Germlin1與NT-proBNP在肝硬化進展過程中的表達①

賈 薇，胡立華，張沛怡

(1.佳木斯大學附屬第一醫(yī)院消化內科，黑龍江 佳木斯 154003;2.黑龍江省醫(yī)院消化內科，黑龍江 哈爾濱 150036)

Germlin1與NT-proBNP在肝硬化進展過程中的表達①

賈 薇1，胡立華2，張沛怡2

(1.佳木斯大學附屬第一醫(yī)院消化內科，黑龍江 佳木斯 154003;2.黑龍江省醫(yī)院消化內科，黑龍江 哈爾濱 150036)

目的：研究Germlin1及NT-proBNP在慢性乙型肝炎、乙型肝炎后肝硬化中的表達以及兩者在不同程度肝硬化中的表達與變化，分析兩者在肝硬化進展過程中的作用。方法：分別采用免疫組織化學SP染色法檢測Germlin1、免疫熒光定量法檢測NT-proBNP在正常肝臟組織、慢性乙型肝炎以及乙型肝炎后肝硬化中的表達，以及兩者在肝硬化不同Child-Pugh分級中的表達。結果： Gremlin1及NT-proBNP在正常肝臟組織中的表達率分別為16.7%、26.7%，在慢性乙型肝炎中的表達率分別為49.0%、40.8%，在乙型肝炎后肝硬化中的表達率分別為67.8%、59.3%，差異具有顯著性(P<0.01)；Germlin1在肝硬化Child-PughA、B、C級中的表達率分別為38.5%、70.0%、84.0%，三者比較具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；NT-proBNP在肝硬化Child-PughA、B、C級中的表達率分別為38.5%、50.0%、76.9%，三者比較具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；Gremlin1及NT-proBNP之間也呈正相關。結論：Gremlin1及NT-proBNP在肝硬化中的表達顯著增高，且Gremlin1是重要的促肝纖維化因子。Gremlin1及NT-proBNP對肝纖維化的診斷及預后判斷具有潛在的應用價值。

Gremlin1;NT-proBNP;肝纖維化;免疫組化;免疫熒光定量法

Gremlin1屬于BMP拮抗劑家族的成員。慢性肝損傷后的炎癥修復過程激活轉化生長因子-β1(TGF-β1)信號，TGF-βsmad信號通路活性受到骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bonemorphogeneticprotein，BMP)負向調節(jié)作用，而TGF-β信號轉導通路對gremlin1的表達起到正向調控的作用。炎癥時TGF-β信號異常增強，上調gremlin1基因表達，反饋性的抑制BMPs的功能，并由此進一步強化TGF-β信號轉導通路，進而對纖維化的形成起到加速作用。新近的研究發(fā)現(xiàn)，Gremlin1與多種纖維化疾病及腫瘤有關[1，2]。

B型利鈉肽又稱為腦利鈉肽(B-typenatriureticpeptide，Brainnatriureticpeptide，BNP)，是利鈉肽家族成員之一。具有拮抗肝硬化引起血流動力學及神經內分泌功能改變的作用。氨基端腦鈉肽前體(NT-proBNP) 是一種前激素原BNP。最近的研究報道稱NT-proBNP在丙肝病毒感染患者中呈高表達，其表達程度與肝纖維化程度成正比[3，4]。因此本研究旨在通過檢測Gremlin1及NT-proBNP在慢性乙型肝炎、乙型肝炎后肝硬化中的表達以及兩者在不同程度肝硬化中的表達與變化，探討兩者在肝硬化進展過程中的作用。

1 實驗材料

1.1 標本來源及實驗分組

收集黑龍江省醫(yī)院消化內科2012-12～2014-03經臨床和肝活檢病理切片確診為慢性乙型肝炎的患者49例、乙型肝炎后肝硬化的患者59例。其中59例乙型肝炎后肝硬化患者按ChildPugh分級法依次分成ChildPughA級13例,B級20例,C級26例。同時設正常對照組30例，均為無病毒性肝炎及肝硬化等肝臟疾病史，而因肝外傷而行肝臟切除術患者的肝組織或者由于僅有肝臟血清酶學改變而行肝穿刺后病理正常的肝臟組織。每例患者均在入院后第二天空腹抽取肘靜脈血1.5mL，置于已經加入乙二胺四乙酸鈉(EDTA-Na)溶液的試管中。全部病例必須排除心衰患者。

1.2 主要試劑

Gremlin1抗體、PBS緩沖液、乙二胺四乙酸鈉 (EDTA-Na) 溶液、EDTA抗原修復液、通用SP試劑盒和DAB顯色試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。NT-proBNP試劑盒購自美國ADL公司。

2 實驗方法

2.1Gremlin1檢測

取肝活檢組織標本置于10%甲醛中固定24h，石蠟包埋，制成5μm切片。采用免疫組化SP法檢測Gremlin1的表達情況。對照：以肝癌組織作為陽性對照，以PBS緩沖液代替一抗作為陰性對照。實驗步驟嚴格按照操作說明，抗原修復用EDTA抗原修復液直接煮沸抗原修復。

2.2 血漿NT-proBNP濃度測定

早晨空腹抽取肘靜脈血約1.5mL,置于已經加入乙二胺四乙酸鈉(EDTA-Na)溶液的試管中,在4h內送檢。在TriageMeterPlus全自動測定儀上使用免疫熒光定量法測定。

2.3 結果判定

Gremlin1陽性細胞染色為胞漿出現(xiàn)棕黃色-黃色均勻顆粒。觀察10個高倍視野計算陽性細胞數(shù)，以百分數(shù)表示( 陽性細胞數(shù)/總細胞數(shù))。將陽性細胞百分數(shù)的結果分為四個等級，≥25%為(-)，25%～50%為(+)，50%～75%為()，> 75%為()。

NT-proBNP血漿濃度的參考范圍在0～125pg/mL。

2.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS17.0軟件包進行統(tǒng)計學分析，數(shù)據(jù)采用χ2檢驗，P<0.05表示有統(tǒng)計學意義，P<0.01表示有顯著差異性。

3 結果

3.1Gremlin1在不同肝臟組織中的表達

Gremlin1表達的蛋白定位于陽性表達的細胞胞漿，呈棕黃色-黃色顆粒，在正常肝臟組織中的表達率為16.7%(5/30)，在慢性乙型肝炎中的表達率為49.0%(24/49)，在乙型肝炎后肝硬化中的表達率為67.8%(40/59)。Gremlin1在三組病例中的表達具有顯著差異性(χ2=20.828，P=0.000)，見表1、圖1。

3.2NT-proBNP在不同肝臟組織中的表達

在無肝臟相關疾病患者血漿NT-proBNP水平平均值為(49.32±7.8)pg/mL、慢性乙型肝炎患者血漿NT-proBNP水平平均值為(85.3±15.23)pg/mL、乙型肝炎后肝硬化患者血漿NT-proBNP水平平均值為(254.48±695.43)pg/mL，表達率分別為26.7%(8/30)、40.8%(20/49)、59.3%(35/59)，三者比較具有統(tǒng)計學意義(χ2=9.264，P<0.05)，見表2。

表1 Gremlin1在不同肝臟組織中的表達及陽性率

圖1 Gremlin1在正常肝臟組織(A)、慢性乙型肝炎(B)及乙型肝炎后肝硬化(C)中的表達(×400)

組別nPositive(%)χ2P對照組308(26．7)慢性乙型肝炎4920(40．8)9．264<0．05乙型肝炎后肝硬化5935(59．3)

3.3Gremlin1及NT-proBNP在乙型肝炎后肝硬化不同Child-Pugh分級中的表達

Gremlin1在乙型肝炎后肝硬化不同Child-Pugh分級中的表達率分別為Child-PughA38.5%(5/13)、Child-PughB70.0%(14/20)、Child-PughC84.0%(21/26)，三者比較具有統(tǒng)計學意義(χ2=7.173，P<0.05)；血漿NT-proBNP水平在不同ChildPugh分級間依次增高，其中Child-PughA級者NT-proBNP均值為(35.48±2.18)pg/mL、Child-PughB級者NT-proBNP均值為(159.32±10.50)pg/mL、Child-PughC級者NT-proBNP均值為(413.81±26.75)pg/mL，其表達率分別為38.5%(5/13)、50.0%(10/20)、76.9%(20/26)，三者比較具有統(tǒng)計學意義(χ2=,6.402，P<0.05)，見表3。

表3 Gremlin1及NT-proBNP在乙型肝炎后肝硬化不同Child-Pugh分級中的表達及陽性率

3.4 59例乙型肝炎后肝硬化中Gremlin1與NT-proBNP表達的關系

59例乙型肝炎后肝硬化中Gremlin1有40例表達陽性，其中28例NT-proBNP表達，占70%；另外24例NT-proBNP表達陰性的乙型肝炎后肝硬化中，12例Gremlin1表達，占50%。兩者之間具有關聯(lián)性(χ2=5.869，P<0.05)，并可見二者呈正相關，見表4。

表4 乙型肝炎后肝硬化中Gremlin1、NT-proBNP表達的相關性

4 討論

肝纖維化是多種慢性肝病所共有的病理改變，是機體對各種病因引起的慢性肝損傷后的一種損傷修復反應[5],是各種慢性肝病向肝硬化發(fā)展的必經階段[6]。各種常見的致病因子包括病毒性肝炎、慢性酒精中毒、遺傳和代謝疾病、化學毒物或藥物、肝臟淤血、脂肪肝、寄生蟲病等[7]。在這些致病因素的作用下，靜止期的肝星狀細胞(hepaticstellatecell，HSC)被激活，同時增殖、轉化為肌成纖維樣母細胞(Myofibroblast，MF)，分泌大量細胞外基質(extracellarmatrix，ECM)。細胞外基質合成與降解失去動態(tài)平衡，導致細胞外基質在肝臟過度沉積而引起肝纖維化。

Gremlin1基因首先從爪蟾中樞神經脊中克隆出來，其編碼的蛋白質有三種，分別是gremlin1、gremlin2和gremlin3。其中gremlin1是一種結構高度保守的分泌型蛋白，定位于染色體 15q13-q15[8，9]，屬于BMP拮抗劑家族的成員。Gremlin1不僅存在于胚胎時期，也存在于成年動物個體。人體多種組織包括腦、卵巢、大腸以及病理過程中的肝臟、肺組織等都有Germlin1 的表達，Gremlin1 可能在器官、體征的形成和組織分化中起重要的作用[10]。有充分的依據(jù)表明，Gremlin1是糖尿病腎纖維化主要的促進因子[11]，在肺纖維化過程中也起著重要的促進作用[12]。新近的研究發(fā)現(xiàn)，Gremlin1與多種纖維化疾病及腫瘤有關[1，2]。研究表明Gremlin1 也與肝纖維化有關，是重要的肝纖維化促進因子。本研究結果顯示Gremlin1在正常肝臟組織中的表達率為16.7%(5/30)，在慢性乙型肝炎中的表達率為49.0%(24/49)，在乙型肝炎后肝硬化中的表達率為67.8%(40/59)。在統(tǒng)計學上具有差異性(P<0.01)。Gremlin1的陽性表達率在乙型肝炎后肝硬化不同ChildPugh分級間呈依次增高。檢測Gremlin1可能對慢性乙型肝炎向肝纖維化、肝硬化乃至肝癌演變過程的研究具有較高價值。

B型利鈉肽又稱為腦利鈉肽(B-typenatriureticpeptide，Brainnatriureticpeptide，BNP)，是利鈉肽家族成員之一。在心肺、骨髓、腦等組織中廣泛分布，尤其在心臟中的含量最高。主要由心室肌細胞產生和分泌。肝硬化患者處于系統(tǒng)循環(huán)高動力狀態(tài)，有潛在誘發(fā)心功能不全的可能。BNP具有擴張血管，降低血壓，拮抗腎素一血管緊張素一醛固酮系統(tǒng)(RAAS)，促進尿鈉排泄、減少水鈉潴留等作用, 從而減輕心臟負荷,糾正心力衰竭。國外已有文獻報道肝硬化時血漿BNP水平增高[13]。氨基端腦鈉肽前體(NT-proBNP) 是一種前激素原BNP。NT-pro-BNP較長的半衰期使其成為反映心室應激狀態(tài)的一個更精確的指標,是使用最廣泛的心衰生物標志物[14]。最近的研究報道稱NT-proBNP在丙肝病毒感染患者中呈高表達，其表達程度與肝纖維化程度成正比[3，4]。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，NT-proBNP在正常對照組、慢性乙型肝炎、乙型肝炎后肝硬化表達率分別為26.7%(8/30)、40.8%(20/49)、59.3%(35/59)，三者比較具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。且在乙型肝炎后肝硬化不同ChildPugh分級間呈依次增高表達。表明了NT-proBNP可能參與了肝纖維化的進展。

Gremlin1與NT-proBNP可能共同促進肝纖維化的發(fā)展。心力衰竭發(fā)生發(fā)展的基本機制是心室重塑。肝硬化患者處于系統(tǒng)循環(huán)高動力狀態(tài)，有潛在誘發(fā)心功能不全的可能。BNP具有拮抗肝硬化引起血流動力學及神經內分泌功能改變的作用。TGF-β1是重要的促纖維化因子，可誘導心肌纖維化，導致心室重塑，因此NT-proBNP可能是通過TGF-β信號轉導通路與Gremlin1共同促進肝纖維化的發(fā)展。本實驗結果顯示，在59例乙型肝炎后肝硬化標本中，Gremlin1陽性表達40例，NT-proBNP陽性表達35例，共同陽性表達28例，共同陰性12例。二者在乙型肝炎后肝硬化中的表達具有正相關性，并且在乙型肝炎后肝硬化不同ChildPugh分級間均呈現(xiàn)遞增趨勢。提示兩者在肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展過程中可能起到協(xié)同作用， 兩種因子的聯(lián)合檢測可能為臨床診治提供更為敏感的無創(chuàng)診斷標志，并且采取切實可行的抗肝纖維化治療，進而達到治療肝硬化、預防肝癌發(fā)生的可能。

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The expression of Germlin1 and NT-proBNP in the development of liver cirrhosis

JIAWei1,HULi-hua2,ZHANGPei-yi2

(1.The Department of Gastroenterology, the First Affiliated Hospital of Jiamusi University,Jiamusi 154003,China;2.The Department of Gastroenterology, the Hospital of Heilongjiang Province, Harbin 150036, China)

Objective: To research the expressions of Germlin1 and NT-proBNP in chronic hepatitis B and hepatitis B cirrhosis, and their expressions and changes in different degrees of liver cirrhosis; and to analysis their roles in the development of liver cirrhosis. Methods: Germlin1 was detected by using the method of immunohistochemical SP staining, and NT-proBNP’s expressions in normal liver tissue, chronic hepatitis B and hepatitis B cirrhosis together with their expressions in different Child-Pugh’s classification of liver cirrhosis were detected by using the method of the Immunofluorescence quantification. Results: The expression rates of Gremlin1 and NT-proBNP in normal liver tissue was 16.7%、26.7%, 49.0%、40.8% in chronic hepatitis B, 67.8%、59.3% in Hepatitis B cirrhosis. The difference was significant(P<0.01).TheexpressionratesofGremlin1inlivercirrhosisChild-PughA,B,C-levelwere38.5%, 70.0%, 84.0%,andtheywerestatisticallysignificantbycomparison(P<0.05).TheexpressionratesofNT-proBNPinlivercirrhosisChild-PughA,B,C-levelwere38.5%, 50.0%, 76.9%,andtheywerestatisticallysignificantbycomparison(P<0.05).Gremlin1andNT-proBNPwerepositivecorrelation. Conclusion: The expressions of Gremlin1 and NT-proBNP in liver cirrhosis increased significantly, and Gremlin1 was an important factor of promote hepatic fibrosis. Gremlin1 and NT-proBNP displayed the potential value in the diagnosis and prognosis of liver fibrosis.

Gremlin1; NT-proBNP; liver Fibrosis; immunohistochemistry; immunofluorescence quantification

賈薇(1987～)女，黑龍江大興安嶺人，在讀碩士研究生，醫(yī)師。

張沛怡(1958～)女，黑龍江哈爾濱人，主任醫(yī)師，碩士研究生導師。E-mail:zhangpeiyi@hotmail.com。

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A

1008-0104(2015)02-0128-03

2014-11-20)