長(zhǎng)沙地區(qū)急性下呼吸道感染住院兒童的病毒病原學(xué)分析

劉 沁，張 兵，謝志萍，鐘禮立，曾賽珍，劉淑萍，高寒春，肖霓光，謝樂(lè)云，熊 潔，段招軍

（1. 南華大學(xué)，衡陽(yáng) 421000；2.湖南省人民醫(yī)院兒科，長(zhǎng)沙 410005；3. 中國(guó)疾病預(yù)防控制中心與病毒生物技術(shù)國(guó)家工程研究中心，北京 100052）

急性下呼吸道感染（Acute Lower Respiratory Tract Infections, ALRTI）是兒童發(fā)病和死亡的主要原因，據(jù)WHO估計(jì)，2010年全球5歲以下住院兒童中約有1190萬(wàn)為ALRTI，約26.5萬(wàn)患兒發(fā)生院內(nèi)死亡，并且99%發(fā)生在發(fā)展中國(guó)家［1］。同期在我國(guó)31.5萬(wàn)死亡兒童中肺炎所致的占17.4%［2］，呼吸道合胞病毒（respiratory syncytin virus，RSV）、鼻病毒（human rhinovirus，HRV）、流感病毒（influenza virus，IFV）、副流感病毒（parainfluenza，PIV）、腺病毒（adenovirus，ADV）等是引起兒童ALRTI的常見(jiàn)病毒病原，人偏肺病毒（human metapneumovirus，hMPV）、人博卡病毒（human bocavirus，HBoV）、人冠狀病毒 HKU1（human coronavirus HKU1，HCoV-HKU1）、人冠狀病毒NL63（human coronaviruses NL63，HCoVNL63）、腸道病毒 68型（enterovirus 68，EV68）等近年來(lái)也被認(rèn)為與之相關(guān)［3，4］。目前聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）是檢測(cè)呼吸道病毒的主要方法，而實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Real-time fluorescent polymerase chain reaction，RT-PCR）操作簡(jiǎn)單、快速、污染少，具有更強(qiáng)的臨床實(shí)用性［5］。因此，本研究運(yùn)用RT-PCR方法對(duì)湖南長(zhǎng)沙地區(qū)2013年4月至2014年3月共603例ALRTI住院患兒的鼻咽抽吸物（nasopharyngeal aspirates，NPA）進(jìn)行14種病毒檢測(cè)，結(jié)合臨床資料進(jìn)行分析，以求為本地區(qū)兒童ALRTI的防治提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 以2013年4月～2014年3月在湖南省人民醫(yī)院兒科醫(yī)學(xué)中心住院，并符合《諸福棠實(shí)用兒科學(xué)》（第七版）診斷標(biāo)準(zhǔn)的ALRTI患兒為研究對(duì)象，其中男童371例，女童232例，男女比例為1.6：1，年齡為生后19小時(shí)至13歲，中位年齡為13月。臨床診斷包括：急性支氣管炎37例、肺炎341例、毛細(xì)支氣管炎218例、支氣管哮喘合并肺部感染7例。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集、運(yùn)送及病歷資料收集 采集入院48小時(shí)內(nèi)患兒NPA，并加入與NPA等量病毒保護(hù)液，再予干冰保存轉(zhuǎn)運(yùn)至中國(guó)CDC病毒病所-80℃保存；標(biāo)本采集前征得患兒父母的知情同意和醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，患兒的臨床資料均在病歷中記錄，在其出院后通過(guò)病歷查閱獲取。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)品及探針引物的制備 14類病毒陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品由中國(guó)CDC病毒病所提供，引物及探針均通過(guò)相關(guān)參考文獻(xiàn)獲得，所用引物終濃度為20μM，探針終濃度為10μM。

1.2.3 處理標(biāo)本，提取核酸 將標(biāo)本37℃水浴解凍，旋渦震蕩至水樣，4℃ 3700r/m in離心5min，取上清200μL，采用Qiampminelute Virus Spin Kit試劑盒提取200μL樣本中病毒核酸，具體步驟見(jiàn)試劑盒說(shuō)明書。

1.2.4 病毒核酸檢測(cè) 采用One step RT-PCR Kit試劑檢測(cè)RSV、HRV、IFVA-B、PIV1-4、hMPV、EV、HKU1、NL63共12種RNA病毒，Taqman Universal Master MixⅡwith UNG試劑檢測(cè)ADV、HBoV共2種DNA病毒，實(shí)驗(yàn)結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)R2>0.99，擴(kuò)增效率Eff%在90%～110%，每個(gè)循環(huán)的最后一步結(jié)束時(shí)進(jìn)行熒光檢測(cè)，由儀器自帶軟件計(jì)算出Ct值并給出定量結(jié)果，以病毒載量≥1×100copies/μL的標(biāo)本視為陽(yáng)性。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SPSS18.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，各組間率的比較采用χ2檢驗(yàn)和連續(xù)校正χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 病毒檢出狀況分布特點(diǎn) 603份NPA標(biāo)本中，527份檢出了病毒，總檢出率為87.4%，其中RSV列居首位，其次為HRV、HBoV及PIV3，各類病毒檢出情況詳見(jiàn)表1。

表1 病毒陽(yáng)性檢出狀況（n=603）

2.2 病毒檢出的性別分布特點(diǎn) 男性患兒371例，女性232例，男女檢出率分別為88.1%（327/371）和87.1%（202/232），男女陽(yáng)性檢出率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.152，P=0.697）。不同病毒陽(yáng)性檢出結(jié)果的性別分布及比較見(jiàn)表2，從表2中可以看出，14種病毒陽(yáng)性檢出率男女比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3 病毒檢出的年齡分布特點(diǎn) 從表3可見(jiàn)，不同年齡段病毒檢出率不同，以6月～年齡段檢出率最高，不同年齡段之間病毒檢出率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=45.982，P=0.000）。不同年齡段各病毒的檢出率見(jiàn)表4，其中RSV在0月～年齡段檢出率最高，HRV以12月～年齡段最高，PIV3在6月～年齡段為主。

表2 病毒陽(yáng)性檢出結(jié)果的性別分布及比較n（%）

表3 病毒陽(yáng)性檢出的年齡分布

表4 不同年齡段病毒檢出率n（%）

2.4 病毒檢出的季節(jié)分布特點(diǎn) 各病毒全年均有檢出，但病毒總檢出率季節(jié)分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=13.864，P=0.003），以冬季檢出率最高95.8%。不同病毒的季節(jié)分布亦有明顯不同，其中RSV的檢出高峰在2013年12月至2014年3月，HRV在6月和9月至11月，HBoV在4月及7月有兩個(gè)波峰，PIV3檢出高峰在4、5月，ADV高峰集中在8月，而IFVA檢出高峰在12月；其他詳見(jiàn)圖1和2。

2.5 不同臨床診斷病毒檢出率分布特點(diǎn) 在不同臨床診斷中，病毒檢出情況大致相同，其中急性支氣管炎患兒中病毒總檢出率為86.5%（32/37），肺炎的檢出率為84.5%（288/341），毛細(xì)支氣管炎為92.2%（201/218），支氣管哮喘合并肺部感染的檢出率為85.7%（6/7）。各診斷中不同病毒所占比例有所不同，急性支氣管炎組患兒中HRV檢出率（32.4%）居首；肺炎和毛細(xì)支氣管炎患兒中RSV均占首位，檢出率分別為40.2%、49%，詳見(jiàn)圖3。

2.6 單一或多重病毒檢出狀況分布特點(diǎn) 在527例病毒陽(yáng)性檢出患兒中，檢出一種病毒的有276例，占52.4%，檢出兩種及兩種以上混合病毒的有251例，占47.6%，詳見(jiàn)表5。

表5 單一及兩種混合病毒檢出狀況 n

圖1 病毒陽(yáng)性檢出率季節(jié)分布情況

圖2 病毒陽(yáng)性檢出率季節(jié)分布情況

圖3 不同臨床診斷病毒檢出率分布

3 討論

本研究結(jié)果顯示603名ALRTI住院兒童病毒總檢出率為87.4%，表明病毒感染在長(zhǎng)沙地區(qū)ALRTI住院兒童中占有重要地位，其中RSV檢出率最高42.6%，其次為HRV 25.4%、HBoV 17.7%、PIV3 15.4%及ADV14.46%，與本課題組前期研究及國(guó)內(nèi)北京、廣州、重慶地區(qū)［6-9］，以及國(guó)外ALRTI住院患兒病毒譜的構(gòu)成狀況相似［10-12］，也說(shuō)明上述病毒為長(zhǎng)沙地區(qū)ALRTI兒童主要的病毒病原。病毒總檢出率87.4%較本課題組前期研究74.76%有所上升，考慮可能與實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法靈敏度更強(qiáng)有關(guān)，也在一定程度上說(shuō)明隨著時(shí)間的推移，病毒在住院兒童ALRTI中所占地位愈發(fā)突出，因此進(jìn)行連續(xù)動(dòng)態(tài)病毒病原學(xué)監(jiān)測(cè)顯得尤為重要。

本組資料發(fā)現(xiàn)，患兒男女性別的病毒陽(yáng)性檢出率無(wú)差異，提示性別對(duì)病毒總體檢出情況無(wú)明顯影響，與本課題組前期研究相一致［6］。不同年齡段病毒檢出率有不同，以6 個(gè)月至1 歲以內(nèi)年齡段檢出率最高，5歲以下患兒病毒總檢出率90.2%（489/542），3歲以下90.5%（429/474），1歲以下96.5%（280/290），表明年齡愈小對(duì)病毒愈易感，與國(guó)內(nèi)部分地區(qū)報(bào)道基本一致［6-9，13］。在不同年齡段內(nèi)各病毒檢出情況同樣存在差異，RSV最常見(jiàn)于0月～小嬰兒年齡段，PIV3最常見(jiàn)于6月～嬰兒年齡段，而HRV則最常見(jiàn)于12月～幼兒年齡段，以上結(jié)果提示不同病毒病原對(duì)不同年齡段患兒易感性不同，可能與兒童呼吸道生理結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及機(jī)體免疫功能狀況存在關(guān)聯(lián)。

本研究還發(fā)現(xiàn)，各病毒檢出率的高峰期季節(jié)分布有所不同，RSV、IFVA以冬季高發(fā)，HRV常見(jiàn)于夏秋季，PIV3常見(jiàn)于春季，ADV則集中在夏季；而北京地區(qū)的報(bào)道顯示RSV、HRV高發(fā)于冬春季，ADV則集中在春季，PIV則集中在春夏季［7］；重慶地區(qū)RSV同樣以冬季高發(fā)，PIV3、ADV則常見(jiàn)于春夏季，IFVA集中在夏季［9］；法國(guó)RSV集中在秋冬季，ADV、PIV及IFVA均集中在冬季［11］。上述資料說(shuō)明，各病毒檢出高峰的季節(jié)不同，可能與不同研究對(duì)象的地理位置、環(huán)境、氣候條件及采樣時(shí)期不同有關(guān)。

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)均顯示RSV為ALRTI住院兒童最常見(jiàn)的病毒病原，其流行年齡段集中在小年齡組患兒，以冬春季節(jié)高發(fā)［7，9，14，15］，上述特點(diǎn)與本研究基本相同。本組資料RSV的檢出率為42.6%，明顯高于本課題組前期（27.03%）的報(bào)道［6］，考慮與本研究期間可能存在RSV流行趨勢(shì)有關(guān)，說(shuō)明連續(xù)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)的重要性，但也不排除與實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法靈敏度更高有關(guān)。HBoV在本組資料中檢出率17.7%列居第三位，明顯高于前期數(shù)據(jù)（8.67%）［6］及上海、約旦、韓國(guó)（5.45~9.1%）的檢出率［16-18］，但與日本（15.7%）的檢出率接近［19］，而該研究與本研究的檢測(cè)方法一致。本資料顯示HBoV以混合感染為主，占總陽(yáng)性率的86%，且春、夏季有雙峰流行。本研究還發(fā)現(xiàn)ADV（14.8%）及IFVA（7.5%）的檢出率較2007~2008年長(zhǎng)沙地區(qū)（ADV4.46%，IFVA1.95%）的數(shù)據(jù)顯著增高［6］，說(shuō)明本研究期間內(nèi)這2種病毒在本地區(qū)有爆發(fā)流行，近年來(lái)國(guó)內(nèi)外也有相關(guān)報(bào)道［20-23］，值得高度重視。

本研究采用實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)手段對(duì)長(zhǎng)沙地區(qū)603名ALRTI住院兒童的NPA進(jìn)行病毒核酸檢測(cè)，了解了本地區(qū)2013~2014年ALRTI住院兒童病毒病原的流行病學(xué)特點(diǎn)，為臨床醫(yī)師在實(shí)際工作中經(jīng)驗(yàn)性治療提供了科學(xué)依據(jù)，同時(shí)也為衛(wèi)生行政部門防控決策積累參考資料。

［1］Nair H, Roca A, Baggett H C, et al. Global and regional burden of hospital admissions for severe acute lower respiratory infections in young children in 2010: a systematic analysis［J］. Lancet, 2013, 381(9875):1380.

［2］Liu L, Johnson H L, Cousens S, et al. Global, regional, and national causes of child mortality: an updated systematic analysis for 2010 with time trends since 2000［J］. Lancet, 2012, 379(9832): 2151-2161.

［3］Pavia A T. Viral Infections of the Lower Respiratory Tract: Old Viruses, New Viruses, and the Role of Diagnosis［J］. Clin Infect Dis, 2011,52(Supplement 4): S284-S289.

［4］Meijer A, van der Sanden S, Snijders B E P, et al. Emergence and epidemic occurrence of enterovirus 68 respiratory infections in The Netherlands in 2010［J］. Virology, 2012, 423(1): 49-57.

［5］Jartti T, Soderlund-Venermo M, Hedman K, et al. New molecular virus detection methods and their clinical value in lower respiratory tract infections in children［J］. Paediatr Respir Rev, 2013, 14(1): 38-45.

［6］肖霓光, 張兵, 段招軍, 等. 1165例急性下呼吸道感染住院兒童的病毒病原學(xué)分析［J］. 中國(guó)當(dāng)代兒科雜志, 2012, 14(1): 28-32.

［7］劉春艷, 謝正德, Richard Gonzalez, 等. 兒童急性下呼吸道感染病毒病原學(xué)研究［J］. 中國(guó)實(shí)用兒科雜志, 2009, 24(04): 270-273.

［8］朱美華, 周志剛, 溫紅艷, 等. 廣州地區(qū)兒童呼吸道病毒感染流行情況及混合感染調(diào)查［J］. 中國(guó)婦幼保健, 2013, 28(18): 2951-2955.

［9］雷小英, 彭東紅. 2009-2011年重慶地區(qū)兒童呼吸道病毒感染流行特征分析［J］. 重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào), 2013, 38(9): 1052-1057.

［10］Bicer S, Giray T, Col D, et al. Virological and clinical characterizations of respiratory infections in hospitalized children［J］. Ital J Pediatr, 2013,39: 22.

［11］Cantais A, Mory O, Pillet S, et al. Epidemiology and microbiological investigations of community-acquired pneumonia in children admitted at the emergency department of a university hospital［J］. J Clin Virol,2014, 60(4): 402-407.

［12］Hasan R, Rhodes J, Thamthitiwat S, et al. Incidence and Etiology of Acute Lower Respiratory Tract Infections in Hospitalized Children Younger Than 5 Years in Rural Thailand［J］. Pediatr Infect Dis J, 2014,33(2): e45-e52.

［13］He Y, Lin G, Wang Q, et al. A 3-year prospective study of the epidemiology of acute respiratory viral infections in hospitalized children in Shenzhen, China［J］. Influenza Other Respir Viruses, 2014, 8(4):443-451.

［14］Jin Y, Zhang RF, Xie ZP, et al. Newly identified respiratory viruses associated with acute lower respiratory tract infections in children in Lanzou, China, from 2006 to 2009［J］. Clin Microbiol Infect, 2012, 18(1):74-80.

［15］Hatipog Lu N, Siraneci R, Somer A, et al. Viral etiology in hospitalized children with acute lower respiratory tract infection［J］. Turkish J pediatr, 2011, 53(5): 508-516.

［16］Shen J, Zhu Q, Zeng M, et al. Detection and genome analysis of human bocavirus 1-4 from hospitalized children with acute lower respiratory tract infection and symptoms of wheezing in Shanghai［J］. Int J Mol Med,2013, 32(6): 1415-1420.

［17］Al-Rousan HO, Meqdam MM, Alkhateeb A, et al. Human bocavirus in Jordan: prevalence and clinical symptoms in hospitalised paediatric pa-tients and molecular virus characterisation［J］. Singapore Med J, 2011,52(5): 365-369.

［18］Kim J S, Lim C S, Kim Y K, et al. Human bocavirus in patients with respiratory tract infection［J］. Korean J Lab Med, 2011, 31(3): 179-184.

［19］Kaida A, Kubo H, Takakura K, et al. Detection and quantitative analysis of human bocavirus associated with respiratory tract infection in Osaka City, Japan［J］. Microbiol Immunol, 2010, 54(5): 276-281.

［20］Xie L, Yu XF, Sun Z, et al. Two adenovirus serotype 3 outbreaks associated with febrile respiratory disease and pharyngoconjunctival fever in children under 15 years of age in Hangzhou, China, during 2011［J］. J Clin Microbiol, 2012, 50(6): 1879-1888.

［21］Huang G, Yu D, Zhu Z, et al. Outbreak of febrile respiratory illness associated with human adenovirus type 14p1 in Gansu Province, China［J］.Influenza Other Respir Viruses, 2013, 7(6): 1048-1054.

［22］Yu P, Ma C, Nawaz M, et al. Outbreak of acute respiratory disease caused by human adenovirus type 7 in a military training camp in Shaanxi, China［J］. Microbiol Immunol, 2013, 57(8): 553-560.

［23］Kushwaha AS, Teli P, Mahen A. Outbreak of Influenza (H1N1)amongst children in a residential school［J］. Med J Armed Forces India, 2014,70(3): 274-276.