西南國防醫(yī)藥, 2014, 24(4): 432-435.]

Reproduction of a rat model of acute high-altitude sickness and evaluation of its related indexes

WANG Chi1, YAN Mu-yang2, DUAN Jin-yan1, CHEN Jing-wen2, HUANG Jie1, GUAN Xu2, XIANG Dai-jun1, JIANG Hui2, WANG Cheng-bin11Department of Clinical Laboratory,2Department of Hyperbaric Chamber, General Hospital of PLA, Beijing 100853, China
*< class="emphasis_italic">Corresponding authors. WANG Cheng-bin, E-mail: wangcb301@126.com; JKANG Hui, E-mail: jm7111@163.com

s. WANG Cheng-bin, E-mail: wangcb301@126.com; JKANG Hui, E-mail: jm7111@163.com

ObjectiveTo reproduce a rat model of acute mountain sickness by using a hypobaric chamber to simulate the plateau environment, and to study the related physiological parameters.MethodsA total of 70 male Wistar rats were randomly divided into normal control (NC) group, and 6 hypobaric hypoxia groups (10 each) in which rats were housed in a hypobaric chamber and exposed to the enviroment simulating high altitude of 5000m and 6000m for 12h, 24h and 48h respectively. Memory Morris water maze test was conducted to evaluate the changes in working memory of rats in space. Histological changes in lung and brain tissue were observed. Blood from abdominal aorta was collected to analyze the parameters of blood gas. The histopathological changes in lung and cerebrum were observed, and their wet/dry ratios were calculated.ResultsReduction in activity or even death was found in hypobaric hypoxia groups, and arterial PaO2was significantly decreased in all rats of hypobaric hypoxia groups. Compared with NC group, rats exposed to a simulated altitude of 5000m for longer than 24h and 6000m for longer than 12h exhibited longer latency period in finding the hidden platform, shorter expedition time for target quadrant, and less frequency of platform crossing in the Morris water maze test (P<0.05). After exposure to simulated altitudes of both 5000m and 6000m for 48h, pathological changes were observed in lung and cerebrum, and wet/dry ratio of lung and brain was significantly increased compared with that of NC group.ConclusionIndexes of rat model of acute mountain sickness by using a hypobaric chamber show different changes at respective time points. Therefore the changes in multiple physiological indexes of mountain sickness can be assessed by using this animal model.

acute mountain sickness; models; animal; water maze

R339.54；R322.35

A

0577-7402(2015)09-0716-06

10.11855/j.issn.0577-7402.2015.09.06

2015-05-05

2015-07-30)

(責(zé)任編輯：李恩江)

王馳，碩士研究生。主要從事急性高原病發(fā)病機(jī)制及藥物防治研究

100853 北京 解放軍總院臨床檢驗(yàn)科(王馳、段晉燕、向代軍、王成彬)；100853 北京 解放軍總醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)中心高壓氧科(晏沐陽、陳靜雯、黃杰、關(guān)旭、姜輝)

王成彬，E-mail：wangcb301@126.com；姜輝，E-mail：jm7111@163.com