葉子花脫落酸生物合成關(guān)鍵酶基因NCED的克隆及調(diào)節(jié)開(kāi)花功能初探

田亞然，薛璟祺，趙家昱，彭 堅(jiān)，谷 茂，李永紅＊

（1深圳職業(yè)技術(shù)學(xué)院應(yīng)用化學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，廣東深圳518055；2中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，北京100081；3河北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，河北保定071001；4四川農(nóng)業(yè)大學(xué)風(fēng)景園林學(xué)院，成都611130）

葉子花脫落酸生物合成關(guān)鍵酶基因NCED的克隆及調(diào)節(jié)開(kāi)花功能初探

田亞然1，3，薛璟祺2，趙家昱1，4，彭 堅(jiān)1，谷 茂1，李永紅1＊

（1深圳職業(yè)技術(shù)學(xué)院應(yīng)用化學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，廣東深圳518055；2中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，北京100081；3河北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，河北保定071001；4四川農(nóng)業(yè)大學(xué)風(fēng)景園林學(xué)院，成都611130）

以葉子花品種‘大紅寶巾’（Bougainvillea glabra‘Mrs Butt’）的2年生扦插苗為試驗(yàn)材料，克隆到了一個(gè)9－順式－環(huán)氧類(lèi)胡蘿卜素雙氧合酶（NCED）同源基因，并分析了內(nèi)源脫落酸（ABA）含量及NCED活性等變化與該基因表達(dá)之間的內(nèi)在聯(lián)系，探討ABA對(duì)促進(jìn)葉子花開(kāi)花的作用機(jī)理。結(jié)果表明：（1）外源50mg·L－1ABA處理促進(jìn)了葉子花開(kāi)花，而與10μmol·L－1的去甲二氫愈創(chuàng)木酸（NDGA，ABA合成抑制劑）共處理可抑制這種效果。（2）外源ABA處理可誘導(dǎo)葉子花葉片中內(nèi)源ABA含量和NCED含量與活性上升，這種誘導(dǎo)可被NDGA抑制。（3）克隆得到的NCED基因全長(zhǎng)為2 380bp，其推定的編碼蛋白包含618個(gè)氨基酸殘基，與草莓中的FvNCED1同源性最高，命名為BgNCED1。（4）Real－time PCR結(jié)果顯示，外源ABA處理顯著誘導(dǎo)BgNCED1基因的表達(dá)，而10μmol·L－1的NDGA可顯著抑制BgNCED1基因的誘導(dǎo)效果，這種表達(dá)模式與內(nèi)源ABA含量及NCED活性等的變化趨勢(shì)較為一致。研究認(rèn)為，外源ABA可能通過(guò)誘導(dǎo)BgNCED1的表達(dá)，增強(qiáng)內(nèi)源ABA的生物合成，進(jìn)而促進(jìn)葉子花從營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)到生殖生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)變，使其提前開(kāi)花。

脫落酸；葉子花；花朵開(kāi)放；9－順式－環(huán)氧類(lèi)胡蘿卜素雙氧合酶（NCED）；基因表達(dá)

脫落酸（abisicsic acid，ABA）作為一種重要的植物激素，不僅作為干旱誘導(dǎo)的信號(hào)分子在抵御環(huán)境脅迫中起重要作用，而且還廣泛參與了植物的成花誘導(dǎo)、花芽分化及開(kāi)花調(diào)控等過(guò)程［1］，目前在牽牛［2］、夜來(lái)香［3］等植物中已有相關(guān)報(bào)道。已有研究表明，外源ABA處理可顯著誘導(dǎo)荔枝葉片中ABA的生成，同時(shí)提高了荔枝的成花率［4］。在高等植物ABA生物合成過(guò)程中，9－順式－環(huán)氧類(lèi)胡蘿卜素雙氧合酶（Nine－cis－epoxy carotenoid dioxygenase，NCED）是主要的限速酶之一，而編碼該酶的NCED基因多以基因家族的形式存在。很多研究證實(shí)，植物中NCED基因表達(dá)量的變化與ABA含量有直接關(guān)系。在擬南芥中，已經(jīng)克隆到9個(gè)NCED基因，其中AtNCED3的高表達(dá)可顯著提高其內(nèi)源ABA的水平［5］。

葉子花（Bougainvillea glabra）屬紫茉莉科（Nyctaginaceae）葉子花屬常綠攀援灌木，俗稱(chēng)三角梅、三葉梅等。葉子花原產(chǎn)巴西，作為亞熱帶地區(qū)常見(jiàn)的庭院觀賞植物，在中國(guó)南方如廣東、云南等地區(qū)廣泛種植。在栽培過(guò)程中，由于水分過(guò)多等原因，極易造成花朵不能正常開(kāi)放或花期不集中現(xiàn)象。目前，葉子花相關(guān)的研究主要集中在生物學(xué)特性［6］和生理生化［7］等方面。花期調(diào)控也主要集中在環(huán)境調(diào)控和植株修剪等方面［8－9］，相關(guān)機(jī)理研究較少。作者前期研究已表明，外源ABA對(duì)葉子花的成花具有促進(jìn)作用，并對(duì)其相關(guān)酶活性等進(jìn)行了系統(tǒng)分析［10］，但仍缺少分子調(diào)控機(jī)理方面的直接證據(jù)。ABA生物合成及其調(diào)控是一個(gè)相對(duì)復(fù)雜的過(guò)程，是多種因素共同作用的結(jié)果。NCED作為其合成途徑中的一個(gè)限制酶基因，是研究ABA生物合成分子調(diào)控的重要切入點(diǎn)。本研究從葉子花中首次克隆到了一個(gè)NCED同源基因，并分析了內(nèi)源ABA含量及NCED活性等變化與該基因表達(dá)之間的內(nèi)在聯(lián)系，推測(cè)其在調(diào)控葉子花開(kāi)花過(guò)程中的作用，這些結(jié)果可為進(jìn)一步研究葉子花ABA的分子調(diào)控機(jī)理提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料及處理

試驗(yàn)于2012年10月至2014年4月在深圳職業(yè)技術(shù)學(xué)院園林實(shí)訓(xùn)基地進(jìn)行。供試材料來(lái)自深圳市蓮花山公園盆栽葉子花品種‘大紅寶巾’（B.glabra‘Mrs Butt’），全部為生長(zhǎng)健壯，長(zhǎng)勢(shì)一致的兩年生扦插苗。不同植株隨機(jī)分為4組，分別利用4種處理溶液對(duì)葉面進(jìn)行正反面噴施，每處理5盆，3次重復(fù)。4種處理液分別為：（1）清水（0＋0）；（2）50 mg·L－1ABA（50＋0）；（3）50mg·L－1ABA＋5 μmol·L－1NDGA（50＋5）；（4）50mg·L－1ABA＋10μmol·L－1NDGA（50＋10）。其中，去甲二氫愈創(chuàng)木酸（Nordihydroguaiaretic acid，NDGA）是ABA的合成抑制劑，其主要功能是阻斷脅迫誘導(dǎo)的ABA積累，可以抑制包括NCED在內(nèi)的ABA合成關(guān)鍵酶活性。ABA和NDGA的使用濃度根據(jù)先前結(jié)果確定［10］，50mg·L－1ABA能使葉子花提前開(kāi)花，且這種提前能被濃度為10μmol·L－1的NDGA所抑制，而5μmol·L－1的NDGA能達(dá)到部分抑制的效果。

噴施時(shí)以葉面滴水為限，每5d處理1次，共噴施3次，溫室養(yǎng)護(hù)。首次噴施為2013年7月10日，10d后3次噴施完成，開(kāi)始取樣，每周取樣1次，共計(jì)4次。取樣部位為植株嫩葉，取樣后立即測(cè)定相關(guān)指標(biāo)或經(jīng)液氮速凍后存放于－80℃冰箱備用。

1.2 測(cè)定指標(biāo)與方法

1.2.1 內(nèi)源ABA含量 取每株植物頂芽往下第4～6葉位無(wú)病害功能葉，準(zhǔn)確稱(chēng)量1g后迅速用液氮固定并貯存于－80℃冰箱中備用。將1g樣品于液氮中研磨成粉，轉(zhuǎn)入10倍量80%冰甲醇中，于4℃下不斷攪拌，避光提取12h，再于4℃、5 000 r／min離心15min，取上清，殘?jiān)?mL 80%冰甲醇，提取4h，離心，取上清。合并上清液，以Waters Sep－Pak C18小柱富集ABA，洗脫液經(jīng)N2吹干，用1 mL色譜甲醇溶解，過(guò)0.45有機(jī)系微孔濾膜，用Agilent1100HPLC測(cè)ABA含量。進(jìn)樣量20μL，Agilent Eclipse Plus C18色譜柱，流動(dòng)相為甲醇－水－甲酸（體積比為45∶54.2∶0.8），流速1.0 mL／min，檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm。

1.2.2 NCED含量及活性 取1g葉片鮮樣，加9 mL PBS（pH 7.4）充分勻漿，于4℃、3 000r／min離心25min，取上清。采用酶聯(lián)免疫法進(jìn)行NCED含量與活性的同步檢測(cè)，重復(fù)3次。

1.2.3 總RNA的提取及cDNA第一鏈的合成 用Trizol（Invitrogen公司）試劑提取嫩葉總RNA。用瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA的完整性。以提取的總RNA為模板，用M－MLV反轉(zhuǎn)錄酶（TaKaRa公司）合成第1鏈；反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)參照Ferrnentas RevertAidTMFirst strand cDNA synthesis Kit使用說(shuō)明。1.2.4 BgNCED1基因全長(zhǎng)克隆 基因保守片段的克?。焊鶕?jù)NCBI已報(bào)道的擬南芥等植物NCED基因序列用生物信息學(xué)軟件Primer Premier 5.0對(duì)比分析，以保守域?yàn)槟０逶O(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，序列分別為：NCEDF1：5′－ATGATGCAYGAYTTYGCMATCACVGA－3′，NCEDR：5′－GGCCAYGGSTCDGCMABYGCYARGTA－3′；以反轉(zhuǎn)的cDNA第1鏈為模板進(jìn)行目的基因保守片段的克隆。反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃5min；94℃30s，45℃30s，72℃30s，5個(gè)循環(huán)；94℃30s，51℃30s，72℃30s，30個(gè)循環(huán)；72℃10min。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR qRT－PCR儀為ABI PRISM?7500Sequence Detection System，RNA提取試劑盒為Hipure Plant RNA Kits，PCR引物：up：5′－AAGTCTACACGTCGGGCAAT－3′；down：5′－TCTGCTCTCCATAGATGTGCTT－3′。內(nèi)參為18SrRNA，片段大小190bp；引物為：up：5′－GGGGCATTCGTATTTCATAG TC－3′；down：5′－CGGTATCTGATCGTCTTCGAG－3′。反應(yīng)體系為：cDNA（1∶20）模板5.0μL，上游引物0.5μL，下游引物0.5μL，2×SYBR Green qPCR SuperMix 10μL，dH2O定容至20μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?0℃2min；95℃2min；95℃15s，60℃32s，讀板，40個(gè)循環(huán)，溶解曲線(xiàn)分析溫度為60℃～95℃。所有樣品重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理對(duì)葉子花開(kāi)花的影響

葉子花植株經(jīng)ABA及其合成抑制劑NDGA等處理后均進(jìn)行正常養(yǎng)護(hù)，對(duì)照組，即清水處理（0＋ 0）于8月18日（處理后29d）萼片露紅，9月20日（處理后62d）始花。分別以這兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)為露紅期和始花期的0點(diǎn)，統(tǒng)計(jì)了不同處理對(duì)葉子花露紅期和始花期提前的影響。

由圖1可知，50mg·L－1ABA（50＋0）處理后，葉子花植株露紅期和始花期分別提前了3d（處理后26d）和5d（處理后57d），而50mg·L－1ABA＋5μmol·L－1NDGA（50＋5）處理則分別提前了8d（處理后21d）和9d（處理后53d）；當(dāng)NDGA的濃度進(jìn)一步增大時(shí)，其對(duì)ABA的抑制作用逐漸明顯，當(dāng)以50mg·L－1ABA＋10μmol· L－1NDGA（50＋10）處理時(shí)，始花期僅提前1d（處理后61d），露紅期和對(duì)照相當(dāng)（處理后29d）。這些結(jié)果表明，外源ABA處理能促進(jìn)葉子花花朵開(kāi)放，主要表現(xiàn)在使露紅期和始花期提前；低濃度的NDGA處理能夠增強(qiáng)ABA的促進(jìn)效果，而高濃度的NDGA處理則抑制了ABA的促進(jìn)作用。

2.2 不同處理對(duì)葉子花內(nèi)源ABA含量的影響

圖1 不同濃度ABA和NDGA處理對(duì)葉子花花朵開(kāi)放的影響0＋0代表清水對(duì)照；50＋0代表50mg·L－1ABA處理；50＋5代表50mg·L－1ABA＋5μmol·L－1NDGA處理；50＋10代表50mg·L－1ABA＋10μmol·L－1NDGA處理。下同。小寫(xiě)字母表示不同處理間露紅期的差異顯著性（P＜0.05）；大寫(xiě)字母表示不同處理間始花期的差異顯著性（P＜0.05）Fig.1 The effect of different concentrations of ABA and NDGA treatments on the flowering of B.glabra 0＋0means the water control；50＋0means the treatment with 50mg·L－1ABA；50＋5means the treatment with 50mg·L－1ABA＋5μmol·L－1NDGA；50＋10 means the treatment with 50mg·L－1ABA＋10μmol·L－1NDGA.The same as below.Lowercase means significant difference at 0.05level of color appearing stage among different treatments；Majuscule means significant difference at 0.05level of initial flowering stage among different treatments

葉子花植株經(jīng)ABA及NDGA處理后，其內(nèi)源ABA含量變化受到一定的影響（圖2）。其中，在處理后1d時(shí)，各處理ABA含量均處于較高水平，隨后均有不同程度下降，但在處理后29d時(shí)略有回升；與對(duì)照（0＋0）相比，ABA單獨(dú)處理（50＋0）能夠顯著促進(jìn)內(nèi)源ABA的積累；低濃度NDGA與ABA共同處理（50＋5）時(shí)抑制了這種促進(jìn)作用，其內(nèi)源ABA含量與對(duì)照基本持平；高濃度的NDGA處理（50＋10）對(duì)內(nèi)源ABA的抑制作用更為明顯，尤其是處理初期，其內(nèi)源ABA含量顯著低于對(duì)照。這些結(jié)果表明，葉子花從營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)向生殖生長(zhǎng)轉(zhuǎn)換伴隨著內(nèi)源ABA積累的變化，外源ABA能夠促進(jìn)內(nèi)源ABA的累積，而且一定濃度的NDGA能抑制外源ABA對(duì)內(nèi)源ABA的積累促進(jìn)效果。

2.3 不同處理對(duì)葉子花葉片NCED含量及活性的影響

不同處理對(duì)葉子花葉片NCED含量及活性都有一定的影響。其中，對(duì)照（清水處理）葉子花葉片NCED含量在開(kāi)花前呈先下降再緩慢上升的變化趨勢(shì)，50mg·L－1的ABA處理后葉片中NCED含量在前22d時(shí)均顯著高于對(duì)照，5和10μmol·L－1的NDGA均可抑制外源ABA誘導(dǎo)的NCED含量的升高，且后者效果更為明顯（圖3，A）；葉子花葉片NCED活性表現(xiàn)略有不同，對(duì)照在處理后8d其活性略有下降，隨后恢復(fù)到處理后1d水平，50mg· L－1的ABA處理后顯著提高了NCED活性，而不同濃度的NDGA處理均可抑制由外源ABA誘導(dǎo)的NCED活性升高，且高濃度NDGA表現(xiàn)出的抑制作用更強(qiáng)（圖3，B）。以上結(jié)果表明，外源ABA能誘導(dǎo)葉子花葉片中NCED含量和活性的上升，而NDGA能抑制（或部分抑制）這種上升，在本研究范圍內(nèi)這種抑制和NDGA濃度正相關(guān)。

圖2 不同處理下葉子花葉片內(nèi)源ABA含量的變化不同小寫(xiě)字母表示同期處理間在0.05水平存在顯著性差異；下同F(xiàn)ig.2 The generation of endogenous ABA in leaves of B.glabra under different treatments The different normal letters mean significant difference among different treatments at 0.05level；The same as below

圖3 不同處理下葉子花葉片NCED含量及活性的變化Fig.3 The NCED enzyme content and activity in leaves of B.glabra under different treatments

2.4 葉子花BgNCED1基因全長(zhǎng)克隆與序列分析

為了進(jìn)一步明確NCED對(duì)葉子花開(kāi)花的影響，本研究根據(jù)Genbank中NCED類(lèi)基因并結(jié)合RACE方法，在葉子花花瓣中克隆得到一個(gè)NCED同源基因。

該基因全長(zhǎng)2 380bp，包含一個(gè)1 857bp的ORF區(qū)域、206bp的5′非翻譯區(qū)和317bp的3′非翻譯區(qū)。其推定的編碼蛋白包含618個(gè)氨基酸，分子量為68.2kD，理論等電點(diǎn)為7.43。將該蛋白質(zhì)氨基酸序列提交到Genbank進(jìn)行BLAST比對(duì)，發(fā)現(xiàn)其和野草莓（Fragaria vesca）、蘋(píng)果（Malus domestica）、梅花（Prunus mume）等中的NCED類(lèi)蛋白同源性較高，其中和野草莓中FvNCED1（XP＿004300667.1）同源性最高，達(dá)到了90.9%。因此，將本研究克隆得到的基因命名為BgNCED1。

通過(guò)不同物種序列對(duì)比發(fā)現(xiàn)，BgNCED1編碼蛋白和其他物種在N端差異性較大，在大約100aa以后保守性增大。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，BgNCED1編碼蛋白包含NCED類(lèi)蛋白的典型特征，包括1個(gè)兩親性的α－螺旋區(qū)域、2個(gè)NCED的特征區(qū)域和4個(gè)保守的組氨酸殘基（圖4）。

NCED屬于類(lèi)胡蘿卜素裂解雙加氧酶（carotenoid cleavage dioxygenase，CCD）家族，其重要功能為催化類(lèi)胡蘿卜素氧化裂解，生成脫輔基類(lèi)胡蘿卜素。通過(guò)BgNCED1與擬南芥CCD家族的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析表明，其推定的氨基酸序列與AtNCED3聚為一支，表明BgNCED1與AtNCED3可能具有相似的生理功能和表達(dá)模式（圖5）。

圖4 BgNCED1推定的氨基酸序列與其他植物NCED蛋白序列比對(duì)VvNCED1：葡萄（NP＿001268199）；StNCED1：馬鈴薯（NP＿001275103）；AtNCED3：擬南芥（NP＿188062）。下劃線(xiàn)序列為轉(zhuǎn)運(yùn)肽氨基酸序列；雙下劃線(xiàn)為具有兩親性的α－螺旋區(qū)；方框內(nèi)為發(fā)揮功能所需的4個(gè)保守組氨酸殘基Fig.4 Alignment of the amino acid residues of BgNCED1with NCED proteins from other plants VvNCED1.Vitis vinifera（NP＿001268199）；StNCED1.Solanum tuberosum（NP＿001275103）；AtNCED3.Arabidopsis thaliana（NP＿188062）.A putative chloroplast－targeting transit peptide is underlined；The putative amphipathicα－h(huán)elix domain is double－underlined；Four conserved histidine residues required for activity are marked by the square

2.5 不同處理對(duì)BgNCED1表達(dá)變化的影響

本研究通過(guò)熒光定量PCR檢測(cè)了BgNCED1的表達(dá)變化。結(jié)果表明，葉子花對(duì)照在處理8d后BgNCED1表達(dá)量略有下降，到后期又有所恢復(fù)；ABA處理顯著誘導(dǎo)了BgNCED1的表達(dá)，在處理后1d即達(dá)到了對(duì)照的2.2倍，處理22d后誘導(dǎo)表達(dá)達(dá)到最大，為對(duì)照的4.6倍，隨后有所降低；ABA與不同濃度的NDGA共同處理均抑制了ABA對(duì)BgNCED1表達(dá)的誘導(dǎo)作用，所不同的是，5μmol· L－1的NDGA在整個(gè)處理過(guò)程中BgNCED1的表達(dá)量仍高于對(duì)照或與對(duì)照基本持平，而10μmol· L－1的NDGA對(duì)BgNCED1的抑制效果更為明顯，到處理后22d時(shí)，其表達(dá)量已顯著低于對(duì)照（圖6）。

圖5 BgNCED1與擬南芥NCED蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.5 Phylogenetic tree among BgNCED1 and its orthologues in Arabidopsis thaliana

圖6 不同處理下BgNCED1表達(dá)變化特征Fig.6 The expression of BgNCED1 under different treatments

3 討 論

ABA能夠調(diào)控植物成花和花期，如高濃度的內(nèi)源ABA對(duì)橄欖樹(shù)花芽形成與分化起促進(jìn)作用［11］，我們前期的工作也表明，ABA是影響葉子花成花的主要因子［10］。在本研究中，外源ABA處理能使葉子花露紅期和始花期提前，并且促進(jìn)了內(nèi)源ABA的合成；利用ABA的合成抑制劑NDGA與ABA競(jìng)爭(zhēng)性處理，發(fā)現(xiàn)NDGA在抑制ABA合成的同時(shí)，也抑制了其促進(jìn)成花提前的效果，進(jìn)一步驗(yàn)證了葉子花從營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)到生殖生長(zhǎng)轉(zhuǎn)變需要ABA的參與。值得注意的是，低濃度的NDGA處理增強(qiáng)了ABA的效果，使植株提前開(kāi)花。分析其原因，可能是5μmol·L－1NDGA沒(méi)有達(dá)到抑制ABA的合成的濃度閾值，但作為信號(hào)，誘導(dǎo)了ABA的反饋調(diào)節(jié)，但具體原因還需后續(xù)試驗(yàn)驗(yàn)證。

關(guān)于ABA的生物合成途徑，目前已基本明確，主要是通過(guò)一系列的酶促反應(yīng)，即由C40類(lèi)胡蘿卜素降解形成ABA，其中NCED是催化ABA合成的主要限速酶。本研究中，ABA處理可提高植株的NCED含量和活性，這可能就是導(dǎo)致內(nèi)源ABA升高的主要原因。通過(guò)NDGA的反向?qū)嶒?yàn)也驗(yàn)證了這一結(jié)果。

編碼NCED的基因首先在玉米ABA缺失突變體viviparousl4（vpl4）中獲得［12］，之后陸續(xù)從菜豆［13］、擬南芥［14］和柑橘［15］等植物中分離，近年來(lái)在多種觀賞植物中也克隆得到，如唐菖蒲［16］、牡丹［17］等。NCED基因編碼的氨基酸序列在不同物種中高度保守，除了具有轉(zhuǎn)運(yùn)所需的轉(zhuǎn)運(yùn)肽序列和兩親性的α－螺旋外，還有發(fā)揮催化活性必需的4個(gè)保守組氨酸殘基。通過(guò)對(duì)BgNCED1的氨基酸系列分析發(fā)現(xiàn)，其在N末端有一段轉(zhuǎn)運(yùn)肽序列，還有一個(gè)α－螺旋的兩親性結(jié)構(gòu)區(qū)，這個(gè)結(jié)構(gòu)的主要功能是蛋白定位，可以將該蛋白結(jié)合到質(zhì)體膜上，與底物發(fā)生作用；同時(shí)在BgNCED1中也檢測(cè)到了全部4個(gè)保守的組氨酸殘基，這些結(jié)果都可進(jìn)一步驗(yàn)證克隆得到的基因?qū)儆贜CED家族。另外，通過(guò)與擬南芥NCED基因家族的進(jìn)化分析，發(fā)現(xiàn)BgNCED1與AtNCED3同源性最高，意味著這兩個(gè)基因在功能上也可能有更高的相似性，可在今后的工作中進(jìn)一步研究。

在基因調(diào)控方面，研究表明，高等植物NCED基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控是ABA生物合成的主要調(diào)控步驟［14］?，F(xiàn)已明確，擬南芥中AtNCEDs是調(diào)控ABA合成的主要基因，且各基因之間存在一定的分工；在越橘（Vaccinium myrtillus）果實(shí)成熟過(guò)程中，伴隨著ABA含量的增加，VmNCED1也大量表達(dá)，表明其對(duì)ABA生物合成存在調(diào)控作用［18］；而在葡萄果實(shí)成熟前，ABA的積累主要是VvNCED1的高水平表達(dá)［19］。在觀賞植物方面，近年來(lái)關(guān)于NCED也有一些報(bào)道，在唐菖蒲種球貯藏及休眠解除過(guò)程中，其ABA生物合成可能主要受GhNCED基因的調(diào)控［16］；在牡丹中，利用外源ABA處理牡丹花瓣，發(fā)現(xiàn)Ps－NCED1表達(dá)量變化與內(nèi)源ABA含量變化趨勢(shì)一致，推測(cè)該基因是調(diào)控內(nèi)源ABA含量的主要基因［17］。本研究中，BgNCED1表達(dá)與內(nèi)源ABA含量及NCED活性等的變化較為一致，推測(cè)外源ABA可能通過(guò)誘導(dǎo)BgNCED1的表達(dá)，進(jìn)而使得NCED含量和活性達(dá)到較高水平，促進(jìn)了內(nèi)源ABA的生物合成，從而促進(jìn)了葉子花從營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)到生殖生長(zhǎng)轉(zhuǎn)變，提前開(kāi)花。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，NDGA處理在前期和后期（處理后第1天和第9天）抑制了BgNCED1的表達(dá)。一般情況下，生物體內(nèi)特定酶活性的變化與其生物合成限速酶基因之間存在著反饋調(diào)節(jié)或應(yīng)答。因此，該結(jié)果也從另一個(gè)方面證明了BgNCED1對(duì)于ABA的生物合成存在調(diào)節(jié)功能。

總之，NCED是ABA合成途徑的一個(gè)限制酶。明確葉子花BgNCED1的表達(dá)模式，可為從分子層面了解ABA對(duì)促進(jìn)葉子花開(kāi)花的作用機(jī)理提供數(shù)據(jù)支持，也可為進(jìn)一步利用基因工程改良葉子花成花奠定基礎(chǔ)，而關(guān)于ABA對(duì)葉子花的調(diào)控機(jī)理值得深入研究。

［1］ KOSHITA Y，TAKAHARA T.Effect of water stress on flower－bud formation and plant hormone content of Satsuma mandarin（Citrus unshiu Marc.）［J］.Scientia Horticulturae，2004，99：301－307.

［2］ TAKENO K，MAEDA T.Abscisic acid both promotes and inhibit sphotoperiodic flowering of Pharbitis nil［J］.Physiol.Plant，1996，98：467－470.

［3］ SU W R，HUANG K L，SHEN R S，et al.Abscisic acid affects floral initiation in Polianthes tuberose［J］.Journal Plant Physiol.，2002，159：557－559.

［4］ ZHOU B Y（周碧燕），LI Y B（李宇彬），CHEN J ZH（陳杰忠），et al.Effects of low temperature stress and ABA on flower formation and endogenous hormone of Litchi［J］.Acta Horticulturae Sinica（園藝學(xué)報(bào)），2002，29（6）：577－578（in Chinese）.

［5］ WEI K F（魏開(kāi)發(fā)），JIA W S（賈文鎖），LIN Z Y（林子英），et al.Efect of NCED3gene estradiol－induced expression on ABA biosynthetic genes and metabolic enzyme gene expression［J］.Joural of Hubei University for Nationalities（Nat.Sci.Edi.）（湖北民族學(xué)院學(xué)報(bào)·自然科學(xué)版），2009，27（1）：70－80（in Chinese）.

［6］ XU F X（徐鳳俠），WANG L SH（王亮生），SHU Q Y（舒慶艷），et al.Progress of study of the biology of the resource plant Bougainvillea［J］.Chinese Bulletin of Botany（植物學(xué)通報(bào)），2008，24（4）：483－490（in Chinese）.

［7］ LIN L X（林麗仙），XIE ZH N（謝志南），SU M H（蘇明華），et al.Effects of electrostatic field on rooting and some physiological and biochemical function of Bougainvilleacuttings［J］.Chinese Journal of Tropical Crops（熱帶作物學(xué)報(bào)），2010，31（10）：1 730－1 735（in Chinese）.

［8］ CHEN Y K（陳永康）.Flowering control technology of Bougainvillea spectabilis Willd［J］.Journal of Guangdong Landscape Architecture（廣東園林），1994，3：12（in Chinese）.

［9］ TANG Y G（唐玉貴），ZHU J Y（朱積余），HUANG Y G（黃亞光），et al.Study on flower period control of Bougainvilleaspp.［J］.Journal of West China Forestry Science（西部林業(yè)科學(xué)），2006，35（1）：36－39（in Chinese）.

［10］ ZHAO J Y（趙家昱），PAN Y ZH（潘遠(yuǎn)志），LI Y H（李永紅）.Effects of abscisic acid on flowering and some key enzymes of Bougainvillea glabra［J］.Acta Horticulturae Sinica（園藝學(xué)報(bào)），2014，41（10）：2 085－2 093（in Chinese）.

［11］ ULGER S，SONMEZ S，KATKACIER M，et al.Determination of endogenous hormones，sugars and mineral nutrition levels during the induction，initiation and differentiation stage and their effects on flower formation in olive［J］.Plant Growth Regulation，2004，42：89－95.

［12］ TAN B C，SCHWARTZ S H，ZEEVAART J A D，et al.Genetic control of abscisic acid biosynthesis in maize［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences，1997，94（22）：12 235－12 240.

［13］ QIN X，ZEEVAART J A D.The 9－cis－epoxycarotenoid cleavage reaction is the key regulatory step of abscisic acid biosynthesis in waterstressed bean［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences，1999，96（26）：15 354－15 361.

［14］ IUCHI S，KOBAYASHI M，TAJI T，et al.Regulation of drought tolerance by gene manipulation of 9－cis－epoxycarotenoid dioxygenase，a key enzyme in abscisic acid biosynthesis in Arabidopsis［J］.Plant J.，2001，27：325－333.

［15］ RODRIGO M J，ALQUEZAR B，ZACARíAS L.Cloning and characterization of two 9－cis－epoxycarotenoid dioxygenase genes，differentially regulated during fruit maturation and under stress conditions，from orange（Citrus sinensis L.Osbeck）［J］.Journal of Experimental Botany，2006，57（3）：633－643.

［16］ LUO X，YI J，ZHONG X H，et al.Cloning，characterization and expression analysis of key genes involved in ABA metabolism in Gladiolus cornels during storage［J］.Scientia Horticulturae，2012，143：115－121.

［17］ WANG X Q（王曉慶），ZHANG CH（張 超），WANG Y J（王彥杰），et al.Isolation and expression of 9－cis epoxycarotenoid dioxygenase gene in tree Peony［J］.Acta Horticulturae Sinica（園藝學(xué)報(bào)），2012，39（10）：2 033－2 044（in Chinese）.

［18］ KARPPINEN K，HIRVELA E，NEVALA T，et al.Changes in the abscisic acid levels and related gene expression during fruit development and ripening in bilberry（Vaccinium myrtillus L.）［J］.Phytochemistry，2013，95：127－134.

［19］ WANG Y SH（王延書(shū)），LI CH L（李春麗），et al.Studies on transcriptional level of VvNCED1and VvBG1，two key genes related to ABA accumulation around the veraison of grape berry ripening［J］.Acta Horticulturae Sinica（園藝學(xué)報(bào)）.2010，37（5）：801－804（in Chinese）.

（編輯：裴阿衛(wèi)）

Isolation of NCED，the Key ABA Biosynthesis Gene and Its Function Analysis in Flowering Regulation of Bougainvillea glabra

TIAN Yaran1，3，XUE Jingqi2，ZHAO Jiayu1，4，PENG Jian1，GU Mao1，LI Yonghong1＊
（1School of Applied Chemistry and Biotechnology，Shenzhen Polytechnic，Shenzhen，Guangdong 518055，China；2Institute of Vegetables and Flowers，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081，China；3College of Horticulture，Agricultural University of Hebei，Baoding，Hebei 071001，China；4College of Landscape Architecture，Sichuan Agricultural University，Chengdu 611130，China）

In this study，Bougainvillea glabra‘Mrs Butt’was used to analyze the regulation mechanism of ABA in promoting its flowering promotion.The results showed that：（1）50mg·L－1ABA treatment promotes B.glabraflowering，and 10μmol·L－1NDGA（Nordihydroguaiaretic acid，one kind of ABA biosynthesis inhibitor）treatment inhibited this effect.（2）Exogenous ABA treatment increased the content of endogenous ABA and the enzyme content and activity of nine－cis－epoxy carotenoid dioxygenase（NCED）in B.glabraleaves，and these inductions could be inhibited by NDGA treatment.（3）The full length of cloned NCEDgene was 2 380bp，and the putative encoding protein is 618aa，which showed the highest homologywith FvNCED1in the strawberry，and was named as BgNCED1.（4）Real－time PCR results showed that the expression of BgNCED1was significantly induced by ABA treatment，and 10μmol·L－1NDGA could significantly inhibit the induction effect.This expression pattern was similar to the changes of endogenous ABA content and NCED enzyme activity.Therefore，exogenous ABA may enhance endogenous ABA biosynthesis through the induction of BgNCED1expression，which promoted B.glabra from vegetative growth to reproductive growth，and ultimately make it flowering early.

ABA；Bougainvillea glabra；flower opening；nine－cis－epoxy carotenoid dioxygenase（NCED）；gene expression

Q789

A

10.7606／j.issn.1000－4025.2015.06.1106

1000－4025（2015）06－1106－07

2014－12－19；修改稿收到日期：2015－03－30

深圳市科技項(xiàng)目（2112K3070004）

田亞然（1988－），女，在讀碩士研究生，主要從事園林植物開(kāi)花生理研究。E－mail：245824586＠qq.com

＊通信作者：李永紅，教授，博士，主要從事園林植物開(kāi)花生理與分子生物學(xué)研究。E－mail：liyonghong＿03＠163.com