小鼠誘導性多能干細胞向牙源性細胞分化的體內(nèi)研究*

劉 麗 宋元利 王麗英 寧 芳 劉繼延

牙齒發(fā)育是一個復雜的過程，是牙源性上皮和牙源性間充質(zhì)相互作用發(fā)育而成[1]。牙齒是再生醫(yī)學研究領(lǐng)域的重要模型，運用干細胞及組織工程原理構(gòu)建有生物活性的組織工程牙齒是目前國內(nèi)外廣為關(guān)注的熱點課題。牙齒再生研究包括體外培養(yǎng)和體內(nèi)移植實驗兩部分。體內(nèi)移植實驗是體外培養(yǎng)的延續(xù)，體外培養(yǎng)缺乏血液供應及體內(nèi)的微環(huán)境，構(gòu)建組織或器官必須在體內(nèi)形成。因此本研究選取具有全能性的誘導性多能干細胞，在體外成功定向誘導的基礎(chǔ)上，將細胞團植入小鼠體內(nèi)，進一步觀察在體內(nèi)微環(huán)境下，小鼠誘導性多能干細胞向牙齒樣結(jié)構(gòu)分化及組織形成的潛能，以及尋找適宜的成牙微環(huán)境，為牙齒再生研究提供可行性依據(jù)。

1. 材料與方法

1.1 材料 8 周齡C57 小鼠，iPS-C5 細胞株購買于中國科學院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院。高糖DMEM(Gibco 公司，美國)；滅活胎牛血清(Gibco 公司，美國)；非必須氨基酸(Gibco 公司，美國)；丙醇酸鈉(Gibco 公司，美國)；2-巰基乙醇(Gibco 公司，美國)；白血病抑制因子(LIF，Gibco 公司，美國)；抗小鼠一抗：成釉蛋白(AMBN，Santa Cruz Biotechnology 公司，美國)，釉原蛋白(AMGN，Santa Cruz Biotechnology 公司，美國，成釉細胞特異性標記物)，牙本質(zhì)基質(zhì)蛋 白-1(DMP-1，Santa Cruz Biotechnology 公司，美國)，牙本質(zhì)涎磷蛋白(DSP，Santa Cruz Biotechnology 公司，美國)；Hoechst 33342(Sigma 公司，美國)，BMP4(R＆D System， 美國)。

1.2 iPS 細胞體外培養(yǎng) iPS 細胞以1×105/ ml 的密度均勻接種在預先鋪有滋養(yǎng)層細胞的培養(yǎng)皿內(nèi)，加入高糖DMEM 培養(yǎng)液，37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2d[2]，待細胞貼壁后開始體外誘導。iPS 細胞常規(guī)培養(yǎng)液為實驗A 組，成釉細胞無血清條件培養(yǎng)液(ASF-CM)為實驗B組， ASF-CM 中加入50ng/ ml BMP4 (ASFBMP4)為實驗C 組。不同條件誘導液培養(yǎng)iPS 細胞1 周后可在培養(yǎng)皿底部觀察到白色膜狀物質(zhì)形成。將白色膜狀物質(zhì)剝脫到離心管內(nèi)，繼續(xù)培養(yǎng)1周，iPS 細胞逐漸聚縮成團，具備一定的厚度和強度。參照Handa 的實驗方法[3]，將大約2.0×106細胞與40mg 陶瓷化骨(CBB， ceramic bovine bone)粉末混合，形成iPS 細胞聚合體／CBB 復合物，用纖維蛋白膠包裹，培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)24h，留做備用。

1.3 小鼠腎被膜移植 腎被膜下移植的操作方法可參照Colnot 的手術(shù)進路[4]。C57 小鼠采用2%戊巴比妥鈉，按50mg/ kg 體重腹腔注射進行麻醉，常規(guī)備皮，小鼠采用右側(cè)臥位以充分暴露左側(cè)腰部，捫及左腎，消毒后在此處作1cm 切口逐層切開皮膚、肌肉，進入腹腔，輕壓左腎使其從腹腔膨出，生理鹽水沾濕腎表面并始終保持腎表面濕潤，顯微外科器械游離腎被膜形成囊性空間，將細胞團植入到腎被膜下，將左腎送回腹腔，逐層縫合。實驗B 組共植入10 個細胞團，實驗C 組共植入10 個。實驗A 組作為對照組，共植入5 個。

1.4 組織學觀察移植 6 周后取出移植物，4%多聚甲醛固定液中固定24h，低溫脫鈣，常規(guī)石蠟包埋，切片厚度為5μm，采用HE 染色進行組織學檢測。

1.5 免疫組織熒光染色 6 周后取材，石蠟包埋切片，在二甲苯i、二甲苯ii 中依次浸泡切片15min，隨后在無水乙醇、95%乙醇、75%乙醇中依次浸泡切片5min；隨后在沸水中加入0.01ml枸櫞酸鈉緩沖溶液(pH6.0)進行抗原修復。端鍋于水下沖至鍋溫涼；用蠟塊畫蠟圈；用3%雙氧水于恒溫箱中放置15min，蠟圈用PBS 沖洗3 次；加入吐溫浸泡片刻，不沖洗，甩干后直接加入山羊血清封閉液，恒溫箱內(nèi)孵育半小時；滴加抗小鼠一抗AMBN(1∶100)、DSP(1∶100)，4℃冰箱內(nèi)過夜；次日復溫1h，滴加Rhodamine 標記的羊抗兔或兔抗羊二抗(1∶200)，37℃恒溫箱孵育40min。封片、鏡檢。

2. 結(jié)果

2.1 移植物組織學觀察 ASF-CM 組植入10 個細胞團，3 個移植物可觀察到角化上皮樣結(jié)構(gòu)生成。ASF-BMP4 組植入10 個細胞團：3 個移植物可以觀察到上皮樣結(jié)構(gòu)；5 個移植物可以觀察到牙本質(zhì)樣結(jié)構(gòu)生成，有類似于成牙本質(zhì)樣細胞生成，DMEM 組5 個移植物均未觀察到類似于成釉細胞樣或成牙本質(zhì)細胞樣結(jié)構(gòu)形成(圖1)。

2.2 免疫組織熒光檢測結(jié)果 為了進一步驗證HE 染色結(jié)果，利用成釉細胞特異性抗體AMBN 以及成牙本質(zhì)細胞特異性抗體DSP 進行免疫組織熒光檢測，熒光顯微鏡結(jié)果顯示ASF-CM組形成的上皮樣結(jié)構(gòu) AMBN 染色陽性。ASF-BMP4 組形成的上皮樣結(jié)構(gòu)陽性表達AMBN；形成的牙本質(zhì)樣結(jié)構(gòu)陽性表達DSP。未誘導的DMEM 組作為對照組，AMBN、DSP 染色陰性(圖2)。

3. 討論

圖1 體內(nèi)移植8 周后組織學觀察

圖2 體內(nèi)移植8 周后免疫組織熒光染色

牙齒是一種復雜的器官，由釉質(zhì)、牙本質(zhì)、牙骨質(zhì)、牙周膜共同構(gòu)成。牙齒的發(fā)育過程是牙源性上皮細胞與牙源性間充質(zhì)細胞相互作用的結(jié)果。牙源性上皮細胞可以誘導牙源性間充質(zhì)細胞分化成牙本質(zhì)和牙髓，而牙源性上皮又在牙源性間充質(zhì)細胞誘導下分化成釉質(zhì)[5]。然而牙源性上皮細胞終末分化的成釉細胞在成體中缺失，使得釉質(zhì)的生物性再生成為世界性難題。本實驗從出生7d 的C57 仔鼠的下頜切牙分離成釉細胞，使用成釉細胞的無血清條件培養(yǎng)液(ASF-CM)以及ASF-CM 聯(lián)合生長因子BMP4 兩種方式誘導iPS 細胞，對照組為未誘導的iPS 細胞。小鼠腎被膜下移植8 周后取材結(jié)果顯示：ASF-CM 組形成角化上皮樣結(jié)構(gòu)，免疫組織熒光檢測顯示形成的上皮樣結(jié)構(gòu)屬于牙源性上皮，AMBN 表達陽性。ASF-BMP4 組可觀察到上皮樣結(jié)構(gòu)和牙本質(zhì)樣結(jié)構(gòu)生成，進一步免疫組織熒光檢測AMBN、DSP 陽性，提示ASF-BMP4 組向成釉細胞譜系和成牙本質(zhì)細胞譜系轉(zhuǎn)化。對照組形成畸胎瘤樣結(jié)構(gòu)，沒有觀察到明顯的成釉細胞樣和成牙本質(zhì)細胞樣結(jié)構(gòu)生成，AMBN、DSP 表達均陰性。本實驗驗證了我們前期體外研究的結(jié)果[6]，在適宜的微環(huán)境下，iPS 細胞可以向牙上皮樣結(jié)構(gòu)和牙本質(zhì)樣結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化。

微環(huán)境是組織工程再生研究的一個重要因素，是細胞在體內(nèi)賴以生存的環(huán)境，由細胞、生長因子、細胞外基質(zhì)構(gòu)成，三者之間通過相互作用構(gòu)成一個三維的動態(tài)空間，控制著細胞的增殖、遷移和分化[7]。近年來有許多研究利用牙胚細胞條件培養(yǎng)液模擬牙齒早期發(fā)育的微環(huán)境，誘導牙源性干細胞或非牙源性干細胞向牙本質(zhì)方向轉(zhuǎn)化。發(fā)育早期的牙胚細胞中含有牙齒發(fā)育所需的全部信息，牙胚細胞之間通過傳遞這些信息，實現(xiàn)牙齒的形態(tài)發(fā)生[8-10]。于金華博士利用大鼠切牙牙胚細胞條件培養(yǎng)液，將牙髓干細胞分化為成牙本質(zhì)細胞，腎被膜移植后形成牙本質(zhì)牙髓復合體樣結(jié)構(gòu)。并且，于金華博士認為牙胚細胞條件培養(yǎng)液微環(huán)境下，牙髓干細胞牙向分化的過程是牙源性上皮信號起決定性作用的結(jié)果[11]。寧芳博士利用成釉細胞無血清條件培養(yǎng)液將胚胎干細胞分化為牙源性上皮細胞，推測成釉細胞分泌的BMPs、Notch-1、TGF-βs 和FGFs 等一些信號分子通過相互協(xié)同或拮抗作用，使胚胎干細胞產(chǎn)生了特殊的感受性，從而向牙上皮方向轉(zhuǎn)化[12]。

BMPs 是口腔上皮中最早表達的信號分子之一，在上皮－間充質(zhì)的相互誘導中起關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用[13]。BMPs 信號首先在胚胎11d 的小鼠牙上皮中表達，BMPs 與其他生長因子相互協(xié)同誘導下方間充質(zhì)中轉(zhuǎn)錄因子的表達。隨后轉(zhuǎn)移到下方的間充質(zhì)中，BMPs 又反饋調(diào)節(jié)上皮信號因子的表達。國內(nèi)外研究表明BMP2 能促進牙髓干細胞分化為成牙本質(zhì)細胞[14-15]。Col-Ⅰ聯(lián)合BMP4 可以誘導小鼠ES/ iPS 細胞向成牙本質(zhì)細胞分化[16-17]。我們前期體外研究通過加入BMP4 的拮抗劑noggin，亦證明了BMP4 在iPS 牙向分化中發(fā)揮著重要作用[6]。

雖然在本實驗中我們?nèi)〉玫慕Y(jié)果并不典型，但仍有一定的探索性，而如何提高iPS 細胞的誘導效率以及避免iPS 細胞致畸性也存在很大困難。另外，單一的因子不能模擬復雜的牙胚發(fā)育環(huán)境，如何建立一個適宜的微環(huán)境高效率的誘導iPS 細胞牙向分化，仍需要我們不斷的努力。

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