左乙拉西坦對癲癇大鼠海馬組織中GFAP及5-HT2A受體表達的影響①

聶 磊，王海燕，李春玉，鄒艷紅，王 禹，遲瑛嬌，王 影,趙塔娜，趙冬梅

(佳木斯大學附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154003)

左乙拉西坦對癲癇大鼠海馬組織中GFAP及5-HT2A受體表達的影響①

聶 磊，王海燕，李春玉，鄒艷紅，王 禹，遲瑛嬌，王 影,趙塔娜，趙冬梅

(佳木斯大學附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154003)

目的：通過建立氯化鋰-匹羅卡品(Li-PILO)誘導的癲癇大鼠模型，觀察左乙拉西坦(LEV)對癲癇大鼠海馬組織中膠質纖維酸性蛋白(GFAP)及5-羥色胺2A(5-HT2A)受體動態(tài)表達的影響，進一步闡明左乙拉西坦的抗癲癇機制。方法：108只Wistar大鼠隨機分為4組：生理鹽水組(NS)24只、左乙拉西坦對照組(LEV)24只、模型組(Li-PILO)30只、模型組+左乙拉西坦組(Li-PILO+LEV)30只，分別給予LEV組和Li-PILO+LEV組大鼠LEV200mg/kg每日1次灌胃，連續(xù)28d。采用RT-PCR方法分別在第7天、第14天、第28天動態(tài)檢測大鼠海馬組織中GFAP和5-HT2A受體的表達。結果：(1)各組大鼠海馬組織中GFAP表達水平：與NS組比較，Li-PILO組大鼠海馬組織中GFAP在第7天、第14天、第28天表達水平顯著升高(P<0.05)，且隨時間延長升高更明顯；與Li-PILO組比較，Li-PILO+LEV組GFAP表達水平明顯降低(P<0.05)。(2)各組大鼠海馬組織中5-HT2A受體表達水平：LEV對照組與NS組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與NS組比較Li-PILO組在第7天時表達水平降低，且隨時間延長降低水平越明顯，即在第14天、第28天5-HT2A受體表達水平明顯降低(P<0.05)；與Li-PILO組比較，Li-PILO+LEV組5-HT2A受體在第7天、第14天、第28天表達水平明顯升高(P<0.05)。結論：LVE的抗癲癇作用可能與通過上調5HT-2A受體的表達及抑制GFAP的表達有關，但具體作用機制還需進一步探討。

左乙拉西坦；癲癇；膠質纖維酸性蛋白；5-羥色胺2A受體；氯化鋰-匹羅卡品

癲癇是兒童時期常見的神經(jīng)系統(tǒng)疾病之一，是腦部的一種慢性疾患，特點是大腦神經(jīng)元反復發(fā)作性異常放電而引起相應的突發(fā)性和一過性腦功能障礙。反復、持續(xù)的癲癇發(fā)作會導致患兒的認知功能受影響，嚴重者還有腦水腫和顱內(nèi)壓增高的表現(xiàn)，甚至出現(xiàn)持久性神經(jīng)精神障礙，從而影響患兒的生活質量[1,2]。然而許多抗癲癇藥物會使患兒的認知功能受到不同程度的損害。因此需要尋求一種既有抗癲癇作用又有腦保護作用的抗癲癇藥物，與其他抗癲癇藥物抗癲癇機制不同，其他抗癲癇藥物是通過增加腦中抑制性神經(jīng)遞質r-氨基丁酸(GABA)的含量而發(fā)揮抗癲癇作用。而左乙拉西坦抗癲癇機制獨特，通過與中樞神經(jīng)元突觸囊泡蛋白結合而達到抗癲癇作用。突觸囊泡蛋白主要分布在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)，具有調節(jié)突觸前神經(jīng)遞質的釋放和突觸囊泡的外分泌的作用，突觸囊泡蛋白基因破壞可導致嚴重的抽搐和過早死亡。左乙拉西坦(LVE)與突觸囊泡蛋白有很高的結合能力，結合后可以與抑制神經(jīng)元異常放電，從而發(fā)揮抗癲癇的作用[3]。研究發(fā)現(xiàn)LVE對于治療多種癲癇發(fā)作類型有顯著效果并有改善認知功能的作用[4]。本課題通過建立氯化鋰-匹羅卡品癲癇大鼠模型，初步探討LVE對癲癇大鼠海馬組織中膠質纖維酸性蛋白(GFAP)和5-羥色胺2A(5-HT2A)受體表達的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及分組[5]

清潔級的Wistar大鼠108只(由大連醫(yī)科大學動物實驗中心提供)，體重約為80～100g，隨機分為4組。即生理鹽水組(NS)24只、左乙拉西坦組(LEV)24只、模型組(Li-PILO)30只、模型組+左乙拉西坦組(Li-PILO+LEV)30只。

1.2 實驗試劑和癲癇模型建立

氯化鋰和皮羅卡品(Sigma公司)，左乙拉西坦(UCBS.A.Belgim公司)，RT-PCR試劑盒和引物合成(北京華邁科生物技術有限公司)。動物模型的建立過程參照相關文獻[7]并稍有改進，將Li-PILO組及Li-PILO+LEV組大鼠先腹腔注射氯化鋰120mg/kg，20h后，再腹腔注射東莨菪堿1mg/kg，以拮抗外周膽堿能反應，30min后再次腹腔注射皮羅卡品80mg/kg，并觀察大鼠的行為。大鼠的癲癇發(fā)作分級參照RACINE分級：0級—無反應或抽搐停止；Ⅰ級—面部抽動、咀嚼；Ⅱ級—面部抽動、咀嚼、點頭；Ⅲ級—面部抽動、咀嚼、點頭、前肢或后肢抽動；Ⅳ級—面部抽動、咀嚼、點頭、前肢或后肢抽動、多肢抽動或強直；Ⅴ級—全面性強直陣攣發(fā)作。在大鼠癲癇發(fā)作30min后，立即腹腔注射地西泮(10mg/kg)終止癲癇發(fā)作。Li-PILO+LEV組在成功建立模型后的4h給予LVE200mg/kg，每日1次，連續(xù)28d，動態(tài)觀察并分別于第7天、第14天、第28天提取海馬組織進行實驗。

1.3RT-PCR法檢測大鼠海馬組織中GFAP和5-HT2A受體的表達

模型建立28d后，4組大鼠給予10%水合氯醛(0.1mL/kg)麻醉后固定， 斷頭取出海馬組織并立即放在液氮中保存。 海馬組織勻漿后， 加入Trizol液提取mRNA，按照試劑盒說明書進行逆轉錄合成cDNA，

將cDNA產(chǎn)物進行Real-timePCR循環(huán)。從NCBI庫中搜索到GFAP和5-HT2A受體應用Premier5.0引物設計軟件設計引物。引物序列：GFAP上游：5’GGATGTGATGTGAGGTGTGC3’，下游：5’CCTCGG-GATCTTTTCCTTTC3’；5-HT2A上游：5’GGTTTCCTT-GTCATGCCTGT3’，下游：5’TGCAGGATTCTTTGCAGATG3’；內(nèi)參GAPDH上游：5’TGCTTCACCACCTTCTTGA3’，下游：5’TCACCATCTTCCAGGAGCG3。擴增后進行瓊脂糖凝膠電泳。

1.5 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 觀察大鼠行為學表現(xiàn)

NS組和LEV組無癲癇發(fā)作。匹羅卡品腹腔注射約5～10min后，Li-PILO組和Li-PILO+LEV組大鼠出現(xiàn)癲癇發(fā)作，表現(xiàn)為面部抽動、點頭、洗臉、前肢陣攣、跌倒、以至全面性強直陣攣發(fā)作，其中Li-PILO組和Li-PILO+LEV組共有9只大鼠抽搐后死亡，癲癇發(fā)作30min后立即給予地西泮(10mg/kg)腹腔注射終止發(fā)作，在大鼠成功建立模型后，Li-PILO組和Li-PILO+LEV組大鼠表現(xiàn)出易激惹，并可觀察到Ⅰ～Ⅳ級的癲癇發(fā)作。

2.2 各組大鼠海馬組織中GFAP的表達

與NS組比較，Li-PILO組大鼠海馬組織中GFAP在第7天、第14天、第28天表達水平顯著升高(P<0.05)，且隨時間延長GFAP表達水平升高更明顯；與Li-PILO組比較，Li-PILO+LEV組GFAP表達水平明顯降低(P<0.05)；LEV組與NS組比較無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1、圖1。

表1 海馬組織中GFAP的相對表達量的比較

注：#與NS組比較，P<0.05；*與Li-PILO組比較，P<0.05。

A：Li-PILO+LEV組；B：Li-PILO組；C：NS組；D：LEV組

2.3 各組大鼠海馬組織中5HT-2A受體的表達

NS組內(nèi)各時間點5-HT2A受體表達水平比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與NS組比較，Li-PILO組在第7天時大鼠海馬組織中5-HT2A受體表達水平降低，且隨時間延長5-HT2A受體表達水

平明顯降低，即在第14天、第28天5-HT2A受體表達水平明顯降低(P<0.05)；與Li-PILO組比較，Li-PILO+LEV組5-HT2A受體在第7天、第14天、第28天表達水平明顯升高(P<0.05)。見表2、圖2。

A：Li-PILO+LEV組；B：Li-PILO組；C：NS組；D：LEV組

分組 第7天 第14天 第28天NS組GFAP0．662±0．1750．678±0．1640．698±0．188LEV組0．638±0．185△0．696±0．212△0．681±0．172△Li-PILO組0．473±0．235#0．338±0．242#0．215±0．086#Li-PILO+LEV組0．526±0．164?0．412±0．139?0．378+0．123?F值 11．27 19．54 33．62P <0．05 <0．05 <0．05

注：#與NS組比較，P<0.05；*與Li-PILO組比較，P<0.05。

3 討論

癲癇是小兒時期常見的神經(jīng)系統(tǒng)疾病之一，其特點是自發(fā)、慢性、短暫、反復發(fā)作。癲癇可引起患兒的人格障礙、記憶力減退、智力低下等表現(xiàn)，尤其是在患兒的發(fā)育早期影響較大[7]。膠質纖維酸性蛋白(GFAP)是一種中間絲蛋白，主要存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)星形細胞[8]。星形膠質細胞參與了神經(jīng)遞質的代謝，有研究證實星形膠質細胞能夠釋放谷氨酸，細胞外谷氨酸攝取80%～90%是通過星形膠質細胞谷氨酸轉運。GFAP作為細胞骨架蛋白家族成員之一，在調節(jié)星形細胞運動及穩(wěn)定神經(jīng)突觸形成過程中起到重要的作用。有研究報道，當神經(jīng)系統(tǒng)受到損傷或刺激時，腦組織中GFAP表達上調[9]。蘭莉等[10]通過用免疫組化方法研究發(fā)現(xiàn)，大鼠癲癇發(fā)作后GFAP星型膠質細胞增多。GarciaAD等[11]研究發(fā)現(xiàn)，癲癇發(fā)作后大鼠海馬組織中GFAP表達明顯升高。姜春玲等[12]報道，紅藻氨酸(KA)癲癇大鼠海馬結構內(nèi)兩種調控GFAP基因表達的結合蛋白在致癇后的第1天時表達升高，3周時升高更顯著，至3個月時仍有較高表達。目前關于左乙拉西坦(LVE)對GFAP表達的影響，何繪敏等[13]研究報道，LVE可以抑制大鼠海馬組織中GFAP表達升高。本實驗研究結果顯示，癲癇發(fā)作后海馬組織中GFAP表達水平顯著升高，且隨著癲癇發(fā)作時間的延長，GFAP表達水平升高越顯著，應用LVE治療后GFAP的表達水平明顯降低。由此可知，癲癇發(fā)作能夠使GFAP星形膠質細胞增生，而LVE可以明顯抑制其增生，從而達到抗癲癇作用。

5-羥色胺(5-HT)是一種吲哚衍生物，是重要的神經(jīng)遞質，其主要的作用有參與記憶和學習、情緒、食欲、體溫調節(jié)、心血管功能、睡眠控制、性和致幻行為、調節(jié)內(nèi)分泌和抑郁以及肌肉收縮等生理功能[14]。5-HT2A受體是5-HT受體的亞型之一。有研究報道5-HT2A受體與神經(jīng)系統(tǒng)疾病密切相關，BergKA等[15]研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)受損時腦組織中5-HT2A受體數(shù)目明顯減少。然而目前關于5-HT2A受體與癲癇的關系國內(nèi)外暫無報道，而關于5-HT與癲癇的關系報道很多，5-HT在含有抑制性遞質γ氨基丁酸的神經(jīng)元上表達，從而激活γ氨基丁酸，間接地發(fā)揮其抗癲癇作用。通過本課題研究我們發(fā)現(xiàn)，癲癇大鼠5-HT2A受體表達水平顯著降低，尤其在第28天時降低更為顯著，而治療組5-HT2A受體表達水平明顯升高，提示5-HT2A受體與癲癇有密切的關系，LVE的抗癲癇機制可能是通過升高5-HT2A的表達而發(fā)揮其抗癲癇作用。

綜上所述，GFAP和5-HT2A受體與癲癇有密切的關系，都參與了癲癇的發(fā)生發(fā)展。LVE的抗癲癇作用可能與通過上調5HT-2A受體的表達及抑制GFAP的表達有關，但其具體作用機制還需進一步探討。

[1]WolfgangLoscher,ClaudiaBrandt.PreventionorModificationofEpileptogenesisafterBrainInsults:ExperimentalApproachesandTranslationResearch[J].PharmacolRev, 2010, 62(4): 669-700

[2]DiIorioCK,BampsYA,EdwardsAL,etal.Thepreventionresearchcenters'managingepilepsywellnetwork[J].EpilepsyBehav, 2010, 19(3): 218-224

[3]AmyNowack,ErikBMalarkey,JiaYao,etal.LevetiracetamReversesSynapticDeficitsProducedbyOverexpressionofSV2A[J].PLOSOne, 2011, 6(12): 1-8

[4]SanchezPE,ZhuL,VerretL,etal.LevetiracetamsuppressesneuronalnetworkdysfunctionandreversessynapticandcognitivedeficitsinanAlzheimer’sdiseasemodel[J].ProcNatlAcadSciUSA, 2012, 109(42): 2895-903

[5]王海燕，王影，聶磊，等. 左乙拉西坦對癲癇大鼠認知功能及海馬組織中NPY和NCAM-mRNA表達的影響[J]．黑龍江醫(yī)藥科學，2013，36(3)：3-4

[6]梁益, 孫紅斌.氯化鋰-匹羅卡品癲癇模型研究[J]. 實用醫(yī)學臨床雜志, 2008, 5(3): 112-114

[7]HermannBP,SerdenergM,BelB,etal.Theneurodevelopmentalimpactofchildhoodonsettemporallobeepilepsyonbrainstructureandfunction[J].Epilepsia, 2002, 43(9): 1062-1071

[8]EngLF,GhirnikarRS,LeeYL.Glialfibrillaryacidicprotein:GFAP-thirty-oneyears(1969-2000) [J].NeurochemRes, 2000, 25(9): 1439-1451

[9]MiddeldorpJ,HolEM.GFAPinhealthanddisease[J].ProgNeurobiol, 2011, 93(3): 421-443

[10]蘭莉,饒志仁,趙新,等.甘珀酸對戊四氮點燃癲癇大鼠海馬GFAP和Cx43表達的影響[J]. 臨床兒科雜志, 2008, 26(6): 524-528

[11]GarciaAD,DoanNB,ImuraT,etal.GFAPexpre-ssingprogenitorsaretheprincipalsourceofconstitutiveneurogenesisinadultmouseforebrain[J].NatNeurosci, 2004, 7(11): 1233-1241

[12]姜春玲,黃敏,安曉飛,等.紅藻氨酸癲癇大鼠海馬GFAP基因調控蛋白表達的變化[J]. 中國應用生理學雜志, 2001, 17(4): 360-362

[13]何繪敏,路晴, 孫香梅, 等. 左乙拉西坦對幼年癲癇大鼠空間學習記憶及海馬膠質原纖維酸性蛋白的影響[J]. 兒科藥學雜志, 2011, 17(4): 9-12

[14]BergerM,GrayJA,RothBL.Theexpandedbiologyofserotonin.Annual[J].ReviewofMedicine, 2009, 60: 355-366

[15]BergKA,HarveyJA,SpampinatoU,etal.Physiologicalandtherapeuticrelevanceofconstitutiveactivityof5-HT2Aand5-HT2Creceptorsforthetreatmentofdepression[J].ProgBrainRes, 2008, 172: 287-305

黑龍江省衛(wèi)生廳科研課題，編號：2013-230。

聶磊(1977～)男，黑龍江佳木斯人，碩士，主治醫(yī)師。

鄒艷紅(1978～)女，黑龍江佳木斯人，碩士，主治醫(yī)師。E-mail：zyh19784120@163.com。

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1008-0104(2015)02-0026-03

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