葡萄原生質(zhì)體分離及瞬時(shí)轉(zhuǎn)化體系的建立

舒小娟，溫騰建，邢佳毅，盧 龍，胡建芳

（中國農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，北京100193）

葡萄原生質(zhì)體分離及瞬時(shí)轉(zhuǎn)化體系的建立

舒小娟，溫騰建，邢佳毅，盧 龍，胡建芳＊

（中國農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，北京100193）

為了建立葡萄原生質(zhì)體進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化的技術(shù)，該研究以葡萄品種‘黑香蕉’的葉片和愈傷組織為材料，分析纖維素酶和離析酶的濃度與配比、滲透壓和酶解時(shí)間等主要因素對(duì)葡萄原生質(zhì)體分離的影響，探討建立穩(wěn)定、高效的葡萄原生質(zhì)體分離與瞬時(shí)轉(zhuǎn)化體系，為鑒定目標(biāo)基因的功能奠定基礎(chǔ)。結(jié)果表明：（1）葡萄葉片原生質(zhì)體的分離以3.0%纖維素酶和0.75%離析酶的酶組合，在0.6mol／L甘露醇溶液中，酶解14h為宜，每克游離產(chǎn)量為4.09× 106個(gè)原生質(zhì)體，活力為83.12%。（2）葡萄愈傷組織原生質(zhì)體的分離以2.0%纖維素酶和0.5%離析酶的酶組合，在0.5mol／L甘露醇溶液中，酶解14h為宜，每克游離產(chǎn)量為6.05×106個(gè)原生質(zhì)體，活力為84.13%。（3）利用該方法得到的葡萄原生質(zhì)體為受體，采用40%PEG－4000介導(dǎo)轉(zhuǎn)化質(zhì)粒載體pEZS－NL，目標(biāo)基因瞬時(shí)表達(dá)產(chǎn)物檢測(cè)表明，GFP蛋白表達(dá)穩(wěn)定、清晰。該研究建立的葡萄原生質(zhì)體制備和轉(zhuǎn)化體系，可以用較少量的質(zhì)粒DNA獲得外源基因在原生質(zhì)體內(nèi)的表達(dá)，為葡萄功能基因的研究提供技術(shù)支持。

葡萄；原生質(zhì)體；葉片；愈傷組織；遺傳轉(zhuǎn)化；瞬時(shí)表達(dá)

植物原生質(zhì)體是能夠通過質(zhì)壁分離與細(xì)胞壁分開的具有生理活性和全能性的細(xì)胞系統(tǒng)。其瞬時(shí)表達(dá)實(shí)驗(yàn)可實(shí)現(xiàn)子基因在植物中的快速和高通量表達(dá)分析［1－2］，因而被廣泛用于基因功能驗(yàn)證。擬南芥（Arabidopsis thaliana）［3］、玉米（Zea mays L.）葉片［4］、煙草（Nicotiana tobacumL.）愈傷組織［5］，煙草表皮細(xì)胞［6］，洋蔥（Allium cepaL.）表皮細(xì)胞［7］等原生質(zhì)體被廣泛用于基因瞬時(shí)表達(dá)、蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位、蛋白質(zhì)互作和蛋白質(zhì)活性等研究。并已初步建立多種基因瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)，如PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)染［8］，基因槍轟擊［9］和農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化［10］。但是，現(xiàn)階段原生質(zhì)體的遺傳轉(zhuǎn)化研究主要集中在模式植物，在果樹上的相關(guān)研究較少。

葡萄在中國栽培歷史悠久，營養(yǎng)豐富，是果蔬栽培中經(jīng)濟(jì)效益最高的品種之一。但是葡萄生長周期長、遺傳背景較為復(fù)雜、基因數(shù)量多且多為雜合狀態(tài)［11］，所以通過傳統(tǒng)育種方法和轉(zhuǎn)基因方法進(jìn)行品種改良均有一定困難，品種改良工作受到一定制約，葡萄分子機(jī)制研究也由于轉(zhuǎn)基因困難這一技術(shù)壁壘而寸步難行。而原生質(zhì)體分離和遺傳轉(zhuǎn)化則為克服這一障礙開辟了一條可能的新途徑［12］。作為單細(xì)胞系統(tǒng)，原生質(zhì)體是研究植物細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)、生理生化過程和遺傳學(xué)的良好的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停彩沁z傳轉(zhuǎn)化的理想受體。目前，葡萄原生質(zhì)體研究進(jìn)展緩慢，大多處在分離階段［13－16］，如呂長平等［13］利用刺葡萄葉片、根尖和愈傷組織分離獲得原生質(zhì)體。俞超等［14］也利用‘鄞紅’葡萄莖段愈傷組織進(jìn)行原生質(zhì)體的分離。Natacha等［15］從葡萄果肉中分離得到了完整而脆弱的原生質(zhì)體。袁彬等［16］以毛葡萄愈傷組織、懸浮培養(yǎng)細(xì)胞、無菌苗幼葉為材料，研究了毛葡萄原生質(zhì)體的分離純化方法及影響因素。但是有關(guān)原生質(zhì)體再生和目標(biāo)基因瞬時(shí)表達(dá)體系的研究相對(duì)較少，這可能與葡萄遺傳背景不清，遺傳轉(zhuǎn)化的假陽性較高有關(guān)［17］。因此開展葡萄原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化體系的研究迫在眉睫。為此，本研究針對(duì)酶的濃度與配比、滲透壓、酶解時(shí)間等對(duì)葡萄原生質(zhì)體分離影響較大的因素進(jìn)行了試驗(yàn)研究，旨在獲得高效和高質(zhì)量的原生質(zhì)體，并進(jìn)行了遺傳轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，為葡萄相關(guān)分子機(jī)制的研究、體細(xì)胞融合育種、植株再生以及品種改良奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材 料

本試驗(yàn)選用葡萄品種‘黑香蕉’（Vitis vinifera L.cv.‘Heixiangjiao’）的無菌苗葉片和無菌苗葉片誘導(dǎo)的胚性愈傷組織為材料，進(jìn)行原生質(zhì)體的分離。從溫泉苗圃采集葡萄新梢，進(jìn)行初代培養(yǎng)和繼代培養(yǎng)。選較幼嫩的葉片作為分離原生質(zhì)體的酶解材料；剪取組培苗葉片，切成5mm×5mm的方形，接種到愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，選取質(zhì)密、淡黃色狀的胚性愈傷組織作為分離原生質(zhì)體的酶解材料。

1.2 方 法

1.2.1 原生質(zhì)體的分離和純化 從田間取葡萄一年生枝條，經(jīng)過外植體消毒，放入初代培養(yǎng)基（MS＋1.0mg／L 6－BA＋0.5mg／L NAA）誘導(dǎo)生芽，隨后進(jìn)行生根培養(yǎng)（1／2MS＋0.2mg／L IBA＋1mg／L KT＋1g／L活性炭），獲得無菌苗。剪取30～40d葉齡的組培苗葉片，切成5mm×5mm的方形，接種到愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基（MS＋2.0mg／L TDZ＋1.0mg／L 2，4－D＋0.2mg／L IBA）上進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為（25±2）℃，光周期為16h／8h，光照強(qiáng)度2 000lx，進(jìn)行20d的暗培養(yǎng)后轉(zhuǎn)入光下培養(yǎng)，經(jīng)繼代后獲得結(jié)構(gòu)致密、淡黃色的胚性愈傷組織。

選取1g左右葉齡20～30d的幼嫩葉片作為分離原生質(zhì)體的酶解材料，切成1～2mm寬的細(xì)絲；另選取1g左右愈傷組織作為分離材料，切碎。分別置于盛有10mL cellulose onozuka R－10（纖維素酶，Yakult）和macerozyme R－10（離析酶，Yakult）混合酶液的培養(yǎng)皿中，靜置在28℃黑暗的環(huán)境酶解。酶解后的材料用200目孔徑的尼龍網(wǎng)篩過濾，除去沒有酶解完全的組織和雜質(zhì)（本試驗(yàn)采用離心法去雜質(zhì)，濾液在（600～800）r／min轉(zhuǎn)速下離心10 min，去掉上清收集原生質(zhì)體）。用含有甘露醇的原生質(zhì)體清洗液（CPW液：Cell Protoplast Wash Medium，27.2mg／L KH2PO4、101.0mg／L KNO3、1 480.0mg／L CaCl2·2H2O、246.0mg／L MgSO4· 7H2O、0.16mg／L KI、0.025mg／L CuSO4· 5H2O）進(jìn)行重懸清洗，再離心洗去雜質(zhì)，重復(fù)操作2次。最后用原生質(zhì)體培養(yǎng)液W5培養(yǎng)基（4mmol／L MES、154mmol／L NaCl、125mmol／L CaCl2、5mmol／L KCl，pH 5.8）洗滌2次，獲取純化原生質(zhì)體［18］。

試驗(yàn)所用的酶解液的處理設(shè)置見表1。首先在滲透壓穩(wěn)定劑甘露醇濃度為0.6mol／L和酶解時(shí)間為14h條件下，對(duì)酶解液組合進(jìn)行篩選，測(cè)定原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力，確定最佳的酶解液組合。然后，根據(jù)確定的最佳酶解液組合，在酶解時(shí)間14h條件下，滲透壓穩(wěn)定劑甘露醇的濃度設(shè)置4個(gè)處理（0.4、0.5、0.6和0.7mol／L），測(cè)定原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力，確定最佳的滲透壓穩(wěn)定劑濃度。最后，根據(jù)篩選得到的最佳酶解液組合和最佳滲透壓穩(wěn)定劑甘露醇的濃度，酶解時(shí)間設(shè)置4個(gè)處理（12、14、16和18h），測(cè)定原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力，從中確定最佳酶解時(shí)間。各實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.2 原生質(zhì)體產(chǎn)量與活力的測(cè)定 利用血球計(jì)數(shù)板測(cè)定原生質(zhì)體產(chǎn)量：將純化后的原生質(zhì)體重懸至一定體積，吸取少量滴入血球計(jì)數(shù)板中，在顯微鏡下觀察形態(tài)并計(jì)數(shù)，重復(fù)3次。同時(shí)利用伊文思藍(lán)染色法測(cè)定原生質(zhì)體活力（Direct Blue 53）：吸取1滴原生質(zhì)體懸浮液置于載玻片上，用0.25%伊文思藍(lán)進(jìn)行染色，靜置5min，在顯微鏡下觀察，檢測(cè)原生質(zhì)體活性［19］。隨機(jī)選取3個(gè)視野統(tǒng)計(jì)有活力原生質(zhì)體的百分比。按如下公式計(jì)算［20］：

每克材料中原生質(zhì)體總產(chǎn)量＝25個(gè)大方格中原生質(zhì)體總數(shù)×104×懸浮液總體積÷材料質(zhì)量

表1 酶解液組合Table 1 Composition of enzyme solution for protoplast isolation

原生質(zhì)體活力＝（視野內(nèi)未被染色的原生質(zhì)體數(shù)÷視野內(nèi)原生質(zhì)體總數(shù)）×100%

每克材料中有活力的原生質(zhì)體產(chǎn)量＝原生質(zhì)體總產(chǎn)量×原生質(zhì)體活力

由于原生質(zhì)體分離一般是為了下一步進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化或者原生質(zhì)體融合，需要的都是具有活力的原生質(zhì)體，所以，本試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)具有活力的原生質(zhì)體數(shù)，并以此作為評(píng)價(jià)指標(biāo)。

1.2.3 原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化試驗(yàn) pEZS－NL質(zhì)粒載體是含有綠色熒光蛋白基因（GFP）的植物表達(dá)載體（http：／／deepgreen.stanford.edu），表達(dá)框由花椰菜花葉病毒（CaMV）35S啟動(dòng)子、綠色熒光蛋白（GFP）基因構(gòu)成，可以在真核細(xì)胞中高水平表達(dá)綠色熒光蛋白GFP。用中科瑞泰（北京）普通質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

將收集的葡萄葉片和愈傷組織原生質(zhì)體重分別懸浮于MMG溶液中（0.5mol／L甘露醇、15mmol／L MgCl2、4mmol／L MES，pH 5.8），濃度稀釋至每毫升溶液內(nèi)含2.0×105個(gè)。取15～20μg質(zhì)粒DNA加入2mL離心管，與200μL原生質(zhì)體MMG懸濁液混合，輕彈管底以混勻，室溫放置8～10 min。加入220μL 40%PEG－Ca2＋（40%PEG－4000、0.2mol／L甘露醇、100mmol／L CaCl2），輕彈管底以混勻，室溫放置15min。隨后加入880μL W5溶液（154mmol／L NaCl、125mmol／L CaCl2、5 mmol／L KCl、4mmol／L MES，pH 5.8）重新懸浮，輕彈管底以混勻，終止轉(zhuǎn)化。然后，100g離心2 min，棄上清液，收集轉(zhuǎn)化后的原生質(zhì)體。加入WI（0.5mol／L甘露醇、4mmol／L MES、20mmol／L KCl，pH 5.8）1mL重懸浮，并轉(zhuǎn)移至經(jīng)BSA預(yù)沖洗過的培養(yǎng)皿中，室溫、暗培養(yǎng)過夜，用熒光顯微鏡（NIKON，Eclipse 90I，Japan）觀察記錄轉(zhuǎn)化效果和轉(zhuǎn)化率。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 應(yīng)用Excel軟件進(jìn)行單因素方差分析；用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)結(jié)果多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶解液組合對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力的影響

葉片中分離原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力的酶解濃度處理結(jié)果（圖1）顯示，處理11（3.0%纖維素酶＋0.75%離析酶）的每克葉片中分離的原生質(zhì)體產(chǎn)量3.09×106個(gè)，具有活力的原生質(zhì)體產(chǎn)量2.45×106個(gè)，活力可達(dá)79.29%，是所有葉片酶解處理中最高的，與其他處理的具有活力的原生質(zhì)體產(chǎn)量多呈顯著性差異（P＜0.05，下同）。

愈傷組織分離原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力的酶解組合結(jié)果（圖2）顯示，處理6（2.0%纖維素酶＋0.50%離析酶）的每克愈傷組織中分離的原生質(zhì)體產(chǎn)量5.86 ×106個(gè)，具有活力的原生質(zhì)體產(chǎn)量4.73×106個(gè)，活力80.71%，是愈傷組織的所有酶解處理中最高的，與其他處理的具有活力的原生質(zhì)體產(chǎn)量多呈顯著性差異（圖2）。

根據(jù)以上不同酶解液處理效果，最終得出適宜‘黑香蕉’葡萄葉片原生質(zhì)體分離的酶組合是3.0%纖維素酶＋0.75%離析酶；適宜愈傷組織原生質(zhì)體分離的酶組合是2.0%纖維素酶＋0.50%離析酶。

2.2 不同滲透壓對(duì)葡萄葉片和愈傷組織分離的原生質(zhì)體產(chǎn)量及活力的影響

采用上述所得到的最佳酶解液組合（即酶液組合11處理葡萄葉片和用酶液組合6處理葡萄愈傷組織），酶解14h，分析不同濃度甘露醇（0.4、0.5、0.6、0.7mol／L）對(duì)葉片和愈傷組織中分離的原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力的影響。結(jié)果（圖3）顯示，原生質(zhì)體只有在滲透壓最適宜的時(shí)候，產(chǎn)量和活力才較高，否則無論滲透壓高低，產(chǎn)量和活力都會(huì)下降。其中，當(dāng)甘露醇濃度為0.6mol／L時(shí)，每克葉片原生質(zhì)體產(chǎn)量達(dá)到最高（3.09×106個(gè)），具有活力的原生質(zhì)體產(chǎn)量2.45×106個(gè)，活力79.29%，與其他處理具有活力的原生質(zhì)體產(chǎn)量多有顯著差異（圖3，A）；當(dāng)甘露醇濃度為0.5mol／L時(shí)，每克愈傷組織產(chǎn)量和活力達(dá)到最佳，產(chǎn)量為5.94×106個(gè)，具有活力的原生質(zhì)體產(chǎn)量4.82×106個(gè)，活力81.14%，與其他處理具有活力的原生質(zhì)體產(chǎn)量有顯著差異（圖3，B）。

圖1 不同酶組合對(duì)‘黑香蕉’葡萄葉片原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力的影響不同小寫字母表示各處理間0.05水平差異顯著性；下同F(xiàn)ig.1 Effects of enzyme composition on yield and viability of‘Heixiangjiao’leaf protoplast Bars with different letters are significantly different at the 0.05level under different treatments；The same as below

圖2 不同酶組合對(duì)‘黑香蕉’葡萄愈傷組織原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力的影響Fig.2 Effects of enzyme composition on yield and viability of‘Heixiangjiao’callus protoplast

2.3 不同酶解時(shí)間對(duì)葡萄葉片和愈傷組織原生質(zhì)體產(chǎn)量及活力的影響

采用上述所得到的最佳酶解液組合和最佳甘露醇濃度，進(jìn)行連續(xù)取樣觀察，分析不同酶解時(shí)間對(duì)葡萄葉片和愈傷組織中原生質(zhì)體分離效果的影響。結(jié)果（圖4）顯示，葉片和愈傷組織的最佳酶解時(shí)間均為14h。此時(shí)每克葉片原生質(zhì)體產(chǎn)量4.09×106個(gè)，具有活力的原生質(zhì)體產(chǎn)量3.40×106個(gè)，活力83.12%，是葉片所有處理中最高的，與其他處理具有活力的原生質(zhì)體產(chǎn)量均有顯著差異（圖4，A）；每克愈傷組織原生質(zhì)體產(chǎn)量6.05×106個(gè)，具有活力的原生質(zhì)體產(chǎn)量5.09×106個(gè)，活力84.13%，是愈傷組織所有處理中最高的，與其他處理均有顯著差異（圖4，B）。原生質(zhì)體在酶解時(shí)間最適宜的時(shí)候其產(chǎn)量和活力才能達(dá)到最高。隨著酶解時(shí)間的增長，原生質(zhì)體活力和產(chǎn)量先增后降，因此，有效的原生質(zhì)體產(chǎn)量會(huì)在一定時(shí)間段內(nèi)達(dá)到最高；若酶解時(shí)間過短，原生質(zhì)體之間會(huì)出現(xiàn)較多的粘連片段和較大細(xì)胞團(tuán)，而若酶解時(shí)間過長，原生質(zhì)體的活力會(huì)大大降低。因此，為確保得到活力較高的原生質(zhì)體，葡萄葉片和愈傷組織的酶解時(shí)間盡量控制在14h左右。2.4 葡萄葉片和愈傷組織原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化

由于葉肉細(xì)胞中含有葉綠體，其自發(fā)熒光會(huì)干擾GFP的觀測(cè)效果，所以日常實(shí)驗(yàn)中常用愈傷組織或黃化子葉進(jìn)行原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。由于葡萄愈傷組織無論是原生質(zhì)體產(chǎn)量還是活力都大于葉片，并且沒有葉綠體的自發(fā)熒光信號(hào)干擾，因此利用葡萄愈傷組織分離的原生質(zhì)體是一種理想材料。而本試驗(yàn)利用葡萄葉片和愈傷組織分離的原生質(zhì)體進(jìn)行了遺傳轉(zhuǎn)化體系的比較和研究。

將制備好的葡萄葉片和愈傷組織的原生質(zhì)體用pEZS－NL載體轉(zhuǎn)化，在24℃條件下黑暗培養(yǎng)12～16h，用熒光顯微鏡觀察。結(jié)果（圖5）顯示：未進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的葉片原生質(zhì)體只有紅色的葉綠體自發(fā)熒光（圖5，A）。利用葉片原生質(zhì)體進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)化后，由于自身具有葉綠體應(yīng)發(fā)紅光，但與綠色熒光信號(hào)（GFP）疊加后則呈現(xiàn)黃色熒光（圖5，B）。利用愈傷組織分離的原生質(zhì)體進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)化后，由于體內(nèi)沒有葉綠體自發(fā)熒光，因此清晰地觀察到有穩(wěn)定表達(dá)的綠色熒光信號(hào)，與明場疊加發(fā)現(xiàn)綠色熒光信號(hào)與原生質(zhì)體位置吻合（圖5，C）。說明帶有GFP的質(zhì)粒DNA可高通量進(jìn)入葡萄葉片和愈傷組織原生質(zhì)體中并穩(wěn)定表達(dá)。

圖3 不同濃度甘露醇對(duì)‘黑香蕉’葡萄原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力的影響A.葉片；B.愈傷組織；圖4同F(xiàn)ig.3 Effects of mannitol concentration in enzyme solution on yield and viability of‘Heixiangjiao’protoplast A.Leaf；B.Callus；The same as Fig.4

圖4 不同酶解時(shí)間對(duì)‘黑香蕉’葡萄原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力的影響Fig.4 Effects of hours of duration dissolve on yield and viability on‘Heixiangjiao’protoplast

3 討 論

在其他物種原生質(zhì)體的分離過程中，研究人員用纖維素酶、離析酶、果膠酶、半纖維素酶、崩潰酶等多種酶類做過酶解效率的探索，其中纖維素酶、離析酶的使用較為廣泛［8］。孫鶴等［21］用纖維素酶和離析酶從玉米、小麥、水稻中游離出較高質(zhì)量的原生質(zhì)體；廖嘉明等［22］在擬南芥中使用這2種酶，每克葉肉組織中游離出原生質(zhì)體2.91×106個(gè)，活力為84.03%。景艷春等［23］在每克新疆楊葉肉中游離出原生質(zhì)體達(dá)1.57×106個(gè)，活力為79.41%。李玉珠等［24］以4個(gè)適宜西北內(nèi)陸黃土高原地區(qū)栽培的苜蓿愈傷組織為材料，探索了各影響因素對(duì)原生質(zhì)體分離和培養(yǎng)的影響，每克組織游離出的原生質(zhì)體1×106～2×106個(gè)，活力最高可達(dá)80%～90%。在本研究中發(fā)現(xiàn)，用濃度為2%纖維素酶和0.5%離析酶消化葡萄愈傷組織；用濃度為3%纖維素酶和0.75%離析酶消化葡萄葉片已經(jīng)可以分離出足夠量的原生質(zhì)體，效率較高。

此外，其他研究人員在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，酶解時(shí)間、溶液滲透壓、分離的離心速度和離心時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體分離的產(chǎn)量和活力也有較大影響［2］，但是不同物種間最佳酶解時(shí)間和溶液滲透壓差別較大，最適的離心速度和離心時(shí)間幾乎沒有差別。常用的滲透壓穩(wěn)定劑主要有甘露醇、蔗糖、山梨醇等，其中甘露醇在原生質(zhì)體分離中的應(yīng)用最為廣泛［4，8，15］，本研究使用的滲透壓穩(wěn)定劑就是甘露醇。發(fā)現(xiàn)葡萄葉片原生質(zhì)體分離的最適酶解時(shí)間為14h，最適甘露醇濃度為0.6mol·L－1，與袁彬等［16］取得的結(jié)果相似。同時(shí)發(fā)現(xiàn)愈傷組織原生質(zhì)體的滲透壓小于葉片原生質(zhì)體，可以推斷在葡萄中葉片胞質(zhì)較濃，愈傷組織胞內(nèi)的滲透壓小于葉片。

圖5 pEZS－NL－GFP載體轉(zhuǎn)化葡萄原生質(zhì)體A.未經(jīng)轉(zhuǎn)化的葉片原生質(zhì)體；B.轉(zhuǎn)入pEZS－NL－GFP的葉片原生質(zhì)體；C.轉(zhuǎn)入pEZS－NL－GFP的愈傷組織原生質(zhì)體Fig.5 ‘Heixiangjiao’protoplast transformed by using pEZS－NL－GFP vector A.Leaf protoplast without transformation；B.Leaf protoplast with pEZS－NL－GFP；C.Callus protoplast with pEZS－NL－GFP

對(duì)不同物種的研究表明，植物不同組織最佳體系分離得到的原生質(zhì)體產(chǎn)量一般為7×105～2×107個(gè)，活力一般為70%～90%。本研究中，應(yīng)用最佳體系，每克葉片游離得到的原生質(zhì)體產(chǎn)量為4.09× 106個(gè)，活力為83.12%；每克愈傷組織原生質(zhì)體產(chǎn)量為6.05×106個(gè)，活力為84.13%。使用愈傷組織來制備原生質(zhì)體無論是產(chǎn)量還是活力都要優(yōu)于使用葉片，所以如果不是探究葉綠體相關(guān)的生理生化和分子特性，推薦使用葡萄愈傷組織進(jìn)行原生質(zhì)體的分離。

目前雖然已經(jīng)有關(guān)于葡萄的原生質(zhì)體分離體系的報(bào)道，但是關(guān)于葡萄原生質(zhì)體遺傳轉(zhuǎn)化的試驗(yàn)還鮮有報(bào)道。采用GFP（綠色熒光蛋白）、CFP（青色熒光蛋白）、YFP（黃色熒光蛋白）等熒光標(biāo)記、通過熒光顯微鏡或者激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)，可以簡單方便地確定目標(biāo)蛋白在細(xì)胞中的定位。通過本試驗(yàn)可觀察到，葡萄原生質(zhì)體中的葉綠體會(huì)產(chǎn)生自發(fā)熒光，影響綠色熒光蛋白的觀測(cè)，而暗培養(yǎng)的愈傷組織沒有成熟的葉綠體，所以愈傷組織分離的原生質(zhì)體可以作為瞬時(shí)轉(zhuǎn)化的理想材料。本研究利用葡萄葉片和愈傷組織原生質(zhì)體原生質(zhì)體，采用PEG介導(dǎo)法順利將pEZS－NL－GFP載體導(dǎo)入原生質(zhì)體并成功表達(dá)，為相關(guān)分子機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。此外，分離出高質(zhì)量的葉片原生質(zhì)體，也可為分子育種和雜交育種提供材料依據(jù)。

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（編輯：宋亞珍）

Isolation of Protoplast and Establishment of Transient Expression System in Grapevine（Vitis vinifera L.）

SHU Xiaojuan，WEN Tengjian，XING Jiayi，LU Long，HU Jianfang＊
（College of Agriculture and Biotechnology，China Agricultural University，Beijing 100193，China）

In order to establish an efficient transient expression system based on grapevine protoplasts，we used the mesophyll and callus of grape‘Heixiangjiao’to analyze the key factors related to isolating effectively protoplasts，such as cellulose and macerozyme enzyme composition，concentration of mannitol in enzyme solution，duration of enzyme dissolve，and so on.The protoplast was used as a vehicle to explore the establishment of a stable，efficient grape protoplast isolation and transient transformation system，and lay the foundation for building a transient expression system.The results showed that：（1）the optimal enzyme solution for leaf protoplast isolation was 3.0%cellulase onozuka R－10＋0.75%macerozyme R－10＋0.6 mol／L mannitol.The digestion was conducted in the dark under 28℃for 14h，and the protoplasts yield was 4.09×106per gram，the vitality was 83.12%.（2）The optimal enzyme solution for callus protoplast isolation was 2.0%cellulase onozuka R－10＋0.5%macerozyme R－10＋0.5mol／L mannitol.The digestion was conducted in the dark under 28℃for 14h，and the protoplasts yield was 6.05×106per gram，the vitality was 84.13%.（3）The transient expression vector pEZS－NL with reported gene coding green fluorescent protein（GFP）was transferred into protoplasts by 40%PEG－4000method.The GFP protein expressed stably and clearly in all over the protoplast.We establish grape protoplast isolation and transformation sys－tem in this paper.The gene can be expressed efficiently in grape protoplasts with a small amount of plasmid DNA，which provides technical support for grape functional genomics studies.

grapevine；protoplast；leaf；callus；genetic transformation；transient expression

Q781

A

10.7606／j.issn.1000－4025.2015.06.1262

1000－4025（2015）06－1262－07

2015－02－04；修改稿收到日期：2015－04－13

國家自然科學(xué)基金（31471842）

舒小娟（1990－），女，在讀碩士研究生，主要從事果樹栽培與分子生物學(xué)研究。E－mail：1175609284＠qq.com

＊通信作者：胡建芳，教授，主要從事果樹生理與分子生物學(xué)研究。E－mail：hujf＠cau.edu.cn