CREG1蛋白對血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的小鼠心功能損傷的影響

宋海旭，李洋，孫鳴宇，彭程飛，田孝祥，閆承慧，韓雅玲

·基礎(chǔ)研究·

CREG1蛋白對血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的小鼠心功能損傷的影響

宋海旭，李洋，孫鳴宇，彭程飛，田孝祥，閆承慧，韓雅玲

目的探討E1A激活基因阻遏子(CREG1)蛋白能否改善心肌纖維化小鼠的心功能。方法應(yīng)用基因打靶方法建立廣泛性基因敲除的CREG1雜合子小鼠和CREG1野生型小鼠模型。應(yīng)用血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)皮下埋泵方法建立小鼠心肌纖維化損傷模型，給予AngⅡ刺激14d后，采用HE和Masson染色檢測小鼠心肌纖維化情況。應(yīng)用Western blotting和免疫組化染色技術(shù)檢測給予AngⅡ前及3、7、14d后兩組小鼠心肌中CREG1蛋白的表達(dá)，并于給予AngⅡ14d后應(yīng)用小動物超聲儀檢測心功能情況。AngⅡ給藥同時，以皮下埋泵方式分別給予15、30、60、300μg/(kg·d)的外源性重組CREG1蛋白(治療組)和生理鹽水(對照組)14d，檢測心功能，并應(yīng)用TUNEL染色和Western blotting檢測心肌凋亡情況。結(jié)果Western blotting和免疫組化檢測結(jié)果顯示，未給予AngⅡ刺激時雜合子小鼠心肌中CREG1蛋白表達(dá)明顯低于野生型小鼠(P<0.05)。給予AngⅡ刺激3、7、14d時，野生型小鼠和雜合子小鼠心肌中CREG1蛋白表達(dá)均明顯下降(P<0.05)，但雜合子小鼠下降更為顯著(P<0.01)；HE和Masson染色顯示雜合子小鼠心肌纖維化程度較野生型小鼠嚴(yán)重，二者心功能明顯下降，且雜合子小鼠心功能下降更為明顯(P<0.05)。給予外源性重組CREG1蛋白治療后，治療組心功能較對照組明顯改善(P<0.05)，心肌凋亡數(shù)量明顯下降(P<0.05)。結(jié)論在AngⅡ引起的小鼠心肌纖維化模型中，CREG1蛋白減少可使小鼠心功能損傷加重，給予外源性重組CREG1蛋白可明顯改善心功能。

E1A激活基因阻遏子；心肌纖維化；心功能

我國每年有300萬人死于心血管疾病，占全部死亡例數(shù)的40%[1]。心肌纖維化(cardiac fibrosis，CF)是心肌損傷后成纖維細(xì)胞過度修復(fù)造成的病理改變，始發(fā)于各種誘因引起的心肌細(xì)胞損傷和死亡，繼而心肌間質(zhì)成纖維細(xì)胞激活、增殖并分泌大量膠原引起組織重構(gòu)和CF發(fā)生。CF是多種心臟疾病終末期的共同病理改變，也是心功能由代償期向失代償期轉(zhuǎn)換的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。CF的演進(jìn)最終導(dǎo)致惡性心律失常、心功能不全和心源性死亡[2-3]。有效預(yù)防或逆轉(zhuǎn)CF的發(fā)生，遏制心血管疾病的演進(jìn)已成為目前心血管疾病研究的重點(diǎn)方向。

E1A激活基因阻遏子(cellular repressor of E1A stimulated genes，CREG1)編碼蛋白是一種在成熟組織細(xì)胞中廣泛表達(dá)的小分子量分泌型糖蛋白，具有維持組織和細(xì)胞成熟分化的重要生理功能[4-5]。CREG1蛋白由220個氨基酸構(gòu)成，含有3個M6P糖基化位點(diǎn)，能與M6P受體相互作用。免疫熒光染色顯示CREG1存在于循環(huán)內(nèi)吞體、溶酶體和質(zhì)膜上，但其在細(xì)胞內(nèi)的功能尚不清楚[6-7]。已有研究發(fā)現(xiàn)，CREG1在心臟組織中高表達(dá)，且過表達(dá)CREG1能夠?qū)垢哐獕汉椭鲃用}縮窄引起的心功能障礙和心肌重構(gòu)[8-9]。上述研究提示CREG1可能作為一種心肌細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)調(diào)控因子，參與心肌細(xì)胞的生理性適應(yīng)和病理性損傷調(diào)控。本研究以血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ，AngⅡ)刺激后的CF小鼠為病理模型，嘗試闡明CREG1蛋白在小鼠心功能調(diào)控中的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及主要試劑 C57BL/6CREG+/+小鼠(8周齡)60只，雜合子CREG+/–小鼠(8周齡)24只，體重約25g，由沈陽軍區(qū)總醫(yī)院動物實(shí)驗(yàn)科提供。AngⅡ由美國Sigma公司提供；外源性重組CREG1蛋白由美國Abcam公司提供；Model 1004微滲透泵由美國Alzet公司提供；抗CREG1、β-actin抗體由美國Abcam公司提供；Vevo 2100小動物超聲儀由加拿大維勝公司提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動物模型及分組 AngⅡ溶于0.9% NaCl后注入微滲透泵中，以皮下埋泵的方式植入每只小鼠皮下，按1.5mg/(kg.d)劑量給藥14d后檢測GREG+/+和GREG+/–小鼠心肌纖維化情況。將濃度為15、30、60、300μg/(kg·d)的外源性重組CREG1蛋白和生理鹽水分別注入微滲透泵中，以皮下埋泵的方式植入AngⅡ給藥組CREG+/+小鼠皮下，連續(xù)給藥14d。給予外源性重組CREG1蛋白的CREG+/+小鼠為治療組(不同濃度給藥治療組各6只)，注入生理鹽水的為對照組(n=6)。

1.2.2 Western blotting檢測 取未給予AngⅡ和給予AngⅡ3、7、14d的小鼠心臟組織，以及給予AngⅡ同時給予外源性重組CREG1蛋白的小鼠心臟組織。采用BCA比色法試劑盒測定裂解液(Sigma公司)中的蛋白質(zhì)濃度，將45μg蛋白加入4×Loading Buffer，95℃煮沸5min后，經(jīng)10%分離膠行SDS-PAGE電泳，判斷電泳終止時間。以350mA的電流將樣品轉(zhuǎn)到纖維素膜上，時間為80min；在TBS-T稀釋的5%脫脂奶粉中常溫封閉1.5h后加入一抗(抗CREG1抗體1:1000，抗β-actin抗體1:2000)4℃孵育過夜；第2天放置搖床上搖晃半小時后TBS-T洗膜3次，每次15min；加入兔抗鼠二抗(1:1000稀釋)，常溫孵育2h，TBS-T洗膜4次，每次20min；ECL化學(xué)發(fā)光顯影。

1.2.3 免疫組化染色 對經(jīng)藥物處理14d小鼠的心臟標(biāo)本取材后，進(jìn)行石蠟包埋，切片后脫蠟，抗原修復(fù)。滴加過氧化酶阻斷液，室溫10min，PBS洗3次，滴加非免疫動物血清，室溫20min，除去血清后滴加一抗(1:100)，4℃過夜；第2天常溫放置30min，PBS洗3次，滴加二抗，室溫10min，PBS洗3次后滴加過氧化酶溶液，室溫10min，PBS洗3次，最后DAB顯色，蘇木素復(fù)染、返藍(lán)、脫水、二甲苯脫洗、封片。

1.2.4 超聲檢測 小鼠埋泵14d后，應(yīng)用Vevo 2100小動物超聲儀檢測各組小鼠心功能。

1.2.5 HE染色 取埋泵14d心肌組織石蠟包埋、切片，脫蠟后染色，具體染色步驟：切片放入蘇木精水溶液中染色15min，鹽酸乙醇中分化數(shù)秒，氨水返藍(lán)10min，伊紅染色5min，95%乙醇數(shù)秒，100%乙醇2min，100%乙醇5min，二甲苯中透明10min，封片。

1.2.6 Masson染色 取埋泵14d后小鼠心肌組織石蠟包埋、切片，脫蠟后蘇木精染色10min，過水后鹽酸乙醇分化，水洗后Masson麗春紅酸性復(fù)紅液染色10min，2%冰醋酸水溶液浸洗，1%磷鉬酸水溶液分化5min，直接用苯胺藍(lán)染色5min，再以0.2%冰醋酸浸洗片刻，95%乙醇、100%乙醇脫蠟，二甲苯透明，封片。

1.2.7 TUNEL染色 配制染色所需試劑后，將冰凍組織切片置于4%的多聚甲醛中室溫固定10min，PBS洗2次，每次10min。置3%過氧化氫甲醇溶液中20min，PBS洗3次，每次5min，置0.1%枸櫞酸鈉中(冰上)2min，UNEL染色配制液加入樣本表面后37℃溫箱孵育1h，避光；PBS浸洗，DAPI染色細(xì)胞核。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以表示，兩組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 AngⅡ刺激后小鼠心肌組織中CREG1蛋白表達(dá)情況 應(yīng)用基因打靶方法構(gòu)建CREG基因敲除小鼠，經(jīng)鑒定只有野生型CREG小鼠(CREG+/+)和雜合子CREG小鼠(CREG+/–)存活，CREG基因敲除小鼠發(fā)生胚胎期死亡。Western blotting和免疫組化檢測證實(shí)，CREG+/+小鼠心肌中CREG1蛋白表達(dá)明顯高于CREG+/–小鼠(P<0.05，圖1)。應(yīng)用AngⅡ埋泵給藥后3、7、14d，兩組小鼠心肌中CREG1蛋白表達(dá)均明顯降低，且雜合子CREG+/–小鼠降低更加明顯(P<0.01，圖2)，而給藥14d時，Western blotting結(jié)果顯示兩組小鼠心肌均未檢測到CREG1蛋白表達(dá)。同時，給予AngⅡ刺激14d后超聲心功能檢測發(fā)現(xiàn)，雜合子CREG+/–小鼠心功能顯著下降(P<0.05，圖3)。

圖1 未給予AngⅡ刺激時CREG+/+和CREG+/–小鼠心肌中CREG1蛋白的表達(dá)Fig.1 Expression of CREG1 protein in myocardium of CREG+/+and CREG+/–mice untreated by AngⅡ

圖2 應(yīng)用AngⅡ埋泵給藥不同時間兩組小鼠心肌中CREG1蛋白的表達(dá)Fig.2 Expression of CREG1 protein in myocardium of CREG+/+and CREG+/–mice stimulated by AngⅡ for 3, 7 and 14 days

2.2 給予外源性重組CREG1蛋白后小鼠心功能的

超聲檢測結(jié)果顯示，外源性重組CREG1蛋白治療14d后，治療組小鼠心功能明顯改善且呈劑量依賴性。與對照組比較，0.3mg/(kg·d) CREG1蛋白治療組心功能改善最為顯著，已基本恢復(fù)至正常水平(P<0.05，圖4)。

2.3 CREG1蛋白治療前后小鼠CF情況 應(yīng)用HE和Masson染色檢測外源性重組CREG1蛋白治療前后CREG+/+小鼠CF情況，結(jié)果顯示：與對照組相比，治療組小鼠CF得到明顯改善(圖5)。TUNEL染色結(jié)果顯示，CREG+/+小鼠給予外源性重組CREG1蛋白14d后心肌凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯減少(P<0.05，圖6)；Western blotting檢測顯示，CREG+/+小鼠給予外源性重組CREG1蛋白14d后凋亡指標(biāo)cleaved caspase3表達(dá)明顯減少(P<0.05，圖6)。

3 討 論

原發(fā)或繼發(fā)性高血壓等心血管疾病發(fā)展到一定的病理階段便會形成CF，損傷心功能，最終導(dǎo)致器官衰竭[10]。引起CF的機(jī)制十分復(fù)雜，涉及腎素-血管緊張素系統(tǒng)[11-12]、TGF-β1[4]和氧化應(yīng)激反應(yīng)等。AngⅡ是CF形成機(jī)制中的一個重要因素[13-16]，其本身及產(chǎn)物可以誘導(dǎo)心肌成纖維細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)蛋白產(chǎn)生[17]，最終導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡和間質(zhì)纖維化[18]。

圖3 給予AngⅡ刺激14d后兩組小鼠心功能超聲檢測結(jié)果Fig.3 Echocardiographic detection of cardiac function after AngⅡ stimulation for 14 days

圖4 給予不同濃度外源性重組CREG1蛋白治療14d后CREG+/+小鼠心功能超聲檢測結(jié)果Fig.4 Cardiac function of GREG+/+mice administered with exogenous recombination CREG1 in di ff erent concentrations for 14 days

圖5 給予外源性重組CREG1蛋白0.3mg/(kg·d) 14d后CREG+/+小鼠CF情況Fig.5 Myocardial fibrosis of CREG+/+mice treated with 0.3mg/(kg·d) of exogenous recombination CREG1 for 14 days

CREG1作為一種在組織中廣泛分布的小分子量糖蛋白，在心臟組織中高表達(dá)。既往研究已證實(shí)，過表達(dá)的CREG1能夠?qū)垢哐獕阂鸬男呐K肥大[19-20]；而本研究發(fā)現(xiàn)，與野生型小鼠相比，CREG1表達(dá)減少的雜合子小鼠明顯不能耐受AngⅡ誘導(dǎo)的CF損傷，心功能在給藥后14d嚴(yán)重惡化，提示在AngⅡ刺激條件下，心肌中CREG1蛋白的表達(dá)減少與心功能惡化密切相關(guān)。同時本研究發(fā)現(xiàn)，給予外源性CREG1蛋白可明顯改善小鼠因AngⅡ刺激導(dǎo)致的心功能惡化，且呈濃度依賴性，同時心肌細(xì)胞纖維化程度也明顯受到抑制。這一現(xiàn)象提示CREG1蛋白可能通過抑制AngⅡ引起的CF來改善心臟功能。

圖6 給予外源性重組CREG1蛋白14d后CREG+/+小鼠心肌細(xì)胞凋亡情況Fig.6 Apoptosis of myocardial cells of CREG+/+mice treated with 0.3mg/(kg·d) of exogenous recombination CREG1 for14 daysA. TUNEL staining (the arrows showed the apoptosis of myocardial cells); B. Western blotting. (1)P<0.05 compared with control group

本研究顯示給予外源性重組CREG1蛋白能夠降低AngⅡ刺激后的心肌凋亡細(xì)胞數(shù)量，并逆轉(zhuǎn)CF的發(fā)生發(fā)展。本課題組前期研究已證實(shí)，CREG1蛋白具有促進(jìn)平滑肌成熟分化[21]，對抗骨髓干細(xì)胞中TNF-α引起的凋亡[22]，減少動脈粥樣硬化內(nèi)皮細(xì)胞凋亡[23]，調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移[24]等作用。提示CREG1蛋白可能通過抑制心肌細(xì)胞凋亡進(jìn)而對抗CF的進(jìn)展。因此，本研究進(jìn)一步檢測了CREG1蛋白治療前后心肌組織凋亡的發(fā)生情況，與預(yù)期相似，在CREG1蛋白治療和同時AngⅡ給藥刺激14d后，TUNEL染色和Western blotting檢測結(jié)果均提示CREG1蛋白可能通過對抗小鼠心肌細(xì)胞凋亡而起到抑制AngⅡ誘導(dǎo)的CF和心功能損傷的作用。在CF時CREG1雖然改善了心功能，但其是否能夠調(diào)控心肌細(xì)胞凋亡及其機(jī)制并不清楚，因此仍需進(jìn)一步深入研究。

目前已有研究提示CREG1蛋白可在溶酶體上表達(dá)，可能在溶酶體的發(fā)生和成熟中起重要作用[5-6]。作為較新認(rèn)識的細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)細(xì)胞器之一，溶酶體在抑制細(xì)胞凋亡、對抗細(xì)胞損傷中的作用機(jī)制仍有待更深入的研究。作為一種在成熟組織細(xì)胞中廣泛表達(dá)的內(nèi)穩(wěn)態(tài)調(diào)控蛋白，CREG1蛋白在對抗心肌損傷和心功能異常中的作用為心血管疾病防治研究提供了一個新的治療點(diǎn)和思路。

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Effect of cellular repressor of E1A stimulated genes (CREG1) on cardiac function injury induced by angiotensin Ⅱ in mice

SONG Hai-xu1, LI Yang2, SUN Ming-yu2, PENG Cheng-fei2, TIAN Xiao-xiang2, YAN Cheng-hui2, HAN Ya-ling2*
1Department of Cardiology, Xijing Hospital, Fourth Military Medical University, Xi’an 710032, China
2Department of Cardiology, General Hospital of Shenyang Command, Shenyang 110016, China

*Corresponding author, E-mail: hanyaling@263.net

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China(81130072, 81370243), and the Key Project of “12th Five-Year” Research Program of China (2012ZX09303016-002)

ObjectiveTo investigate the effect of cellular repressor of E1A stimulated genes (CREG1) on cardiac function in mouse with myocardial fibrosis.MethodsCREG1 knockout mice (CREG1+/–) and CREG1 wild-type mice (CREG1+/+) were used to reproduce the model of myocardial fibrosis by subcutaneous pump burying of angiotensin Ⅱ (AngⅡ). After being stimulated with AngⅡ for 14 days, myocardial fibrosis was verified by HE staining and Masson trichrome staining. Western blotting and immunohistochemistry were used to detect the expression of CREG1 in myocardium before stimulation and 3, 7, 14 days after the AngⅡ stimulation. The cardiac function was evaluated by echocardiography after AngⅡ stimulation for 14 days. The CREG+/+mice were given AngⅡ for 14 days, and at the same time recombinant CREG1 protein [respectively 15, 30, 60 and 300μg/(kg.d), intraperitoneal (IP) injections] (treatment group) and NaCl (control group) were administered for treatment, and then cardiac function and myocardiac apoptosis were examined.ResultsWestern blotting and immunohistochemistry showed that the expression of CREG1 in heart tissue was significantly lower in CREG+/–mice than in CREG+/+mice (P<0.05). After AngⅡstimulation for 3, 7 and 14 days, the expression of CREG1 in heart tissue declined significantly in both CREG+/-and CREG+/+mice (P<0.05), especially in CREG+/-mice (P<0.01). With HE and Masson staining, it was also found that CREG1 deficiency aggravatedmyocardial fibrosis and cardiac function deterioration in response to AngⅡ stimulation (P<0.05). Conversely, exogenous infusion of recombinant CREG1 protein significantly inhibited the occurrence of myocardial apoptosis (P<0.05), thus ameliorated cardiac function (P<0.05).ConclusionsCREG1 deficiency may aggravate the deterioration of cardiac function in mouse with myocardial fibrosis induced by AngⅡ stimulation. The deterioration of cardiac function can be improved by administration of exogenous recombinant CREG1 protein.

cellular repressor of E1A stimulated genes; myocardial fibrosis; cardiac function

R542.23

A

0577-7402(2015)01-0016-06

10.11855/j.issn.0577-7402.2015.01.04

2014-09-02；

2014-11-17)

(責(zé)任編輯：張小利)

國家自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目(81130072)，面上項(xiàng)目(81370243)；國家“十二五”重大新藥創(chuàng)制研究項(xiàng)目(2012ZX09303016-002)

宋海旭，醫(yī)學(xué)碩士。主要從事心肌缺血再灌注方面的研究

710032 西安 第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院心內(nèi)科(宋海旭)；110016 沈陽 沈陽軍區(qū)總醫(yī)院心內(nèi)科(李洋、孫鳴宇、彭程飛、田孝祥、閆承慧、韓雅玲)

]韓雅玲，E-mail：hanyaling@263.net