歐美楊POR組培再生系統(tǒng)研究

周 洲， 李永麗， 源春彥， 安世恒， 尹新明

(1．河南科技大學(xué)林學(xué)院，河南 洛陽(yáng) 471003;2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，河南 鄭州 450002)

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歐美楊POR組培再生系統(tǒng)研究

周 洲1， 李永麗1， 源春彥1， 安世恒2， 尹新明2

(1．河南科技大學(xué)林學(xué)院，河南 洛陽(yáng) 471003;2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，河南 鄭州 450002)

以歐美楊POR(Populus×euramericana)幼嫩莖段、葉片2種外植體為材料，研究誘導(dǎo)不定芽、莖伸長(zhǎng)和生根的合適培養(yǎng)條件。結(jié)果表明，TDZ在芽誘導(dǎo)過(guò)程中有顯著的促進(jìn)作用，不定芽誘導(dǎo)最適培養(yǎng)基為MS+TDZ 0.05 mg·L-1+6-BA 0.05 mg·L-1+NAA 0.05 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1，莖段和葉片分化率分別為97.3 %和88.6 %；叢生芽的莖伸長(zhǎng)誘導(dǎo)最適培養(yǎng)基為MS+KT 0.5 mg·L-1+GA31 mg·L-1+果糖30 g·L-1，莖段和葉片來(lái)源的叢生芽的莖伸長(zhǎng)率分別為95.5%和90%，莖伸長(zhǎng)培養(yǎng)20 d，每個(gè)外植體超過(guò)3 cm的芽有3個(gè)以上。抽莖芽可直接轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基，在培養(yǎng)基1/2 MS+IBA 0.05 mg·L-1+NAA 0.05 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1中生根率可達(dá)92.2%，生根數(shù)量多，苗體健康。

歐美楊POR；離體培養(yǎng)；芽伸長(zhǎng)；生根

歐美楊POR(Populus×euramericana)屬于黑楊派，由葡萄牙選育，1995年引入中國(guó)，經(jīng)過(guò)多年栽培試驗(yàn)、示范和推廣，非常適宜中國(guó)華北中原地區(qū)種植。該品種在生長(zhǎng)速度、抗病蟲(chóng)害能力及成材質(zhì)量等方面都非常優(yōu)越，可作為營(yíng)造工業(yè)用材和造紙用材的商品林；耐旱性、耐寒性、桿形通直美觀(guān)，也是改善生態(tài)環(huán)境及營(yíng)造速生豐產(chǎn)林的的首選樹(shù)種，已被國(guó)家林業(yè)總局列為中國(guó)華北地區(qū)重點(diǎn)推廣的樹(shù)種之一[1,2]。中國(guó)的楊樹(shù)基因轉(zhuǎn)化研究已經(jīng)取得了許多成果，為了使一些成功的理論成果應(yīng)用于林業(yè)生產(chǎn)實(shí)際，對(duì)生產(chǎn)中的優(yōu)良品種進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化具有重要意義[3]。良好的組培再生系統(tǒng)是基因轉(zhuǎn)化的前提，目前已有多個(gè)楊樹(shù)品種的再生研究報(bào)道[4-13]。不同楊樹(shù)品種間組培再生條件存在較大區(qū)別，但有關(guān)POR再生的研究還未見(jiàn)報(bào)道。作者在前人研究的基礎(chǔ)上，選擇了POR的葉片和莖段2種外植體，對(duì)再生環(huán)節(jié)中的條件進(jìn)行了研究，旨在建立穩(wěn)定高效的組培再生系統(tǒng)，為POR楊的快速無(wú)性繁殖育苗和基因工程改良工作奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與培養(yǎng)條件

歐美楊POR種苗由中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院提供。組織培養(yǎng)溫度為 (25±1) ℃，光照時(shí)間為 16 h·d-1，光照度為 2 000 lx。

1.2 外植體處理

2012年5月—2012年8月，剪取POR 1 a生枝條扦插苗上新生健康嫩枝，流水沖洗2 h后置于超凈工作臺(tái)中，用體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇處理30 s，無(wú)菌水沖洗1次，再用1 g·L-1氯化汞溶液消毒3 min，最后用無(wú)菌水沖洗5次，獲得無(wú)菌外植體。莖段剪成長(zhǎng)1.5 cm左右，幼嫩葉片橫向深達(dá)主脈剪3道切口，背面向上接種在芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，每種處理接種外植體40個(gè)。

1.3 叢生芽誘導(dǎo)

以MS為基本培養(yǎng)基，附加不同質(zhì)量濃度的6-芐氨基嘌呤(6-BA)、噻苯隆(TDZ)和萘乙酸(NAA)(表1)，另加蔗糖30 g·L-1、瓊脂5 g·L-1，pH為6.0。每隔15 d在相同培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)1次，觀(guān)察愈傷和叢生芽生長(zhǎng)狀況，培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計(jì)各處理叢生芽誘導(dǎo)率。

(1)

表1 不同質(zhì)量濃度的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合對(duì)歐美楊POR叢生芽誘導(dǎo)率的影響Table 1 Effect of different hormone concentration on bud induction rate of POR

1.4 叢生芽誘導(dǎo)莖伸長(zhǎng)

選擇MS為基本培養(yǎng)基，分別添加赤霉素(GA3)、激動(dòng)素(KT),TDZ,6-BA,NAA,吲哚丁酸(IBA) 等植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)(表 2)，另附加蔗糖或果糖 30 g·L-1，瓊脂 5g·L-1， pH為6.0。培養(yǎng) 20 d 后觀(guān)察叢生芽生長(zhǎng)狀況，統(tǒng)計(jì)各處理的莖伸長(zhǎng)率和長(zhǎng)度大于3 cm芽數(shù)量，對(duì)比不同處理對(duì)莖伸長(zhǎng)的影響。

(2)

表2 不同質(zhì)量濃度的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)組合對(duì)POR叢生芽伸長(zhǎng)的影響Table 2 Effect of different hormone concentration on enlongation of adventitious buds of POR

1.5 試管苗的生根

以1/2 MS為基本培養(yǎng)基，添加NAA、IBA和吲哚乙酸(IAA)(表3)，另附加蔗糖30 g·L-1、瓊脂5g·L-1，pH為6.0. 每處理接種40瓶，20 d后統(tǒng)計(jì)各處理的生根率、每苗生根數(shù)和平均根長(zhǎng)。

表3 不同質(zhì)量濃度的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)組合對(duì)POR不定芽生根的影響Table 3 Effect of different hormone concentration on shoot rooting of POR

2 結(jié)果與分析

2.1 不同質(zhì)量濃度的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)外植體叢生芽誘導(dǎo)率的影響

在 TDZ、6-BA 和 NAA同時(shí)存在時(shí)，莖段和葉片均可直接誘導(dǎo)產(chǎn)生叢生芽，而6-BA和NAA 2者的組合也能誘導(dǎo)出叢生芽，但是誘導(dǎo)率較低 (表1)。在MS+TDZ 0.05 mg·L-1+6-BA 0.05 mg·L-1+NAA 0.05 mg·L-1的培養(yǎng)基上，莖段外植體接種5 d后，切口處發(fā)紅膨大，形成少量綠色愈傷組織，15 d 左右愈傷組織上開(kāi)始出現(xiàn)大量不定芽，叢生芽誘導(dǎo)率達(dá)97.3%；每隔15 d在原培養(yǎng)基上繼代1次，30 d后不定芽葉片長(zhǎng)度為1 cm左右，芽叢生，但沒(méi)有莖(圖1-a)。葉片主葉脈切口處10 d后可見(jiàn)形成的綠色愈傷組織，20 d后才可見(jiàn)叢生芽出現(xiàn)，叢生芽誘導(dǎo)率為88.6 %(圖1-b)。

a.莖段外植體; b.葉片外植體。

a. Stem explants; b. Leaf explants.

圖1 POR外植體的叢生芽的誘導(dǎo)
Fig.1 Adventitious buds induction on different explants fromPopulus×euramericanaPOR

2.2 不同質(zhì)量濃度的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)叢生芽莖伸長(zhǎng)的影響

本試驗(yàn)中誘導(dǎo)出的POR叢生芽，在原分化培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)，芽不會(huì)自行抽莖生長(zhǎng)；隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，叢生芽逐漸衰老黃化而死亡。叢生芽只有經(jīng)過(guò)莖伸長(zhǎng)誘導(dǎo)，才能形成有效的再生芽(圖2)。在附加 KT和GA3的MS培養(yǎng)基上，叢生芽的莖被高效地誘導(dǎo)伸長(zhǎng)生長(zhǎng)。在MS+KT 0.5 mg·L-1+GA31 mg·L-1+果糖30 g·L-1的培養(yǎng)基上抽莖生長(zhǎng)最好，莖段和葉片從生芽莖伸長(zhǎng)率分別達(dá)95.5%和90%；誘導(dǎo)第14天，統(tǒng)計(jì)高度大于3 cm芽的數(shù)量，莖段每叢芽平均有4個(gè)抽莖芽，葉片每叢生芽平均有3個(gè)抽莖芽(表2)。在MS+KT 1.0 mg·L-1+NAA 0.05 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1的培養(yǎng)基上，莖段和葉片莖伸長(zhǎng)率分別為60%和45%，同時(shí)期抽莖芽數(shù)量為2個(gè)和1個(gè)。MS+6-BA 0.2 mg·L-1+NAA 0.05 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1的培養(yǎng)基上，莖段和葉片莖伸長(zhǎng)率分別為28.6%和15%，同時(shí)期抽莖芽數(shù)量?jī)H有1個(gè)。

2.3 不同質(zhì)量濃度的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)歐美楊POR試管苗生根的影響

POR對(duì)不同的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)的生根反應(yīng)略有差別(表3)。在1/2MS + NAA 0.05 g.L-1+IBA 0.05 g·L-1培養(yǎng)基中生根最好，試管苗培養(yǎng)7 d后，莖基部長(zhǎng)出紅色根點(diǎn)，14 d生根率為92.2%，平均為4.5條根，根長(zhǎng)平均為1.8 cm，主根較粗，須根豐富(圖3-a)，經(jīng)過(guò)生根培養(yǎng) 20 d后，根系豐富，苗體健壯(圖3-b)，可以滿(mǎn)足移栽的需要。其次是1/2 MS+NAA 0.02 g·L-1+IBA 0.05 g·L-1+IAA 0.05 g·L-1培養(yǎng)基，生根率為90.3%，平均3.7條根，根長(zhǎng)平均為1.4 cm。培養(yǎng)基1/2 MS+IBA 0.02 g·L-1+IAA 0.05 g·L-1的生根效果尚可，生根率為89%，平均2.7條根，根長(zhǎng)平均 1.2 cm。

a.莖段叢生芽; b.葉片叢生芽。a.Elongation for adventitious buds from stem explants; b. Elongation for adventitious buds from leaf explants.

a.新生根系; b.生根苗。

a. New roots in medium; b. Rooting plantlet.

圖3 POR組培苗在最適培養(yǎng)基中的生根
Fig.3 Shoot rooting ofPopulus×euramericanaPOR in the optimum culture media

3 結(jié)論與討論

本研究確定了歐美楊POR莖段、葉片2種外植體再生的關(guān)鍵條件，建立的高效再生系統(tǒng)為其基因工程改良提供了基礎(chǔ)。結(jié)果表明，不定芽誘導(dǎo)最適培養(yǎng)基為MS+TDZ 0.05 mg·L-1+6-BA 0.05 mg·L-1+NAA 0.05 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1，TDZ在芽誘導(dǎo)過(guò)程中有顯著的促進(jìn)作用；叢生芽需要莖伸長(zhǎng)誘導(dǎo)的環(huán)節(jié)，最適培養(yǎng)基為MS+KT 0.5 mg·L-1+GA31 mg·L-1+果糖30 g·L-1；抽莖芽可直接轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)，生根培養(yǎng)基最適為1/2 MS+IBA 0.05 mg·L-1+NAA 0.05 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1。

有研究表明,較低質(zhì)量濃度的TDZ有利于不定芽分化，如在河北楊和新疆楊[10]，以及歐美楊‘2001’[11]再生過(guò)程中，均發(fā)現(xiàn)TDZ的質(zhì)量濃度對(duì)不定芽分化有重要影響，較低質(zhì)量濃度的TDZ有利于不定芽分化，較高質(zhì)量濃度抑制了不定芽的分化。在溫度等外界條件相同情況下，TDZ 0.05 mg·L-1,6-BA 0.05 mg·L-1和 NAA 0.05 mg·L-1共同配合，不定芽誘導(dǎo)率最高；缺少TDZ激素的組合，芽誘導(dǎo)效率較低。在POR不定芽誘導(dǎo)過(guò)程中，較低質(zhì)量濃度的TDZ存在也是一個(gè)有利條件；此外，6-BA和NAA合適質(zhì)量濃度的配合也非常關(guān)鍵。

在不同品種楊樹(shù)的組織培養(yǎng)中，在不定芽形成后，誘導(dǎo)莖伸長(zhǎng)并非必須環(huán)節(jié)。白楊派來(lái)源的楊樹(shù)可以不需要更換培養(yǎng)基，不定芽的莖和葉可進(jìn)一步伸長(zhǎng)[5,14]；而黑楊派來(lái)源的楊樹(shù)往往需要更換培養(yǎng)基，細(xì)胞分裂素含量在莖伸長(zhǎng)培養(yǎng)基中較不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中減少，從而促進(jìn)芽的莖葉的進(jìn)一步伸長(zhǎng)[6]。POR不定芽需要經(jīng)過(guò)莖伸長(zhǎng)誘導(dǎo)，這樣得到的有效芽最多。本試驗(yàn)結(jié)果表明，KT在誘導(dǎo)叢生芽莖伸長(zhǎng)過(guò)程中活性?xún)?yōu)于6-BA，GA3和果糖的配合也非常重要。一般認(rèn)為GA3對(duì)試管苗的增殖和伸長(zhǎng)有顯著效果，但GA3會(huì)抑制芽原基的分化和根原基的分化，因此須在愈傷組織已經(jīng)分化的狀態(tài)下，加入GA3促進(jìn)芽的增殖和伸長(zhǎng)[8]。張小蘋(píng)[15]也發(fā)現(xiàn)果糖對(duì)桑樹(shù)不定芽抽莖表現(xiàn)出更好的效果，原因可能是不同器官對(duì)不同碳源利用能力差異所導(dǎo)致。

有的楊樹(shù)品種不定芽長(zhǎng)成的小苗生根前太弱，從而需要壯化培養(yǎng)，提高其生根和成活率。本試驗(yàn)中的POR無(wú)需壯化便可生根。程貴蘭等[7]在中黑防楊組培中，直接將無(wú)根苗轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基中，14 d左右從無(wú)根苗基部長(zhǎng)出白色小根，20 d 后95% 的無(wú)根苗長(zhǎng)出許多1～2 cm較粗壯的根，同時(shí)苗也進(jìn)一步長(zhǎng)壯，此結(jié)果與POR特性相似。但是，對(duì)本課題組曾經(jīng)研究的‘2001’楊來(lái)說(shuō)，抽莖芽壯化培養(yǎng)對(duì)生根非常重要，分化芽經(jīng)過(guò)壯化培養(yǎng)后，葉片增大，莖增粗，生長(zhǎng)旺盛，誘導(dǎo)生根容易；如果不經(jīng)壯化培養(yǎng)，則生根困難，小苗成活率低[11]。不同楊樹(shù)品種組培生根特性差異顯著，這種差異的原因有待進(jìn)一步研究。

[1] 王維正, 劉 紅. 林木良種指南[M]. 北京:中國(guó)林業(yè)出版社, 2003.

[2] 牛正田. 黑楊派無(wú)性系苗期產(chǎn)量相關(guān)性狀的遺傳變異[D]. 北京:中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院, 2007.

[3] 盧孟柱, 胡建軍. 我國(guó)轉(zhuǎn)基因楊樹(shù)的研究及應(yīng)用現(xiàn)狀[J]. 林業(yè)科技開(kāi)發(fā), 2006, (6): 1-4.

[4] 盧善發(fā), 趙華燕, 魏建華, 等. 三倍體毛白楊組織培養(yǎng)再生系統(tǒng)的建立[J]. 植物學(xué)報(bào), 2001,43(4):435-437.

[5] 樊軍鋒, 李 玲, 韓一凡. 84K楊葉片外植體再生系統(tǒng)的建立[J]. 西北林學(xué)院學(xué)報(bào), 2002,17(2): 33-36.

[6] 金順玉, 劉桂豐, 楊傳平. 黑林1號(hào)楊的組織培養(yǎng)與植株再生[J]. 植物生理學(xué)通訊, 2003,39(6): 639.

[7] 程貴蘭, 姜 靜, 蔡智軍. 中黑防楊(美洲黑楊×青楊)的組織培養(yǎng)與植株再生[J]. 植物生理學(xué)通訊, 2004,40(5): 585.

[8] 李 昆. I-63 楊和 I-69 楊組織培養(yǎng)研究[D]. 武漢:華中農(nóng)業(yè)大學(xué), 2007.

[9] 張 蕾, 蘇曉華, 張冰玉, 等. 京2楊組培條件的優(yōu)化及再生體系建立[J]. 林業(yè)科學(xué)研究,2007,20(6): 787-793.

[10]賈小明, 樊軍鋒, 王娟娟. 河北楊和新疆楊離體葉片誘導(dǎo)不定芽研究[J]. 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào), 2006,34(12):109-115.

[11]李永麗, 周 洲, 范晶超, 等. 2001楊組培再生體系建立[J]. 西北林學(xué)院學(xué)報(bào), 2012, 27(6):83-87.

[12]FERREIRA S, BATISTA D, SERRAZINA S, et al. Morphogenesis induction and organogenic nodule differentiation inPopuluseuphraticaOliv. leaf explants[J]. Plant Cell Tissue and Organ Culture, 2009, 96(1): 35-43.

[13]KANG B G, OSBURN L, KOPSELL D, et al. Micropropagation ofPopulustrichocarpa‘Nisqually-1’: the genotype deriving the Populus reference genome[J]. Plant Cell Tissue and Organ Culture, 2009, 99(3): 251-257.

[14]ZHOU Z, WANG M J, HU J J, et al. Improve freezing tolerance in transgenic poplar by overexpressing a ω-3 fatty acid desaturase gene[J]. Molecular Breeding,2010,25(4):571-579.

[15]張小蘋(píng).桑樹(shù)莖尖培養(yǎng)中碳源,激素,水解乳蛋白的應(yīng)用[J]. 河北農(nóng)業(yè)科學(xué), 2000(1):20-23.

(責(zé)任編輯：梁保松)

Establishment of regeneration system for POR(Populus×euramericana)

ZHOU Zhou1, LI Yongli1, YUAN Chunyan1, AN Shiheng2, YIN Xinming2

(1.College of Forestry, Henan University of Science and Technology, Luoyang 471003, China；2.College of Plant Protection, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China)

Stem and leaf developing from tender branches outdoor were cultured as the initiation explants to investigate the micropropagation of POR. The results showed that TDZ had significant promoting effect on adventitious bud induction. Cultured explants on MS + TDZ 0.05 mg·L-1+ 6-BA 0.05 mg·L-1+ NAA 0.05 mg·L-1+Sucrose 30 g·L-1was the best way of inducement and differentiation, with inducement rate 97.3% for Stem and 88.6% for leaf from outdoors. For elongation of the induced buds, the suitable culture medium was MS+KT 0.5 mg·L-1+GA3 1 mg·L-1+Fructose 30g·L-1. More than 3 shoots of about 3 cm in hight were elongated from the induced buds of stem explants after 20 days. Shoots could be rooted after elongation. The optimal subculture medium and root inducement culture medium for shoot were 1/2 MS+NAA 0.05 mg·L-1+IBA 0.05 mg·L-1+AC 3 g·L-1+Sucrose 30 g·L-1, and the rooting rate was 92.2%. The key factors affecting the growth ofPopulus×euramericanaPOR in vitro and the optimal tissue culture conditions for it were ascertained.

POR (Populus×euramericana);invitroculture ; buds elongation; rooting

1000-2340(2015)01-0052-05

2014-09-23

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(U1204324); 河南省科技攻關(guān)重點(diǎn)項(xiàng)目(132102110037)

周 洲(1978-), 男, 河南信陽(yáng)人,副教授,博士, 從事林業(yè)生物技術(shù)研究。

安世恒(1972-), 男, 河南漯河人,教授。

S 772.3

A