人嗅黏膜間充質(zhì)干細(xì)胞的體外培養(yǎng)、鑒定及誘導(dǎo)分化的研究

葛麗特，段 答，王 磊，趙振宇，滕曉華，盧 明

（1.湖南師范大學(xué)第二附屬醫(yī)院，解放軍第 163 醫(yī)院，神經(jīng)外科，長沙 410003；2.湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院，長沙 410006）

間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一類多能成體干細(xì)胞，因其在干細(xì)胞移植、神經(jīng)修復(fù)、細(xì)胞組織工程等中具有重要作用，近年來成為干胞研究的熱點(diǎn)之一。目前其主要來源為成人骨髓，但骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）細(xì)胞數(shù)量及增殖分化潛能隨年齡的增大而下降，病毒感染率較高［1，2］，且采集須行骨髓穿刺術(shù)，從而使間充質(zhì)干細(xì)胞的臨床應(yīng)用受到限制。

嗅黏膜間充質(zhì)干細(xì)胞（olfactory mucosa mesenchymal stem cells，OM-MSCs）也稱為外胚間充質(zhì)干細(xì)胞（ectomesenchymal stem cells，OE-MSC）［3］。 又因?yàn)槎ㄎ挥谛狃つす逃袑又?，所以也稱嗅黏膜固有層間充質(zhì)干細(xì)胞（lamina propria mesenchymal stem cell，LP-MSCs）［4，5］。OM-MSCs 在體外易于提取培養(yǎng)，并能保持其多向分化潛能，鼻內(nèi)分布廣泛［6］，不受年齡相關(guān)性影響［7］，遺傳背景穩(wěn)定［8］，安全性高，自體移植，無免疫排斥反應(yīng)，成為組織工程的理想的種子細(xì)胞［9］。本研究從人的鼻嗅黏膜中分離出MSC，并研究細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征、細(xì)胞的生長特性、細(xì)胞周期和其免疫表型等特性，旨在建立OMMSCs的培養(yǎng)和鑒定方法，初步探討其生物學(xué)特性，為鼻黏膜OM-MSCs自體移植修復(fù)組織損傷提供細(xì)胞來源基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料 鼻嗅黏膜取自鼻腔健康的志愿者（在簽署知情同意書后且經(jīng)過湖南師范大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)）。

1.1.2 試劑及儀器 高糖DMEM-F12 培養(yǎng)基（1∶1）（GIBCO 公司，美國）；體積分?jǐn)?shù)為10%小牛血清（HyClone 公司，澳大利亞）；雙抗（青霉素20 000U/mL、鏈霉素 20000 ng/mL）；胰蛋白酶消化液、細(xì)胞培養(yǎng)專用凍存液；鼠抗人單克隆抗體CD34-GCD、CD45-PCT、CD90-FITC、CD105-PE、CD73-FITC（Sigma 公司，美國）；CO2培養(yǎng)箱；倒置顯微鏡（Olympus 公司，日本）；脂肪組織誘導(dǎo)劑和骨組織誘導(dǎo)劑（GIBCO 公司，美國）；油紅O、茜草紅（GIBCO 公司，美國）、MTT；鼻嗅黏膜征得病人家屬同意且予以知情同意書簽字。

1.2 方法

1.2.1 OM-MSCs的取材和原代培養(yǎng) 鼻嗅黏膜獲取前三天，病人準(zhǔn)備，簽署志愿書，排除嗅黏膜損傷、萎縮性鼻炎等嗅黏膜疾病，鼻毛清理，滴加氯霉素。獲取前鼻內(nèi)麻醉，取中鼻甲靠根部內(nèi)側(cè)。鼻嗅黏膜取出后用無血清高糖DMEM/F-12混合培養(yǎng)基（含青霉素100U/m L 和鏈霉素100U/m L）清洗3次去除血跡和雜質(zhì)，然后放置于含10%胎牛血清的DMEM/F-12培養(yǎng)基（含青霉素100U/mL和鏈霉素100U/mL）的培養(yǎng)皿中，用眼科剪剪碎組織塊，剪成1mm3大小，離心1000轉(zhuǎn)5分鐘后，棄上清液，接種于Corning 培養(yǎng)瓶，置CO2培養(yǎng)箱內(nèi)（37℃，5% CO2，飽和濕度）培養(yǎng)。之后每隔3天將細(xì)胞換液，當(dāng)細(xì)胞鋪滿瓶底達(dá)到>80%融合時(shí)進(jìn)行消化、傳代。將第5代細(xì)胞離心和接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，分別用于OM-MSCs流式細(xì)胞術(shù)鑒定檢測和誘導(dǎo)分化成脂肪細(xì)胞和成骨細(xì)胞。

1.2.2 形態(tài)學(xué)觀察 每日在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞，生長情況和細(xì)胞形態(tài)并照相。

1.2.3 OM-MSC s的細(xì)胞表面標(biāo)志測定 取第5代細(xì)胞，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.125% 胰蛋白酶消化后，終止消化，將細(xì)胞用PBS洗滌3 次，進(jìn)行分管，每管0.1m L。陰性對照管加入抗人IgG-FITC、IgG-PE；其它管分別加入鼠抗人抗體CD34-PE、CD45-PE、CD73-FITC、CD90-FITC，室溫孵育30min，流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。

1.2.4 OM-M SCs體外定向誘導(dǎo)分化 選擇第4代OM-MSCs，按2.0×106/mL接種于放置有多聚賴氨酸處理過的無菌蓋玻片的6孔板內(nèi)，待細(xì)胞貼壁生長細(xì)胞融合達(dá)80%時(shí)，在各誘導(dǎo)孔的完全培養(yǎng)液中分別加入下列誘導(dǎo)劑：①成脂細(xì)胞誘導(dǎo)劑（StemPro，Invitrogen，UK），②成骨細(xì)胞誘導(dǎo)劑（StemPro，Invitrogen，UK）。每3～ 4天換液1次，以未加誘導(dǎo)培養(yǎng)液的細(xì)胞培養(yǎng)孔作為對照，成脂細(xì)胞誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)2周后，經(jīng)4%多聚甲醛固定15min，對誘導(dǎo)分化的脂肪細(xì)胞進(jìn)行油紅O染；成骨細(xì)胞誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)3周后，經(jīng)4%多聚甲醛固定15min，對誘導(dǎo)分化的成骨細(xì)胞進(jìn)行茜素紅染色。

1.2.5 細(xì)胞生長活性測定 取第3代細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為5×103/m L，接種于96細(xì)胞培養(yǎng)孔板內(nèi)，用無細(xì)胞培養(yǎng)液作為空白對照，連續(xù)7天利用MTT法進(jìn)行檢測，每組6孔，于492nm 處分光光度計(jì)檢測各組細(xì)胞的光吸收值（A 值），重復(fù)3次，取其均值和標(biāo)準(zhǔn)差繪制生長曲線。

1.2.6 細(xì)胞周期檢測 取第4代的細(xì)胞，胰蛋白酶消化1～5min，調(diào)整細(xì)胞密度為1.0×106/m L～2.0×106/mL，PBS洗滌3次，加入1m L體積分?jǐn)?shù)為70% 的預(yù)冷的乙醇，充分吹散制成單細(xì)胞懸液，4 ℃冰箱中固定24 h 后、離心、去上清、沉淀物重懸在1mL碘化丙啶中（含RNA ase A 質(zhì)量濃度 10 Lg /mL，PI質(zhì)量濃度 50 Lg /mL），4℃ 孵育20min，以流式細(xì)胞儀檢測分析細(xì)胞周期。

2 結(jié)果

2.1 OM-MSCs的獲取及形態(tài)觀察 根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，嗅黏膜間充質(zhì)干細(xì)胞最先發(fā)現(xiàn)在嗅黏膜區(qū)因此得名，最新研究顯示OM-MSCs廣泛分布于鼻腔中［10］，以中鼻甲與上鼻甲居多，組織取自中鼻甲根部區(qū)嗅黏膜，取出的粘膜面積大概2cm3，取后志愿者的嗅黏膜一個(gè)月可恢復(fù)，且通過嗅覺實(shí)驗(yàn)證明對于病人的嗅覺無影響（圖1A、B）。

采用組織貼壁法，組織塊多于24h內(nèi)可貼壁，7天內(nèi)大部分細(xì)胞爬出（圖1C），細(xì)胞呈間充質(zhì)干細(xì)胞典型的細(xì)胞形態(tài)，呈梭形、多角形。原代細(xì)胞生長至約14天時(shí)可達(dá)到80%融合進(jìn)行傳代，傳代后的細(xì)胞生長速度明顯加快，約2~3天即可傳代1次，傳代次數(shù)可達(dá)到10次以上。傳代到第3時(shí)細(xì)胞純度較高，形態(tài)上更為均一，以間充質(zhì)細(xì)胞典型的平行排列生長為主，或呈漩渦狀生長［11，12］（圖1D）。

2.2 OM-MSCs的細(xì)胞表面標(biāo)志分析 經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測，OM-MSCs表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞一般標(biāo)記物，黏附分子CD73和基質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記CD90，不表達(dá)造血干細(xì)胞標(biāo)志CD34和CD45（圖 2）。

2.3 誘導(dǎo)分化

2.3.1 OM-M SCs成脂誘導(dǎo)分化的形態(tài)變化及油紅O染色 經(jīng)成脂誘導(dǎo)后的OM-MSCs，其形態(tài)由典型的長梭形逐漸變短、變胖，呈短胖梭形、橢圓形或圓形。誘導(dǎo)7d 后，在光鏡下可看見具有強(qiáng)折光性的空泡，提示脂滴開始形成。隨著誘導(dǎo)時(shí)間延長，胞漿內(nèi)的脂滴增多。誘導(dǎo)后的細(xì)胞經(jīng)油紅O染色，可見胞漿中有大量被染成紅色的脂滴（圖2A 、C），說明OM-MSCs在體外有向脂肪細(xì)胞分化的潛能。

2.3.2 OM-M SCs成骨誘導(dǎo)分化的形態(tài)變化及茜素紅S染色 經(jīng)成骨誘導(dǎo)后的OM-MSCs，出現(xiàn)聚集的傾向，細(xì)胞密度較大，形態(tài)、邊界不清晰。誘導(dǎo)3周后，進(jìn)行茜素紅染色后細(xì)胞內(nèi)礦化結(jié)節(jié)呈現(xiàn)紅色。說明OMMSCs在體外具有向成骨細(xì)胞分化的潛能（圖2B、D）。

2.4 OM-M SCs的生長活性測定和細(xì)胞周期 細(xì)胞傳代后，第1～ 2天處于增殖不明顯。到第3～ 5天細(xì)胞進(jìn)入對數(shù)生長期，細(xì)胞增殖加速，呈幾何倍數(shù)增加。第6～7天則進(jìn)入平臺期（P<0.05，n=3）（圖3），呈S型。第3代人OM-MSCs的細(xì)胞周期檢測顯示：G1期占82.47%，S 期占6.68%，G2期10.85%。提示大部分細(xì)胞處于靜止?fàn)顟B(tài)，少部分細(xì)胞處于增殖期（圖4）。

3 討論

作為成體干細(xì)胞家族的重要成員之一，間充質(zhì)干細(xì)胞具有自我擴(kuò)增和多向分化特性。但是中胚層來源的MSCs如骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有向中胚層組織自然分化的趨勢，在體外培養(yǎng)擴(kuò)增的過程中隨著年齡的增加其向神經(jīng)分化的潛能逐漸減弱［2］。因此，找尋新的具有多向分化潛能且可用于自體移植的種子細(xì)胞已成為神經(jīng)修復(fù)和組織工程研究領(lǐng)域的一個(gè)重要的研究熱點(diǎn)。

OM-MSCs存在于嗅黏膜的固有層中，屬于外胚層來源，不僅可分化為中胚層來源的組織，如骨組織和脂肪組織等，也可被誘導(dǎo)跨胚層分化為神經(jīng)細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞［13，14］，大量研究證明 ：OM-MSCs具有與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞相似的生物學(xué)特性及類似的免疫表型，而且在體外能夠向脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞等分化，將嗅黏膜細(xì)胞植入雞胚中，還能分化出典型的心臟，肌肉，肝臟，腦，脊髓等組織［5，15］。

圖1 OM的獲取及OM-MSCs在不同時(shí)期的形態(tài)特征

圖2 嗅黏膜間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志物的表達(dá)

圖3 油紅O染色及茜素紅染色

圖4 OM-MSCs的生長曲線和細(xì)胞周期分析

本實(shí)驗(yàn)中通過利用嗅黏膜組織塊貼壁法這一簡單、可靠的方法，分離、純化和擴(kuò)增了OM-MSCs，采用含10%胎牛血清的DMEM/F-12培養(yǎng)基進(jìn)行的嗅黏膜組織塊貼壁法培養(yǎng)OM-MSCs，獲得的細(xì)胞形態(tài)呈均一梭形，呈平行排列或漩渦狀生長，經(jīng)換液和傳代等方法提純細(xì)胞，細(xì)胞傳至第3代時(shí)，可得到純度較高的OMMSCs。通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞標(biāo)記物，發(fā)現(xiàn)OMMSCs高表達(dá)CD73、CD90，不表達(dá)CD34、CD45，符合間充質(zhì)干細(xì)胞的流式檢測一般特性。此外，為了證明鼻黏膜OM-MSCs 的多向分化能力，我們分別誘導(dǎo)OMMSCs向脂肪組織和骨組織定向分化。結(jié)果顯示，在脂肪誘導(dǎo)劑培養(yǎng)后，OM-MSCs的細(xì)胞內(nèi)形成可有油紅O染色的脂滴；而在成骨誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)培養(yǎng)后，OM-MSCs在細(xì)胞表面形成大量的茜草紅染色陽性的鈣結(jié)節(jié)。上述結(jié)果表明通過組織塊貼壁法獲得、分離、培養(yǎng)的OMMSCs具有間充質(zhì)干細(xì)胞的一般細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞表型和分化能力。OM-MSCs的生長曲線符合正常細(xì)胞的生長特性。其倍增時(shí)間較短，平均為2~3天，說明分離培養(yǎng)獲得的OM-MSCs在體外生長活躍，具有較強(qiáng)的增殖能力。細(xì)胞周期檢測顯示第3代人OM-MSCs的細(xì)胞周期檢測顯示：82.47%處于GO/ G1期，S 期占6.68%，G2期10.85%。提示OM-MSCs合成前期，仍保留自我更新和增殖能力，符合干細(xì)胞的細(xì)胞增殖特性。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)通過簡單的體外分離可建立一種有效地富集純度相當(dāng)高的OM-MSCs獲取、分離、培養(yǎng)的方法，并通過流式細(xì)胞術(shù)檢測所培養(yǎng)的細(xì)胞表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞的特異性表面抗原而不表達(dá)造血干細(xì)胞特異性抗原，通過分化誘導(dǎo)成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞等，證實(shí)了實(shí)驗(yàn)分離培養(yǎng)的OM-MSCs為純度高、增殖能力強(qiáng)、分化能力強(qiáng)，數(shù)量充足的種子細(xì)胞，為神經(jīng)修復(fù)及干細(xì)胞臨床應(yīng)用提供穩(wěn)定的種子細(xì)胞來源具有重要意義。

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