腎病綜合征大鼠血清IL-4和IL-12的動(dòng)態(tài)變化及其意義①

李 麗，王長山，康曉明，王顯鶴，孟慶云

(1.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154003；2.佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007)

腎病綜合征大鼠血清IL-4和IL-12的動(dòng)態(tài)變化及其意義①

李 麗1，王長山2，康曉明1，王顯鶴1，孟慶云1

(1.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154003；2.佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007)

目的：本實(shí)驗(yàn)通過微小病變型腎病綜合征模型(MCNS)，觀察血清IL-4、IL-12的動(dòng)態(tài)變化，探討MCNS的免疫學(xué)發(fā)病機(jī)制。方法：將40只大鼠隨機(jī)分為正常組、腎病組，每組20只。阿霉素5mg/kg制MCNS模型。觀察大鼠一般情況，檢測24h尿蛋白、血清白蛋白和總膽固醇水平，用ELISA檢測血清IL-4、IL-12的水平。結(jié)果：與正常組比較，腎病組出現(xiàn)大量的蛋白尿，低白蛋白血癥，高膽固醇血癥和明顯的水腫，血清IL-4升高，IL-12降低。結(jié)論：①M(fèi)CNS存在TH1/TH2功能紊亂，IL-4、IL-12參與了MCNS的免疫機(jī)制。

大鼠；微小病變型腎病綜合征；IL-4；IL-12

腎病綜合征(Nephrotic Syndrome，NS)是小兒時(shí)期常見疾病之一，其病因和發(fā)病機(jī)制雖然大量進(jìn)行研究，迄今尚未闡明。研究腎臟疾病中TH1與TH2的平衡，在于更深入理解疾病免疫發(fā)病機(jī)制。近年來，細(xì)胞因子與腎臟疾病關(guān)系的研究一直是令人關(guān)注的研究領(lǐng)域，IL-4作為TH2細(xì)胞因子，IL-12作為TH1細(xì)胞因子，其在腎臟疾病的發(fā)病機(jī)制也引起了國內(nèi)外學(xué)者的興趣，尤其在微小病變型腎病綜合征中[1，2]。研究表明，MCNS與T細(xì)胞免疫功能紊亂有關(guān)[3]，細(xì)胞免疫在NS發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著重要的作用[4，5]。本實(shí)驗(yàn)通過微小病變型腎病綜合征模型(MCNS)，觀察血清IL-4、IL-12的動(dòng)態(tài)變化，探討NS免疫學(xué)發(fā)病機(jī)制，為NS的治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

阿霉素(購于浙江海正藥業(yè)股份有限公司)； ELISA試劑盒(IL-4和IL-12，USA生產(chǎn)，購于大連泛邦技術(shù)開發(fā)有限公司)；考馬斯亮藍(lán)(購于南京建城公司)。其它：生理鹽水、乙醇、注射用水、龍膽紫、雙蒸水等。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

6周齡雄性清潔級(jí)Wistar大鼠40只，體重(120±20)g，兩次尿蛋白定性試驗(yàn)陰性，由佳木斯大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，在實(shí)驗(yàn)過程中大鼠被飼養(yǎng)在12h白天，12h黑夜，溫度21～22℃，濕度50%～70%的標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境中，均自由食用動(dòng)物中心提供的飼料和自來水。分組40只大鼠隨機(jī)分為二組，即正常組20只、腎病組20只。

1.2.2 阿霉素大鼠模型制作

在臨用時(shí)將注射用阿霉素用生理鹽水稀釋2mg/mL溶液。大鼠固定，一次性尾靜脈注射阿霉素5mg/kg。對(duì)照組同種方法注射5mg/kg生理鹽水。

1.2.3 標(biāo)本留取

各組大鼠在1周、2周、4周時(shí)將置于代謝籠中，留取24h尿液；乙醚實(shí)施麻醉下于2周、4周采血，分離血清，-20℃冰箱保存；4周時(shí)取腎組織，行HE染色。

1.2.4 觀察指標(biāo)及檢測方法

動(dòng)態(tài)觀察大鼠情況：記錄飲水量、尿量和體重情況，精神狀態(tài)、毛發(fā)及色澤、水腫和大鼠活動(dòng)情況。

24h尿蛋白的檢測：采用721分光度計(jì)，將24h尿液，利用BBC即考馬斯亮藍(lán)法，進(jìn)行檢測。

血生化檢測：血清白蛋白和總膽固醇采用全自動(dòng)生化分析儀一次性進(jìn)行檢測。

白細(xì)胞介素IL-4、IL-12和的測定：嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作。具體步驟：試劑盒置于室溫，取出反應(yīng)板；分別加入20μL標(biāo)準(zhǔn)品和血清，每孔放入100μL抗大鼠IL-4Biotin或抗大鼠IL-12Biotin，混勻，封板孔，室溫放置半小時(shí)；洗板，洗滌5次；加入每孔150μL抗大鼠IL-4POD或抗大鼠IL-12POD，混勻，封板，室溫半小時(shí)。洗板，加入每孔100μL顯色液，混勻，室溫溫育20min。加入終止液，混勻；半小時(shí)內(nèi)在450nm處讀OD值，繪標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)血清樣品的OD只可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其濃度。

腎臟形態(tài)學(xué)檢查：外觀觀察和光鏡下觀察：將腎臟取出后觀察外觀情況以及HE染色后光鏡下進(jìn)行觀察。HE染色如下：恒溫箱60℃連續(xù)烤片1h,常規(guī)脫蠟至水。蘇木素染色10min,0.5%鹽酸酒精分化10～30′，流水藍(lán)化10min。伊紅染色5min，自來水沖洗2min。梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般狀況觀察

對(duì)照組大鼠活動(dòng)自如，正常進(jìn)食，飲水量和尿量無減少，無水腫，毛色光澤。

腎病組4～5d部分大鼠出現(xiàn)輕度腹瀉，倦縮供背，活動(dòng)減少；腎病組2周后大鼠被毛蓬松，失去光澤，精神煩躁，陰囊及顏面水腫，飲水及進(jìn)食量略減少；腎病組大鼠4周后活動(dòng)遲緩，進(jìn)食及飲水量明顯減少，被毛無光澤，尿量減少，足部及陰囊水腫明顯，多只出現(xiàn)腹水。

2.2 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)24h尿蛋白動(dòng)態(tài)變化

注射阿霉素后1周末，腎病組大鼠出現(xiàn)蛋白尿，以后持續(xù)加重，至第4周達(dá)高峰。與正常組比較，腎病組尿蛋白高于正常組，差別有顯著性(P<0.01)，見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)大鼠24h尿蛋白定量

※※與正常組比較P<0.01。

2.3 各組大鼠血清生化指標(biāo)動(dòng)態(tài)變化

與正常組比較，腎病組各時(shí)間點(diǎn)血清白蛋白均低于正常組，差別有顯著性(P<0．01)；腎病組各時(shí)間點(diǎn)血清總膽固醇均高于正常組，差別有顯著性(P<0．01)，見表2。

表2 各組大鼠血清白蛋白和血清總膽固醇的變化±s)

※※與正常組比較P<0.01。

2.4 各組大鼠血清IL-4與IL-12的動(dòng)態(tài)變化

與正常組比較，腎病組血清IL-4水平各期均明顯高于正常組，差別有顯著性(P<0．01)。與正常組比較，腎病組血清IL-12低于正常組，差別有顯著性(P<0．01)，見表3。

表3 各組大鼠血清IL-4和IL-12的含量變化

※※與正常組比較P<0.01。

2.5 形態(tài)學(xué)觀察

肉眼觀察：正常組腎臟紅潤無腹水，腎病組腎臟較正常組腫大，包膜緊張，顏色淡而少光澤，部分腹腔內(nèi)有積液。

光鏡觀察：正常組腎小球結(jié)構(gòu)正常，毛細(xì)血管無淤血，腎小管腔內(nèi)未見管型；腎病組可見腎小球毛細(xì)血管淤血，腎小管腔內(nèi)有大量均勻紅染的蛋白管型；如圖1。

正常組(×400) 腎病組(×400)

3 討論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，腎病組大鼠血清IL-4明顯高于正常組，且隨著病情進(jìn)展而呈持續(xù)升高，這說明TH2型細(xì)胞占優(yōu)勢，這與周發(fā)為等[7]人的報(bào)道結(jié)果一致，TH2型細(xì)胞增多，促進(jìn)了IL-4的產(chǎn)生，從而促進(jìn)了TH0細(xì)胞向TH2細(xì)胞轉(zhuǎn)化，抑制向TH1細(xì)胞轉(zhuǎn)化。IL-4的增高同尿蛋白增高呈一致性。這與范興忠等人[8]的結(jié)果相符。腎病大鼠血清IL-12低于正常組，且在阿霉素注射2周末明顯降低，而4周末為最低，這說明TH1型細(xì)胞減少，使之分泌IL-12降低，由于IL-12不足對(duì)TH1的支持減弱，而IL-4水平增高，誘導(dǎo)TH2功能，最終導(dǎo)致了TH1/TH2細(xì)胞功能失衡。因此，我們認(rèn)為TH1/TH2細(xì)胞免疫功能失衡在微小病變型腎病綜合征中發(fā)揮著重要作用，而IL-4、IL-12參與了微小病變型腎病綜合征的免疫發(fā)病機(jī)制。

[1]李麗，王長山，孟慶云，等. 卡介菌多糖核酸對(duì)腎病大鼠血清IL-4和IL-12的影響[J]. 黑龍江醫(yī)藥科學(xué)，2012，35(2):31-33

[2]IkeuchiY,KobayashiY,ArakawaH,etal.Polymorphismsininterleukin-4-relatedgenesinpatientswithminimalchangenephroticsyndrome[J].PediatrNephrol，2009，24(3):489-495

[3]MiyazakiK,MiyazawaT,SugimotoK,etal.Anadolescentwithmarkedhyperimmuno-globulinemiaEshowingminimalchangenephroticsyndromeandaSTAT3genemutation[J].ClinNephrol，2011，75(4):369-373

[4]HuGH,YiZW,WangJH,etal.EffectoftriptergiumwilfordiipolyglycosidiumoncontentofTh1andTh2inchildrecurrentnephroticsyndrome[J].ZhongguoZhongYaoZaZhi，2008，33(4):441-443

[5]LeBerreL,HervéC,BuzelinF,etal.RenalmacrophageactivationandTh2polarizationprecedesthedevelopmentofnephroticsyndromeinBuffalo/Mnarats[J].KidneyInt，2005，68(5):2079-2090

[6]江曉東，陳惠曉.TH細(xì)胞的分化調(diào)控[J].國外醫(yī)學(xué)免疫學(xué)分冊(cè)，2003，26(2)：79-82

[7]周發(fā)為， 游文忠， 覃仕鋒，等. 小兒激素敏感型腎病綜合征血清中IL-4、IL-5、TGF-β與IL-10水平變化及意義[J].中國免疫學(xué)雜志，2014，30(5)：673-676

[8]范興忠，李宏，劉文峰，等.腎病綜合征患者血清IL-4和IL-10水平的變化及意義[J].免疫學(xué)雜志，2010，26(1)：56-57

Dynamic changes and significance of serum levels of IL-4 AND IL-12 in rats of nephrotic syndrome

LILi1,WANGChang-shan2,KANGXiao-ming1,WANGXian-he1,MENGQing-yun1

(1.The First Affiliated Hospital of Jiamusi University, Jiamusi 154003, China; 2.College of Basic Medical Sciences of Jiamusi University, Jiamusi 154007, China)

Objective: To observe developing changes of serum value IL-12, IL-4 in rats by using minimal change nephrotic syndrome (MCNS); and to discuss MCNS immunopathogenesis.Methods: Forty wistar rats were randomly divided into normal group, nephritic group with 20 rats in each group. MCN models were induced by adriamycin at a dose of 5mg/kg. Each group’s normal conditions were observed. 24h urinary protein, serum albumin and serum total cholesterone were measured. IL-4, IL-12 serum level were measured with ELISA Results: there were quantitative proteinuria, hyperlipidemia, hypoalbuminemia and evidence edema in nephritic group compared with normal group. the serum il-4 level was higher, but serum IL-12 level was lower in nephritic group than those in normal group. Conclusion: Th1/Th2 functional imbalance exists in patients with MCNS. IL-4 and IL-12 are involved in the immunologic mechanisms.

rat; minimal-change nephrotic syndrome; Interleukin-4; Interleukin-12

黑龍江省青年科學(xué)基金項(xiàng)目，編號(hào)：QC2012C119；黑龍江省衛(wèi)生廳科研項(xiàng)目，編號(hào)：2012-198；佳木斯大學(xué)科學(xué)技術(shù)重點(diǎn)項(xiàng)目，編號(hào)：Sjz 2014-011。

李麗(1979～)女，黑龍江佳木斯人，博士，副教授，副主任醫(yī)師，碩士研究生導(dǎo)師。

王長山(1977～)男，黑龍江佳木斯人，博士，副教授，碩士研究生導(dǎo)師。E-mail: wcs0451@163.com。

R692

A

1008-0104(2015)02-0012-03

2014-09-05)