富血小板血漿(PRP)對(duì)兔早期椎間盤(pán)退變(IDD)的干預(yù)作用

桂柯科 俞永林 任偉民 李 新 董加純 尹望平

(1復(fù)旦大學(xué)附屬金山醫(yī)院骨科,3病理科,4放射科 上海 201508; 2復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院骨科 上海 200040)

富血小板血漿(PRP)對(duì)兔早期椎間盤(pán)退變(IDD)的干預(yù)作用

桂柯科1俞永林2△任偉民3李 新4董加純1尹望平1

(1復(fù)旦大學(xué)附屬金山醫(yī)院骨科,3病理科,4放射科 上海 201508;2復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院骨科 上海 200040)

目的 采用纖維環(huán)穿刺法建立兔椎間盤(pán)退變(intervertebral disc degeneration,IDD)模型,進(jìn)行椎間盤(pán)內(nèi)注射自體富血小板血漿(platelet-rich plasma,PRP)干預(yù),評(píng)價(jià)影像學(xué)及組織學(xué)干預(yù)效果。方法 健康成年新西蘭大白兔16只,隨機(jī)分為PRP干預(yù)組(A組)、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)注射組(B組)、造模對(duì)照組(C組)和單純對(duì)照組(D組),每組4只。A、B和C組采用纖維環(huán)穿刺法建立L4/5、L5/6 IDD模型。在造模后2周,對(duì)各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行二次干預(yù)。A組取耳中央動(dòng)脈血,采用Landesberg法制備PRP,于L4/5、L5/6椎間隙分別注入0.1 mL PRP;B組于L4/5、L5/6椎間隙分別注入0.1 mL PBS;C組暴露椎間隙后不作特殊處理。干預(yù)后2周,進(jìn)行X線及MRI檢查。處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,取椎間盤(pán)組織進(jìn)行HE染色、Masson染色、番紅O染色以及Ⅱ型膠原免疫組織化學(xué)染色,觀察組織學(xué)改變。結(jié)果 所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均存活至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。PRP血小板計(jì)數(shù)約為外周血的3.69倍。隨著時(shí)間推移,B組和C組的椎間隙高度逐漸下降、椎間盤(pán)信號(hào)逐漸降低,各時(shí)間點(diǎn)組內(nèi)椎間盤(pán)高度指數(shù)百分?jǐn)?shù)(disc height index percentage,%DHI)和MRI分級(jí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);A組和D組的椎間隙高度、椎間盤(pán)信號(hào)無(wú)明顯變化,在初次手術(shù)后4周的時(shí)間點(diǎn)與B組和C組相比,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。B組和C組的椎間盤(pán)組織病理學(xué)表現(xiàn)為髓核軟骨細(xì)胞退行性變、壞死,形態(tài)不規(guī)則,分布不均勻,軟骨基質(zhì)逐步被纖維束取代,可見(jiàn)蛋白聚糖及Ⅱ型膠原減少;A組和D組的椎間盤(pán)組織形態(tài)變化不明顯,在初次手術(shù)后4周的時(shí)間點(diǎn)與B組和C組相比,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 自體PRP注射治療兔早期IDD模型的影像學(xué)及組織學(xué)評(píng)價(jià)滿意,PRP早期干預(yù)可以有效抑制IDD進(jìn)程。

富血小板血漿(PRP); 椎間盤(pán)退變(IDD); 生物學(xué)治療; 兔

下腰痛是現(xiàn)代社會(huì)的常見(jiàn)病和多發(fā)病,椎間盤(pán)退變(intervertebral disc degeneration,IDD)是引起下腰痛的主要原因之一[1],目前在臨床上尚無(wú)公認(rèn)的有效治療方法。近年來(lái),IDD的分子生物學(xué)機(jī)制和治療方法開(kāi)始成為研究熱點(diǎn)[2-3]。富血小板血漿(platelet-rich plasma,PRP)作為一種含有超生理濃度血小板的自體全血衍生物,富含多種生長(zhǎng)因子和其他細(xì)胞因子,能促進(jìn)多種類(lèi)型細(xì)胞的遷移和增殖,為骨、軟骨以及肌腱、肌肉等軟組織的修復(fù)再生提供良好的微環(huán)境,近年來(lái)在骨科和整形外科領(lǐng)域得到了廣泛關(guān)注[4]。目前國(guó)內(nèi)外有關(guān)PRP對(duì)IDD的修復(fù)作用的研究仍處于起步階段。本研究采用纖維環(huán)穿刺法建立兔IDD模型,抽取兔外周血通過(guò)高速離心制備PRP,對(duì)兔退變椎間盤(pán)進(jìn)行盤(pán)內(nèi)注射自體PRP干預(yù),通過(guò)觀察影像學(xué)及組織學(xué)表現(xiàn)對(duì)干預(yù)效果進(jìn)行評(píng)價(jià),以期為進(jìn)一步臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

材 料 和 方 法

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康成年新西蘭大白兔16只,雌雄不限,體質(zhì)量(2.5±0.5) kg,由復(fù)旦大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部提供。經(jīng)X線及MRI檢查排除脊柱的先天性畸形和椎間盤(pán)病變。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為PRP干預(yù)組(A組)、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)注射組(B組)、造模對(duì)照組(C組)和單純對(duì)照組(D組),每組各4只。其中A、B和C組分別按下述方法進(jìn)行手術(shù)干預(yù),D組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物不加干預(yù),只在標(biāo)準(zhǔn)條件下飼養(yǎng),用于對(duì)照。

IDD模型制備 對(duì)A組、B組和C組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,采用氯胺酮0.2 g:地西泮10 mg混合后肌注麻醉,左側(cè)臥位,固定妥四肢,腰背部電動(dòng)剃毛器備皮,常規(guī)消毒鋪巾。由第12肋緣至髂嵴作平行于脊柱長(zhǎng)軸的縱切口長(zhǎng)約8 cm,剪開(kāi)腹外斜肌與背肌間隙,鈍性分離至脊柱橫突處,注意避免損傷腹膜,由于髂嵴與L6椎體大致在同一水平,可據(jù)此定位,找到相應(yīng)的椎間隙,暴露L4/5、L5/6椎間盤(pán)。采用16 G穿刺針進(jìn)行單次纖維環(huán)穿刺,穿刺方向?yàn)樽甸g盤(pán)側(cè)前方平行終板,蚊式鉗夾持穿刺針前端,控制刺入椎間盤(pán)中央深度為5 mm,維持5 s,然后拔出穿刺針。注意操作輕柔,避免將髓核帶出。生理鹽水沖洗創(chuàng)口后逐層縫合。所有動(dòng)物分別于術(shù)前和手術(shù)結(jié)束時(shí)肌肉注射青霉素80萬(wàn)U。術(shù)后佩戴伊麗莎白項(xiàng)圈以防止動(dòng)物舔咬手術(shù)切口,置于標(biāo)準(zhǔn)條件下自由喂養(yǎng)。

PRP制備 A組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物取耳中心動(dòng)脈血約11 mL,其中0.5 mL用于鏡下血小板計(jì)數(shù),剩余10.5 mL加入含枸櫞酸鈉的試管中搖勻用于制備PRP。根據(jù)Landesberg等[5]推薦的二次離心條件,先以200×g離心10 min,留取上層及交界面以下約1 mm處共約4.5 mL,再以200×g離心10 min,留取下層1/4約1.1 mL液體搖勻,即為PRP。取0.5 mL PRP用于鏡下血小板計(jì)數(shù),剩余約0.6 mL PRP中加入0.06 mL凝血酶(濃度1 000 U/mL),形成凝膠狀物備用。

二次手術(shù)干預(yù) 在初次手術(shù)后2周,分別對(duì)A、B、C組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行二次手術(shù)干預(yù),具體方法如下。A組:暴露L4/5、L5/6椎間盤(pán),分別注入0.1 mL自體PRP,然后逐層縫合。B組:暴露L4/5、L5/6椎間盤(pán),分別注入0.1 mL PBS緩沖液(pH 7.4),然后逐層縫合。C組:暴露L4/5、L5/6椎間盤(pán),不作特殊處理,然后逐層縫合。

X線檢查 在初次手術(shù)前和二次手術(shù)干預(yù)后2周,所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物攝腰椎正側(cè)位DR片。應(yīng)用PACS系統(tǒng)分別測(cè)量相應(yīng)側(cè)位片的椎間盤(pán)高度(DH)、上位椎體高度(UB)、下位椎體高度(LB),計(jì)算椎間盤(pán)高度指數(shù)(DHI)以及手術(shù)前后椎間盤(pán)高度指數(shù)百分?jǐn)?shù)(disc height index percentage,%DHI,圖1)。

MRI檢查 在初次手術(shù)前和二次手術(shù)干預(yù)后2周,所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物取仰臥位,采用Siemens 1.5T超導(dǎo)MRI掃描儀進(jìn)行矢狀位T2WI掃描,用SE序列,掃描參數(shù)為T(mén)R/TE 3500/100 ms,層厚1.5 mm,間隔0 mm。以Pfirrmann改良分級(jí)法[6]作為評(píng)估標(biāo)準(zhǔn),根據(jù)T2WI像兔椎間盤(pán)信號(hào)強(qiáng)度將退變分為5級(jí):I級(jí),髓核結(jié)構(gòu)均一、亮白,髓核纖維環(huán)界限清楚,髓核信號(hào)強(qiáng)度高,椎間盤(pán)高度正常;Ⅱ級(jí),髓核結(jié)構(gòu)不均,可有水平帶,髓核纖維環(huán)界限清楚,髓核信號(hào)強(qiáng)度高,椎間盤(pán)高度正常;Ⅲ級(jí),髓核結(jié)構(gòu)不均、灰,髓核纖維環(huán)界限不清,髓核信號(hào)強(qiáng)度中,椎間盤(pán)高度輕度降低;Ⅳ級(jí),髓核結(jié)構(gòu)不均、灰到黑,髓核纖維環(huán)界限丟失,髓核信號(hào)強(qiáng)度中到低,椎間盤(pán)高度中度降低;V級(jí),髓核結(jié)構(gòu)不均、黑,髓核纖維環(huán)界限丟失,髓核信號(hào)強(qiáng)度低,椎間盤(pán)高度重度降低。

圖1 X線測(cè)量和計(jì)算方法Fig 1 Measurement and calculation of X-rays

組織學(xué)檢查 在二次手術(shù)干預(yù)后2周,結(jié)束X線及MRI檢查后,經(jīng)耳緣靜脈注入10 mL空氣處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,獲取手術(shù)節(jié)段椎間盤(pán)髓核組織。常規(guī)切片,進(jìn)行HE染色,觀察髓核組織形態(tài)學(xué)變化;進(jìn)行Masson染色,觀察膠原纖維的變化;進(jìn)行番紅O染色,觀察蛋白聚糖的變化;進(jìn)行免疫組化染色,觀察Ⅱ型膠原表達(dá)情況。在HE染色和番紅O染色的基礎(chǔ)上,參考文獻(xiàn)[7]的半定量標(biāo)準(zhǔn)對(duì)髓核的病理變化進(jìn)行分級(jí):0級(jí),正常結(jié)構(gòu);1級(jí),細(xì)胞外基質(zhì)蜂窩狀改變,無(wú)結(jié)締組織增生;2級(jí),<24%的髓核組織被增生的結(jié)締組織替代;3級(jí),25%～50%的髓核組織被增生的結(jié)締組織替代;4級(jí),>50%的髓核組織被增生的結(jié)締組織替代;5級(jí),原有正常的髓核組織全部被增生的結(jié)締組織替代。

結(jié) 果

一般情況 所有動(dòng)物均順利存活至本實(shí)驗(yàn)結(jié)束。未發(fā)生切口感染、積液、裂開(kāi)等情況,術(shù)后2周切口愈合良好。所有動(dòng)物術(shù)后雙下肢活動(dòng)正常,未發(fā)生因穿刺過(guò)深導(dǎo)致癱瘓的情況。

PRP制備 A組所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物外周血經(jīng)二次離心后可得血小板富集層,吸棄大部分上清液后即可制得PRP(圖2)。所得PRP中血小板計(jì)數(shù)P2約為外周血血小板計(jì)數(shù)P1的3.69倍(表1)。

圖2 血小板富集層(中間層)Fig 2 Platelet rich layer (the center layer)

表1 A組血小板計(jì)數(shù)Tab 1 Platelet counts in group A

1～4:Animal No.

X線檢查 通過(guò)對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)兔側(cè)位X線的測(cè)量和計(jì)算發(fā)現(xiàn),A組和D組相應(yīng)節(jié)段椎間隙高度無(wú)明顯下降,組內(nèi)各時(shí)間點(diǎn)%DHI差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。B組和C組相應(yīng)節(jié)段椎間隙高度隨時(shí)間推移均逐漸下降,組內(nèi)各時(shí)間點(diǎn)%DHI差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。在初次手術(shù)后4周(二次手術(shù)后2周)時(shí)間點(diǎn),A組與B組或C組相比,%DHI差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。A組與D組相比,%DHI差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。B組與C組相比,%DHI差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。B組或C組與D組相比,%DHI差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,表2)。

表2 不同時(shí)間點(diǎn)X線檢查所示的%DHITab 2 %DHI indicated by X-rays at different time points

T1:Before the 1stoperation; T2:4 weeks after the 1stoperation.Data were compared between the same colum respectively.(1)vs.T1,P<0.05;(2)vs.group A,P<0.05;(3)vs.group D,P<0.05.

MRI檢查 通過(guò)對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)兔矢狀位T2WI MRI影像的觀察發(fā)現(xiàn),B組和C組相應(yīng)節(jié)段椎間盤(pán)髓核信號(hào)強(qiáng)度在術(shù)后呈現(xiàn)逐漸降低趨勢(shì),髓核面積逐漸縮小,椎間隙高度也逐步下降。A組和D組相應(yīng)節(jié)段椎間盤(pán)髓核信號(hào)強(qiáng)度、髓核面積以及椎間隙高度的變化不明顯(圖3)。

根據(jù)Pfirrmann改良分級(jí)法進(jìn)行IDD分級(jí)。A組和D組內(nèi)各時(shí)間點(diǎn)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);B組和C組組內(nèi)各時(shí)間點(diǎn)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。在初次手術(shù)后4周(即二次手術(shù)后2周),A組與B組或C組相比,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);A組與D組相比,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);B組與C組相比,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);B組或C組與D組相比,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,表3)。

組織學(xué)檢查 通過(guò)對(duì)兔椎間盤(pán)的HE染色檢查發(fā)現(xiàn),隨著時(shí)間的推移,B組和C組的椎間盤(pán)組織表現(xiàn)為髓核軟骨細(xì)胞退行性變、壞死,形態(tài)不規(guī)則,分布不均勻;Masson染色顯示軟骨基質(zhì)逐步被纖維束取代;番紅O染色可見(jiàn)蛋白聚糖減少;而Ⅱ型膠原免疫組化染色則提示Ⅱ型膠原減少。A組的椎間盤(pán)組織形態(tài)與D組相比變化不明顯(圖4～7)。

圖3 不同時(shí)間點(diǎn)兔腰椎MRI圖像Fig 3 MR images of rabbit lumbar at different time points

表3 不同時(shí)間點(diǎn)MRI的IDD分級(jí)Tab 3 IDD grades of MR images at different time points (n)

圖4 初次手術(shù)后4周兔椎間盤(pán)組織的HE染色(×100)Fig 4 HE staining of rabbit intervertebral discs 4 weeks after the 1st operation (×100)

圖5 初次手術(shù)后4周兔椎間盤(pán)組織的Masson染色(×100)Fig 5 Masson staining of rabbit intervertebral discs 4 weeks after the 1st operation (×100)

圖6 初次手術(shù)后4周兔椎間盤(pán)組織的safranin O染色(×100)Fig 6 Safranin O staining of rabbit intervertebral discs 4 weeks after the 1st operation (×100)

圖7 初次手術(shù)后4周兔椎間盤(pán)組織的IHC染色(×100)Fig 7 IHC staining of rabbit intervertebral discs 4 weeks after the 1st operation (×100)

根據(jù)半定量評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行IDD分級(jí),在初次手術(shù)后4周(二次手術(shù)后2周)的時(shí)間點(diǎn),A組與B組或C組相比,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);A組與D組相比,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);B組與C組相比,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);B組或C組與D組相比,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,表4)。

表4 術(shù)后4周組織學(xué)(HE染色)的IDD分級(jí)Tab 4 IDD grades of pathology (HE staining) at the time points of 4 weeks after the 1st operation (n)

The pathological changes of nucleus pulposus were graded according to the semiquantitative criterion from the literature[7]

討 論

IDD動(dòng)物模型的建立與評(píng)價(jià)方法 建立簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、可靠、重復(fù)性好的動(dòng)物模型。以提供良好的實(shí)驗(yàn)載體,對(duì)有關(guān)IDD的發(fā)病機(jī)制和修復(fù)策略的研究具有重要意義。雖然已有報(bào)道的用于建立IDD模型的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有十余種,但由于倫理和經(jīng)濟(jì)因素等條件限制,靈長(zhǎng)類(lèi)、豬、犬等大型哺乳動(dòng)物難以大量應(yīng)用,故目前仍多以兔和大鼠作為構(gòu)建IDD模型的常規(guī)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。兔相對(duì)大鼠具有更能耐受手術(shù)創(chuàng)傷、更易獲取椎間盤(pán)及分離髓核組織等優(yōu)點(diǎn),是用于構(gòu)建IDD模型較為實(shí)用、可行的動(dòng)物。通過(guò)外科手術(shù)方法損傷纖維環(huán)引發(fā)IDD是一種廣泛應(yīng)用的建模方法。傳統(tǒng)的采用刀片直接損傷纖維環(huán)的方法可以較快引起椎間盤(pán)退變,但該方法不易控制損傷程度,所誘導(dǎo)的椎間盤(pán)退變過(guò)程往往周期短、進(jìn)展快、可重復(fù)性差。近年來(lái),Masuda等[8]提出使用普通針頭穿刺纖維環(huán)的方法建立兔IDD模型,具有操作簡(jiǎn)便、實(shí)驗(yàn)周期短、成功率高等優(yōu)點(diǎn),使用較為廣泛。通過(guò)穿刺可以直接損傷纖維環(huán),從而降低了椎間盤(pán)內(nèi)的靜水壓,繼而引起蛋白聚糖及膠原成分的改變,使得椎間盤(pán)的載負(fù)能力下降,退變進(jìn)行性加重,能比較真實(shí)地模擬人類(lèi)IDD的過(guò)程。我們已通過(guò)以往的實(shí)驗(yàn)證實(shí),采用纖維環(huán)穿刺法能成功建立IDD模型[9]。

X線能夠提供椎間盤(pán)高度降低、骨贅形成及椎間盤(pán)鈣化等病變信息,DHI是椎間盤(pán)前部、中部、后部三者高度的均數(shù)除以相鄰椎體高度均數(shù)的結(jié)果[8],是定量分析IDD程度的重要指標(biāo)。MRI能夠提供清晰的椎間盤(pán)圖像,對(duì)評(píng)估IDD非常有價(jià)值。IDD的變化反映在MRI上變現(xiàn)為,代表含水量的T2信號(hào)強(qiáng)度減弱并有椎間隙狹窄[10]。組織學(xué)方面,HE染色能夠清晰顯示各層組織結(jié)構(gòu);Masson染色可使膠原纖維呈現(xiàn)藍(lán)色,能良好顯示膠原纖維的變化;番紅O染色主要反映蛋白聚糖含量及分布情況;通過(guò)免疫組織化學(xué)染色的觀察,則可以了解Ⅱ型膠原的變化情況。正常椎間盤(pán)髓核主要由脊索細(xì)胞和軟骨樣細(xì)胞構(gòu)成;纖維環(huán)內(nèi)層主要為軟骨樣細(xì)胞,外層則為纖維樣細(xì)胞。脊索細(xì)胞在維持椎間盤(pán)的完整性和基質(zhì)的穩(wěn)定性方面發(fā)揮至關(guān)重要的作用。IDD早期出現(xiàn)脊索細(xì)胞的減少,此時(shí)軟骨樣細(xì)胞增殖試圖修復(fù)因脊索細(xì)胞減少引起的退變,這種修復(fù)進(jìn)程一旦失敗,則隨著退變的進(jìn)展,基質(zhì)和軟骨樣細(xì)胞也逐漸減少;到了IDD晚期,髓核被纖維軟骨替代并伴有周?chē)鷱V泛的骨贅形成[11]。

IDD的分子機(jī)制與生物學(xué)治療策略 IDD的分子機(jī)制十分復(fù)雜,涉及到基因變異、細(xì)胞衰老、細(xì)胞外基質(zhì)改變、降解酶生成增加、促炎因子表達(dá)、細(xì)胞凋亡、神經(jīng)內(nèi)生長(zhǎng)等多個(gè)方面[2,12]。基因變異作為IDD的危險(xiǎn)因素已得到廣泛證實(shí),目前已發(fā)現(xiàn)了部分可能與IDD進(jìn)程相關(guān)的基因類(lèi)型。通過(guò)對(duì)衰老相關(guān)酶的研究和對(duì)端粒長(zhǎng)度的測(cè)量,發(fā)現(xiàn)在退變的椎間盤(pán)中細(xì)胞會(huì)加速衰老,壓力誘導(dǎo)性早發(fā)衰老(stress-induced premature senescence,SIPS)可能是加速細(xì)胞衰老的原因。在退變的椎間盤(pán)中,最初Ⅱ型膠原合成會(huì)出現(xiàn)短暫代償性上升,隨后Ⅱ型膠原和Ⅸ型膠原的合成速度都會(huì)加速下降。基質(zhì)合成下降伴隨著膠原交聯(lián)的減少,進(jìn)而影響髓核結(jié)構(gòu)的完整性。反之,Ⅰ型和Ⅹ型膠原的表達(dá)增加,導(dǎo)致髓核纖維化,髓核和纖維環(huán)分界不清。隨著IDD進(jìn)展,可能在細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生和修復(fù)過(guò)程中發(fā)揮作用的多種蛋白聚糖的表達(dá)也出現(xiàn)下降。細(xì)胞外基質(zhì)生成減少與退變的椎間盤(pán)細(xì)胞中降解酶生成增加有關(guān)。基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)家族不僅直接減少基質(zhì)生成,還通過(guò)激活其他潛在酶間接引起IDD。帶有血小板凝血酶敏感蛋白樣模體的解整鏈蛋白金屬蛋白酶家族在正常椎間盤(pán)中表達(dá),在退變椎間盤(pán)中表達(dá)增加,提示其可能具有穩(wěn)定活性,正常狀態(tài)下維持基質(zhì)代謝,在退變椎間盤(pán)中加速基質(zhì)降解。促炎因子通過(guò)刺激椎間盤(pán)細(xì)胞產(chǎn)生炎性介質(zhì),從而在IDD進(jìn)程中間接發(fā)揮作用。白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-1是在椎間盤(pán)中表達(dá)的典型炎癥因子。在正常椎間盤(pán)中,IL-1的激活受體IL-1RI和抑制受體IL-1Ra處于平衡狀態(tài),而在退變椎間盤(pán)中,平衡狀態(tài)被打破,產(chǎn)生抑制細(xì)胞外基質(zhì)生成、促進(jìn)降解酶生成、建立正反饋促進(jìn)炎癥因子生成、間接啟動(dòng)細(xì)胞凋亡等作用。腫瘤壞死因子α(tissue necrosis factor-alpha,TNF-α)在退變椎間盤(pán)中的表達(dá)增加,其對(duì)代謝通路的影響方式與IL-1有相似之處,但引起疼痛的作用更加突出。正常代謝狀態(tài)下椎間盤(pán)細(xì)胞結(jié)構(gòu)的衰退,一定程度上是由細(xì)胞凋亡或稱(chēng)程序性細(xì)胞死亡(programmed cell death,PCD)引起的。在退變的椎間盤(pán)中,進(jìn)入PCD的細(xì)胞比率明顯升高,這可能是繼發(fā)于多種機(jī)械因素或者生化因素的刺激。正常的椎間盤(pán)內(nèi)無(wú)神經(jīng)血管生長(zhǎng),而在退變的椎間盤(pán)中,可見(jiàn)神經(jīng)血管沿著外層纖維環(huán)的裂隙向內(nèi)生長(zhǎng),這些游離的神經(jīng)末梢可通過(guò)釋放神經(jīng)遞質(zhì)P介導(dǎo)疼痛。正是基于對(duì)IDD分子機(jī)制認(rèn)識(shí)的不斷深入,國(guó)內(nèi)外學(xué)者陸續(xù)提出了椎間盤(pán)細(xì)胞移植、干細(xì)胞移植、疼痛椎間盤(pán)去神經(jīng)支配、注射治療蛋白、基因治療等生物學(xué)策略,但此類(lèi)方法目前大多仍處于起步階段[2]。

PRP修復(fù)IDD的機(jī)制與優(yōu)點(diǎn) 近年來(lái),有關(guān)PRP在骨、軟骨、肌肉、肌腱等組織再生過(guò)程中的作用得到廣泛關(guān)注,使其成為骨科、整形外科等領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[4]。目前國(guó)內(nèi)外有關(guān)PRP對(duì)IDD修復(fù)作用的研究仍局限于細(xì)胞試驗(yàn)和小型動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。Akeda等[13]經(jīng)體外實(shí)驗(yàn)研究PRP對(duì)豬椎間盤(pán)細(xì)胞的蛋白聚糖和膠原合成的影響,發(fā)現(xiàn)PRP能有效地刺激細(xì)胞增殖和細(xì)胞外基質(zhì)代謝,其對(duì)外層纖維環(huán)細(xì)胞的作用比對(duì)髓核細(xì)胞更明顯。Nagae等[14]和Sawamura等[15]針對(duì)PRP對(duì)IDD的修復(fù)作用,應(yīng)用部分髓核摘除的兔IDD模型進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示,單純PRP可抑制椎間盤(pán)的進(jìn)行性退變,而PRP結(jié)合明膠凝膠微球則可顯著抑制IDD,與對(duì)照組相比,MRI影像可見(jiàn)椎間盤(pán)高度顯著增加,組織學(xué)檢查可見(jiàn)蛋白聚糖核心蛋白以及Ⅱ型膠原蛋白表達(dá)均增加。考慮到髓核摘除建立IDD模型的損傷程度嚴(yán)重,因此需要明膠凝膠微球作為PRP的載體,以延長(zhǎng)作用時(shí)間、提供力學(xué)支持,充分發(fā)揮其治療作用。

PRP修復(fù)IDD的具體機(jī)制目前尚未明確,可能與其包含的多種生長(zhǎng)因子和其他細(xì)胞因子調(diào)控細(xì)胞功能、改善組織微環(huán)境、促進(jìn)修復(fù)再生有關(guān)。PRP含有轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF-β1和β2)、血小板源性生長(zhǎng)因子(PDGF-AA、-AB和-BB)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF A和C)、胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF-1)和表皮生長(zhǎng)因子(EGF)等在內(nèi)的多種生長(zhǎng)因子[4]。Chen等[16]研究表明,補(bǔ)充TGF-β1,尤其是劑量達(dá)到30 ng/mL時(shí),能顯著提高椎間盤(pán)髓核細(xì)胞生存能力、促進(jìn)細(xì)胞增殖。Chen等[17]認(rèn)為,TGF-β1介導(dǎo)的細(xì)胞通路可以特異性的激活磷酸化Smad2/3蛋白,上調(diào)包括Sox9、Ⅱ型膠原和蛋白聚糖在內(nèi)的促軟骨形成基因的表達(dá),而PRP對(duì)Smad2/3蛋白磷酸化的激活作用比單純的TGF-β1更強(qiáng)。Konttinen等[18]認(rèn)為T(mén)GF-β和EGF具有較強(qiáng)的促增殖作用,而在退變的椎間盤(pán)中未能檢測(cè)到TGF-β和EGF的表達(dá),提示EGF在抑制IDD進(jìn)程中可能發(fā)揮作用。Gruber等[19]研究證實(shí),50～500 ng/mL的IGF-1或100 ng/mL的PDGF都能顯著減少椎間盤(pán)內(nèi)凋亡細(xì)胞的比例。由此可見(jiàn),PRP對(duì)IDD的修復(fù)作用可能是多種生長(zhǎng)因子共同參與的結(jié)果。

本實(shí)驗(yàn)采用纖維環(huán)穿刺法建立IDD模型,與Nagae等[14]和Sawamura等[15]采用髓核摘除建模的研究相比,損傷程度較輕。影像學(xué)檢查的結(jié)果表明,PBS注射組和對(duì)照組的椎間盤(pán)高度均進(jìn)行性下降,椎間盤(pán)信號(hào)強(qiáng)度不斷減弱,符合IDD的過(guò)程;而PRP干預(yù)組的椎間盤(pán)高度和信號(hào)強(qiáng)度改變不明顯,提示該組實(shí)驗(yàn)兔的IDD受到抑制。組織學(xué)檢查的結(jié)果顯示,隨著時(shí)間的推移,PBS注射組和對(duì)照組的實(shí)驗(yàn)椎間盤(pán)組織病理學(xué)表現(xiàn)為髓核軟骨細(xì)胞退行性變、壞死,形態(tài)不規(guī)則,分布不均勻,蛋白聚糖及Ⅱ型膠原減少,軟骨基質(zhì)逐步被纖維束取代;而PRP干預(yù)組的椎間盤(pán)組織形態(tài)未發(fā)生顯著變化,蛋白聚糖及Ⅱ型膠原表達(dá)較PBS注射組和對(duì)照組明顯增加,說(shuō)明PRP早期干預(yù)可以抑制IDD進(jìn)程。

本研究的局限性在于,從穿刺建立IDD模型到進(jìn)行PRP注射干預(yù)的時(shí)間相對(duì)較短,雖然治療效果滿意,但對(duì)于晚期嚴(yán)重退變的椎間盤(pán),單純應(yīng)用PRP是否具有較好的治療作用還需研究。Obata等[20]報(bào)道了一項(xiàng)類(lèi)似實(shí)驗(yàn),與本研究選擇注射干預(yù)后2周進(jìn)行MRI檢查不同的是,作者選取了注射干預(yù)后8周的時(shí)間點(diǎn)再進(jìn)行MRI檢查,結(jié)果顯示雖然PRP干預(yù)組的椎間盤(pán)信號(hào)強(qiáng)度仍高于對(duì)照組,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由此可見(jiàn),單次注射PRP干預(yù)IDD是否具有持續(xù)的治療效果,目前尚不明確。另外,雖然影像學(xué)和組織學(xué)檢查提示,PRP早期干預(yù)可顯著抑制IDD,但其對(duì)椎間盤(pán)源性腰腿痛是否具有緩解作用尚不明確。同時(shí),PRP發(fā)揮作用的具體機(jī)制也有待進(jìn)一步闡明。

綜上所述,自體PRP椎間盤(pán)內(nèi)注射治療早期IDD的影像學(xué)及組織學(xué)評(píng)價(jià)滿意,與對(duì)照組相比,經(jīng)PRP干預(yù)后椎間盤(pán)高度和信號(hào)強(qiáng)度明顯恢復(fù),蛋白聚糖及Ⅱ型膠原表達(dá)明顯增加,椎間盤(pán)組織形態(tài)接近正常椎間盤(pán),說(shuō)明PRP干預(yù)可以有效抑制早期IDD進(jìn)程。

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Interentional effect of platelet-rich plasma (PRP) on a rabbit model of early-stage intervertebral disc degeneration (IDD)

GUI Ke-ke1, YU Yong-lin2△, REN Wei-min3, LI Xin4, DONG Jia-chun1, YIN Wang-ping1

(1DepartmentofOrthopaedics,3DepartmentofPathology,4DepartmentofRadiology,JinshanHospital,FudanUniversity,Shanghai201508,China;2DepartmentofOrthopaedics,HuashanHospital,FudanUniversity,Shanghai200040,China)

Objective To evaluate imaging and histological outcomes of a new approach for repair of degenerative intervertebral discs in rabbit models by annular puncture injection of autologous platelet-rich plasma (PRP) into the discs. Methods Sixteen healthy adult New Zealand white rabbits were randomly divided into 4 groups:group A,PRP intervention group (n=4); group B,phosphate buffered saline (PBS) injection group (n=4); group C,modeling group (n=4); group D,control group (n=4).Rabbits in A,B and C group were treated by intervertebral disc degeneration (IDD) models L4/5 and L5/6 by annular puncture.The intervention was repeated two weeks later.The animals in group A were administered PRP prepared from the arterial blood of rabbit ears according to a method developed by Landesberg.Next,0.1 mL PRP was injected into the discs according to models L4/5 and L5/6.Animals in group B were additionally injected with 0.1mL PBS into the same intervertebral spaces,while no further steps were taken for animals in group C.Two weeks after the second intervention,X-ray and magnetic resonance imaging (MRI) were performed.The animals were then euthanized and experimental disc tissues were removed.HE staining,Masson′s trichrome,Safranin O staining,and immunohistochemical staining of type Ⅱ collagen were performed to demonstrate the histological changes. Results All animals survived to the end of the experiment.The platelet count of PRP was approximately 3.69 times as much as that of peripheral blood.Over time,intervertebral space heights and disc signals decreased in group B and C,the differences of disc height index percentage (%DHI) and IDD classification of MRI between each time points were statistically significant (P<0.05).In group A and D,intervertebral space heights and disc signals had no significant changes,while at the time point of 4 weeks after first operation,the differences were statistically significant compared with group B and C (P<0.05).In group B and C,degeneration,necrosis,irregular,and uneven distribution of chondrocytes in the nucleus pulposus could be watched,cartilage matrix was gradually replaced by fiber bundles,proteoglycans and type Ⅱ collagen decreased.In group A and D,disc tissue morphology had no significant changes,while at the time point of 4 weeks after the first operation,the differences were statistically significant compared with group B and C (P<0.05). Conclusions The imaging and histological effects of autologous PRP injection on rabbit models of early-stage IDD are satisfactory.Early PRP intervention may effectively inhibit the progress of IDD.

platelet-rich plasma (PRP); intervertebral disc degeneration (IDD); biological therapy; rabbit

R 681.5

A

10.3969/j.issn.1672-8467.2015.02.010

2013-12-24;編輯:段佳)

上海市金山區(qū)科技創(chuàng)新基金(2012-03-05)

△Corresponding author E-mail:yuyonglin@fudan.edu.cn

*This work was supported by the Scientific and Technical Innovation Foundation of Science and Technology Commission of Jinshan District,Shanghai (2012-03-05).