聚-γ-谷氨酸固體發(fā)酵基質(zhì)及工藝參數(shù)優(yōu)化

李文杰， 王 杰， 王鵬舉， 趙曉行， 吳 坤

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河南 鄭州 450002)

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聚-γ-谷氨酸固體發(fā)酵基質(zhì)及工藝參數(shù)優(yōu)化

李文杰， 王 杰， 王鵬舉， 趙曉行， 吳 坤

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河南 鄭州 450002)

以不同的聚谷氨酸固體發(fā)酵基質(zhì)為研究對(duì)象，通過對(duì)其進(jìn)行最優(yōu)搭配，優(yōu)化發(fā)酵條件，提高聚谷氨酸的產(chǎn)量，降低固體發(fā)酵成本。其中以黃豆粉為主要發(fā)酵基質(zhì)的聚谷氨酸產(chǎn)量最高，以麩皮和秸稈為輔料基質(zhì)均能大大提高聚谷氨酸的產(chǎn)量，分別為132.24 g·kg-1和145.79 g·kg-1，秸稈的效果更佳，因此選擇秸稈為輔料基質(zhì)進(jìn)行發(fā)酵條件優(yōu)化。最終確定發(fā)酵條件為：初始pH值7.0～7.5，含水率60%，溫度37 ℃，發(fā)酵周期64 h。

固體發(fā)酵；解淀粉芽孢桿菌；聚谷氨酸；黃豆粉；秸稈；麩皮

聚-γ-谷氨酸(poly-γ-glutamic acid，γ-PGA)是D-谷氨酸和L-谷氨酸單體通過a-氨基和γ-羧基間的酰胺鍵組合而成的陰離子型多聚氨基酸。相對(duì)分子量在10～100萬[1]。γ-PGA具有良好的生物相容性以及生物可降解性，修飾后可作為藥物載體甚至與藥物直接結(jié)合，增強(qiáng)藥物緩釋性、靶向性。在農(nóng)業(yè)應(yīng)用方面，γ-PGA是良好的保水劑和農(nóng)藥、肥料緩釋劑，另外有研究證明γ-PGA可以提高綠色植物對(duì)光能的利用率[2,3]。因此在注重環(huán)保，強(qiáng)調(diào)可持續(xù)發(fā)展的今天，γ-PGA及其衍生物在醫(yī)療、農(nóng)業(yè)、環(huán)境保護(hù)等諸多領(lǐng)域具有廣泛的發(fā)展應(yīng)用前景[4]。關(guān)于聚谷氨酸的生產(chǎn)報(bào)道以液體發(fā)酵居多，然而液體發(fā)酵在大規(guī)模生產(chǎn)過程中存在諸多問題，如溶氧率以及泡沫過剩引起溢料和染菌等。特別是發(fā)酵中后期因?yàn)轲ざ仍龃?，發(fā)酵液的溶氧、傳熱以及傳質(zhì)等迅速降低，嚴(yán)重影響發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)量[5,6]。而固體發(fā)酵相比于液體發(fā)酵，在工藝設(shè)備以及發(fā)酵環(huán)境上要求都低很多。固體發(fā)酵過程中動(dòng)力能耗少，成本低，而且聚谷氨酸的得率很高[4,7]。此外，固體發(fā)酵易于貯藏及運(yùn)輸，在農(nóng)業(yè)級(jí)聚谷氨酸生產(chǎn)中更有優(yōu)勢(shì)。本研究以解淀粉芽孢桿菌的1株誘變菌株為菌種，以不同底物與輔料基質(zhì)為研究對(duì)象，確定最佳的底物和輔料以及輔料比例，從而提高固體發(fā)酵聚谷氨酸的產(chǎn)率。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 設(shè)備和試劑 微型植物粉碎機(jī)，Kjeltec 2300自動(dòng)定氮儀,丹麥FOSS公司；ETHOSE微波消解器，美國CEM公司； ALPHAI-4LD-PLUS真空冷凍干燥機(jī)，德國CHRIST公司；2695 XE高效液相色譜儀,美國Waters公司；黃豆和豆粕購自某豆油廠；麩皮購自面粉廠；秸稈購自飼料加工廠；胰蛋白胨粉、酵母浸粉、氯化鈉、無水乙醇、結(jié)晶乙酸鈉均為分析純。乙腈、正己烷為色譜純。谷氨酸標(biāo)品購自Alfa Aesar公司，聚谷氨酸標(biāo)品購自臺(tái)灣。

1.1.2 供試菌株 解淀粉芽孢桿菌YP-B-2 (B.amyloliquefaciensYP-B-2)，河南農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室篩選、鑒定和保存。

1.1.3 培養(yǎng)基 菌種保存培養(yǎng)基:胰蛋白胨粉 10 g·L-1，酵母浸粉 5 g·L-1，氯化鈉10 g·L-1，瓊脂粉18 g·L-1。種子培養(yǎng)基:胰蛋白胨粉 10 g·L-1，酵母浸粉 5 g·L-1，氯化鈉10 g·L-1。

以上培養(yǎng)基均用蒸餾水配置，pH值調(diào)節(jié)為7.0～7.5，121 ℃高壓滅菌20 min。

固體基礎(chǔ)培養(yǎng)基:黃豆粉1 000 g，KH2PO41 g，MgSO4·7H2O 1 g，MnSO4·H2O 0.2 g，CaCl20.3 g,蒸餾水1 000 mL，調(diào)節(jié)pH值為7.0，121 ℃高壓滅菌30 min。

1.2 方法

1.2.1 基質(zhì)預(yù)處理 用微型植物粉碎機(jī)將黃豆與豆粕粉碎(篩孔為1 mm)，將玉米秸稈粉碎至顆粒規(guī)格約為1 mm×10 mm。采用自動(dòng)定氮儀測(cè)得黃豆與豆粕中蛋白質(zhì)的含量。

1.2.2 菌種培養(yǎng) 將保存在4 ℃條件下的試管菌種挑取一環(huán)轉(zhuǎn)接入菌種培養(yǎng)基(100 mL·瓶-1)，37 ℃，180 r·min-1培養(yǎng)12 h。

1.2.3 固體發(fā)酵基質(zhì)成分的優(yōu)化 固體基礎(chǔ)培養(yǎng)基中黃豆粉分別替換為豆粕、m(豆粕)∶m(甘油)=4∶1、m(黃豆粉)∶m(豆粕)=1∶1 4種搭配充當(dāng)主要發(fā)酵底物，其它條件一致。以500 mL三角瓶為反應(yīng)器，每瓶中添加發(fā)酵底物20 g，每組試驗(yàn)設(shè)3個(gè)平行。將培養(yǎng)好的種子液按8%的接種量轉(zhuǎn)接入固體培養(yǎng)基，充分混勻后封口放入恒溫培養(yǎng)箱，37 ℃培養(yǎng)3 d，發(fā)酵完畢后測(cè)定聚谷氨酸的產(chǎn)率。

1.2.4 輔料以及添加最佳比例選擇 分別設(shè)定發(fā)酵基質(zhì)中黃豆粉與麩皮(9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5)黃豆粉與玉米秸稈(20∶1、20∶2、20∶3、20∶4、20∶5)的不同比例，接種后37 ℃恒溫培養(yǎng)3 d，測(cè)定聚谷氨酸的產(chǎn)率，分別確定在發(fā)酵底物中麩皮和秸稈的最佳量。

1.2.5 固體發(fā)酵條件優(yōu)化 以玉米秸稈為輔料，選擇發(fā)酵條件含水率(50%、55%、60%、65%、70%)，初始pH值(5、6、6.5、7、7.5、8、9)，溫度(27、31、34、37、40、44 ℃)進(jìn)行單因素試驗(yàn)，篩選出最佳發(fā)酵條件。

1.2.6 提取與純化 在發(fā)酵結(jié)束的三角瓶中加入定量的蒸餾水，攪拌均勻后放入180 r·min-1搖床內(nèi)持續(xù)震蕩2 h，用紗布過濾提取2～3次，然后合并提取液，6 000 r·min-1離心30 min，取一定量的上清液加4倍體積冷卻無水乙醇，低溫過夜沉淀。-80 ℃冷凍干燥后得到聚谷氨酸粗制品。將粗制品溶入一定量的蒸餾水中，再次乙醇沉淀干燥可得純度更高的聚谷氨酸[8]。

1.2.7 聚谷氨酸含量測(cè)定 采用HPLC氨基酸柱前衍生測(cè)定聚谷氨酸含量。

1.2.7.1 提取物水解:精確稱取提取物50 mg到水解管中,并注入濃度為6 mol·L-1的鹽酸10 mL 酒精噴燈封口，110 ℃水解24 h，冷卻后用6 mol·L-1的NaOH溶液調(diào)pH值至9.0后移至50 mL容量瓶中。用超純水洗滌3次，定容，過濾后取濾液進(jìn)行柱前衍生后，用反相高效液相色譜法分析L-谷氨酸含量。

1.2.7.2 柱前衍生:精確量取L-谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)液400 μL于離心管中，分別加入稀釋后的衍生劑A液和B液各200 μL后混勻，在50 ℃水浴鍋中加熱45 min后取出，冷卻至室溫后加入400 μL正己烷混勻，并用孔徑為0.45 μm有機(jī)膜過濾，放置30 min后取澄清的下層液進(jìn)行高效液相色譜分析。樣品與標(biāo)準(zhǔn)品衍生方法相同。

1.2.7.3 色譜條件為色譜柱：Ultimate Amino acid，5 μm，4.6×250 mm；流動(dòng)相A∶V(0.1 mol·L-1醋酸鈉溶液pH值6.5)∶V(乙腈)=93∶7，流動(dòng)相B∶V(水)∶V(乙腈)=20∶80，流動(dòng)相梯度洗脫程序見表1。柱溫：37 ℃，流速：1 mL·min-1，檢測(cè)波長：254 nm，進(jìn)樣量：5 μL。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program

2 結(jié)果與分析

2.1 固體發(fā)酵基質(zhì)成分與輔料配比的選擇

2.1.1 固體發(fā)酵基質(zhì)成分的選擇 利用自動(dòng)定氮儀測(cè)得黃豆與豆粕中蛋白質(zhì)含量分別為374.9 mg·g-1和433.7 mg·g-1。將黃豆粉碎可以大大增加微生物與發(fā)酵基質(zhì)的接觸面積，從而使發(fā)酵基質(zhì)得到更充分的利用。豆粕為大豆提取豆油后的一種副產(chǎn)品，因此在試驗(yàn)中設(shè)計(jì)添加一定比例的甘油作為補(bǔ)償碳源，結(jié)果如表2所示。用黃豆粉單獨(dú)充當(dāng)發(fā)酵基質(zhì)所得聚谷氨酸粗品的純度以及最終產(chǎn)量均優(yōu)于豆粕、豆粕∶甘油以及豆粕∶黃豆粉，因此選擇黃豆粉為最佳發(fā)酵底物。

2.1.2 輔料以及添加最佳比例選擇 粉狀基質(zhì)與水混合后極易結(jié)塊，顆粒間空隙率降低。聚谷氨酸產(chǎn)生菌為好氧微生物，適量添加起疏松作用的輔料可以增加固體基質(zhì)的透氣性，從而提高微生物代謝能力，提高代謝物的產(chǎn)量[9]。麩皮與秸稈是固態(tài)發(fā)酵中常用的基質(zhì)，透氣性好且成本較低，是一種理想的發(fā)酵基質(zhì)。由圖1-A、圖1-B可知，隨著麩皮和秸稈添加比例增大，聚谷氨酸的產(chǎn)量也增加。當(dāng)豆粉與麩皮比例為7∶3時(shí)，聚谷氨酸產(chǎn)量為132.24 g·kg-1。而隨著麩皮添加比例繼續(xù)增大，聚谷氨酸的產(chǎn)量反而下降，因此，黃豆粉與麩皮最佳比例為7∶3。當(dāng)黃豆粉與秸稈比例為20∶3時(shí)，聚谷氨酸產(chǎn)量最高，隨著秸稈量的增加，聚谷氨酸的產(chǎn)量并沒有隨之增多，因此20∶3為黃豆粉與秸稈的最佳比例，此時(shí)聚谷氨酸的產(chǎn)量為145.79 g·kg-1。

表2 不同基質(zhì)對(duì)γ-PGA產(chǎn)量的影響Table 2 Effect of different substrates on γ-PGA production

WP:黃豆粉，WB:麩皮，WS:秸稈。

2.2 固體發(fā)酵條件對(duì)聚谷氨酸產(chǎn)量的影響

2.2.1 初始含水率的優(yōu)化 水分是微生物代謝過程中很大的影響因素之一。過低的含水率會(huì)嚴(yán)重影響菌體的生長繁殖,甚至引起微生物菌體休眠，而過高的含水率則會(huì)影響固體發(fā)酵基質(zhì)的透氣性，影響微生物菌體對(duì)氧氣的利用[10]。秸稈吸水性很強(qiáng)，因此選擇含水率為50%、55%、60%、65%、70%進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果如圖2所示。從圖2可以看出，含水率過高或過低都會(huì)影響聚谷氨酸的產(chǎn)量，最佳含水率為60%。

2.2.2 初始pH值的優(yōu)化 pH值決定了發(fā)酵基質(zhì)中各物質(zhì)的離子化程度，從而影響微生物對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和利用。前期試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)解淀粉芽孢桿菌YP-B-2在過酸或過堿的條件下均不能生長。故試驗(yàn)選擇初始pH值為(5、6、6.5、7、7.5、8、9)進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，結(jié)果如圖3所示。從圖3可以看出，初始pH值為7～8時(shí)，聚谷氨酸的產(chǎn)量均較高，因此選擇初始pH值為7～7.5。

圖2 含水率對(duì)γ-PGA產(chǎn)量的影響Fig.2 Effect of moisture content on γ-PGA production

圖3 初始pH值對(duì)γ-PGA產(chǎn)量的影響Fig.3 Effect of pH value on γ-PGA production

2.2.3 培養(yǎng)溫度與周期的優(yōu)化 微生物的一系列生化反應(yīng)需要多種酶的催化才能完成，而溫度是影響酶的催化速率的一個(gè)重要因素。從圖4可以看出,溫度為27 ℃時(shí)，聚谷氨酸產(chǎn)生的速率特別緩慢，而發(fā)酵溫度為44 ℃時(shí)，聚谷氨酸產(chǎn)生的速率前期相對(duì)較快，48 h時(shí)產(chǎn)量達(dá)到最高，但遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于其它溫度條件下的終產(chǎn)量，隨著時(shí)間推移產(chǎn)量急劇下降。發(fā)酵過程中隨著溫度升高γ-PGA最高產(chǎn)量持續(xù)增加，當(dāng)溫度為37 ℃時(shí)γ-PGA產(chǎn)量達(dá)到最高，為146.37 g·kg-1。隨著溫度繼續(xù)的升高γ-PGA的產(chǎn)量明顯下降，因此選擇37 ℃為最佳發(fā)酵溫度，發(fā)酵周期時(shí)間為64 h。

圖4 溫度與周期對(duì)γ-PGA產(chǎn)量的影響Fig.4 Effect of temperature and period on γ-PGA production

3 結(jié)論與討論

本研究針對(duì)聚谷氨酸固體發(fā)酵培養(yǎng)基質(zhì)問題，選擇不同的發(fā)酵基質(zhì)為研究對(duì)象，通過對(duì)其進(jìn)行最優(yōu)搭配，優(yōu)化發(fā)酵條件，提高聚谷氨酸的產(chǎn)量，降低固體發(fā)酵成本。相對(duì)于液體深層發(fā)酵，固體發(fā)酵工藝可控性較差，因此優(yōu)化固體發(fā)酵工藝、降低成本、提高產(chǎn)品得率應(yīng)該主要從發(fā)酵原料方面著手[11]。本研究選擇黃豆粉和豆粕為發(fā)酵基質(zhì)，試驗(yàn)結(jié)果表明，即使在豆粕中添加甘油充當(dāng)碳源，以豆粕為發(fā)酵基質(zhì)所得產(chǎn)物得率也遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于黃豆粉。因此選擇黃豆粉為最佳發(fā)酵底物。解淀粉芽孢桿菌YP-B-2為好氧細(xì)菌，純豆粉與水混合后極易結(jié)塊，因缺乏氧氣只有表面的發(fā)酵基質(zhì)能夠正常生長代謝。如果能選擇合適的輔料，增加發(fā)酵過程中基質(zhì)的透氣性，不僅使微生物可以快速生長繁殖代謝，發(fā)酵底物可以得到充分利用，而且可以省去發(fā)酵過程中翻曲通氣的人力和物力。麩皮和秸稈為常見的固體發(fā)酵基質(zhì)，它們不僅可以增加發(fā)酵基質(zhì)的透氣性，而且可以充當(dāng)一部分發(fā)酵基質(zhì)[9]。本研究選擇麩皮和秸稈2種輔料進(jìn)行固體發(fā)酵，試驗(yàn)結(jié)果顯示，麩皮和秸稈均能顯著提高聚谷氨酸的產(chǎn)量，而從物理性質(zhì)以及成本上來評(píng)估，秸稈支撐的反應(yīng)結(jié)構(gòu)透氣性更好、成本更低。

水分作為發(fā)酵原料的另一大組成成分，也是影響微生物代謝效率的重要因素，所有的生化反應(yīng)都是在水環(huán)境(或稱水溶液)中進(jìn)行。在聚谷氨酸固體發(fā)酵過程中，水分含量過低則會(huì)嚴(yán)重阻遏微生物的生理代謝反應(yīng)，如果水分含量過高，隨著基質(zhì)中聚谷氨酸的含量增加，粘度也迅速增加，基質(zhì)透氣性也會(huì)大大減弱[12]，而且發(fā)酵基質(zhì)濕度過高還會(huì)使基質(zhì)易染雜菌，影響產(chǎn)量，因此選擇合適的含水量也是保證發(fā)酵產(chǎn)品穩(wěn)定的一個(gè)重要因素。微生物代謝環(huán)境的pH值同樣會(huì)直接影響微生物的代謝反應(yīng)，發(fā)酵基質(zhì)的酸堿性決定了底物的離子化程度，從而影響微生物細(xì)胞對(duì)各營養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用。發(fā)酵過程中pH值較難控制，固體基質(zhì)的特性對(duì)基質(zhì)的酸堿性具有一定的緩沖作用，因此只需控制固體基質(zhì)初始pH值即可[13,14]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，最終選擇固體發(fā)酵基質(zhì)最優(yōu)搭配為黃豆粉∶秸稈為20∶3、含水率60%、最佳pH值7～7.5、發(fā)酵溫度37 ℃、發(fā)酵周期64 h。

[1] 黃 金，陳 寧.γ-聚谷氨酸的性質(zhì)與生產(chǎn)方法[J]. 氨基酸和生物資源,2004，26(4)：44-48.

[2] 游慶紅, 張新民，陳國廣, 等. γ-聚谷氨酸的生物合成及應(yīng)用[J]. 現(xiàn)代化工，2002,22(12): 56-59.

[3] 孫剛忠，譚啟靈，胡承孝，等. 聚-γ-谷氨酸對(duì)小白菜生長和光合作用的影響[J]. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2012,12(3):216-219.

[4] 蔣洪梅, 武明月, 徐 良, 等. 產(chǎn)γ-PGA菌種選育及固態(tài)培養(yǎng)條件優(yōu)化[J]. 釀酒，2012,39(1): 94-98.

[5] 王鐵男, 韓建春. 響應(yīng)面法優(yōu)化固態(tài)生產(chǎn)γ-多聚谷氨酸[J]. 食品工業(yè)科技, 2008,29(3): 178-179.

[6] 張 寧, 曠 馳. 利用豆粕發(fā)酵生產(chǎn)聚谷氨酸的研究[J]. 現(xiàn)代食品科技, 2008,24(2): 113-114.

[7] 劉 靜, 程顯好, 劉 偉, 等. 固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)聚谷氨酸培養(yǎng)條件的優(yōu)化[J]. 食品與藥品, 2011,13(3): 85-89.

[8] BAJAJ I B, LELE S S, Singhal R S. Enhanced production of poly (γ-glutamic acid) fromBacilluslicheniformisNCIM 2324 in solid state fermentation[J]. J Ind Microbiol Biotechnol, 2008, 35(12):1581-1586.

[9] 吳永平. 枯草芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)聚-γ-谷氨酸的工藝優(yōu)化[D]. 武漢:華中農(nóng)業(yè)大學(xué), 2006.

[10]XU J, CHEN SH W, YU Z N, et al. Optimization of process parameters for poly γ-glutamate production under solid state fermentation fromBacillussubtilisCCTCC202048[J]. Process Biochemistry,2005,40(9):3075-3081.

[11]王立波，常金良. 豆粕發(fā)酵過程參數(shù)與檢測(cè)方法的建立[J]. 飼料廣角, 2010(9): 22-25.

[12]ADINARAYANA K, PRABHAKAR T, SRINIVASULU V, et al. Optimization of process parameters for cephalosporin C production under solid state fermentation fromAcremoniumchrysogenum[J]. Proc Biochem, 2003,39(2):171-177.

[13]楊 革, 劉 艷, 李桂芝. 溶氧及pH對(duì)地衣芽孢桿菌合成聚γ-谷氨酸的影響[J]. 應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào), 2006,12(6): 850-853.

[14]趙天濤, 張麗杰, 鄧郁平,等. 固體發(fā)酵及原生態(tài)優(yōu)化技術(shù)進(jìn)展[J]. 重慶理工大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版, 2010,24(10): 93-96.

(責(zé)任編輯：朱秀英)

Optimization of substrates and process parameters for Poly-γ-glutamic acid solid-state fermentation

LI Wenjie， WANG Jie， WANG Pengju， ZHAO Xiaohang， WU Kun

(College of Life Sciences，Henan Agricultral University，Zhengzhou 450002，China)

Different dosages of fermentation matrix were investigated to obtain the optimal collocation. Through the optimization of solid-state fermentation conditions, the product of poly-γ-glutamic acid was improved and the cost of solid fermentation was reduced. When using soybean powder as the main fermentation substrate it had the highest yield of poly-γ-glutamic acid. By adding supplementary substrate, such as bran and straw, the yield was increased to 132.24 g·kg-1and 145.79 g·kg-1, respectively. So, straw was selected as supplementary substrate to optimize the fermentation conditions. After optimizing, the fermentations condition were as follows: initial medium pH7.0～7.5, moisture content 60%, temperature 37 ℃, fermentation period 64 h.

solid-state fermentation;B.amyloliquefaciens; poly-γ-glutamic acid; soybean powder; straw;bran

2014-10-02

河南省科技攻關(guān)重點(diǎn)項(xiàng)目(122102110120)

李文杰(1989-)，女，河南新鄉(xiāng)人，碩士研究生，主要從事環(huán)境微生物方面的研究。

吳 坤(1963-)，男，河南駐馬店人，教授，博士。

1000-2340(2015)02-0239-05

Q393.11

A