幽門螺旋桿菌ATCC 43504感染BALB/c小鼠動物胃炎模型的建立及分析

劉昆梅, 劉宏鵬, 郭 樂*

1.寧夏醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院, 臨床病原微生物重點實驗室, 銀川 750004;2.寧夏醫(yī)科大學(xué)，顱腦疾病重點實驗室, 銀川 750004

幽門螺旋桿菌ATCC 43504感染BALB/c小鼠動物胃炎模型的建立及分析

劉昆梅1,2, 劉宏鵬1*, 郭 樂1,2*

1.寧夏醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院, 臨床病原微生物重點實驗室, 銀川 750004;2.寧夏醫(yī)科大學(xué)，顱腦疾病重點實驗室, 銀川 750004

利用幽門螺旋桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株建立穩(wěn)定可靠的幽門螺旋桿菌(Helicobacterpylori,Hp)感染小鼠胃炎模型對Hp疫苗研制、Hp致病機制的研究及抗Hp藥物的篩選具有重要意義。通過灌胃國際標(biāo)準(zhǔn)菌株幽門螺旋桿菌Hp ATCC 43504，構(gòu)建了BALB/c小鼠動物胃炎模型。利用小鼠胃部Hp尿素酶活性檢測、Hp的定量培養(yǎng)、PCR檢測、組織病理學(xué)等多種方法鑒定BALB/c小鼠動物胃炎模型。通過Hp診斷試劑盒檢測，造模組小鼠的胃組織能使Hp尿素酶試劑變色，呈現(xiàn)玫瑰紅色，而健康小鼠的胃組織不能使Hp尿素酶試劑變色，依舊呈現(xiàn)黃色；通過小鼠胃組織勻漿液培養(yǎng)Hp，造模組小鼠的胃組織勻漿液均可在BHI血平板長出Hp菌落，而對照組小鼠的胃組織勻漿液不能培養(yǎng)出Hp菌落；利用PCR對造模組和對照組BALB/c小鼠的胃組織進行Hp檢測，造模組小鼠胃組織可擴增出150 bp的DNA產(chǎn)物，而對照組小鼠胃組織無擴增產(chǎn)物；通過HE染色法觀察小鼠胃部病理變化和炎癥情況，與健康BALB/c小鼠比較，造模組小鼠胃粘膜和粘膜下層有大量白細(xì)胞浸潤，胃部炎癥明顯。利用國際標(biāo)準(zhǔn)菌株Hp ATCC 43504菌株成功構(gòu)建了BALB/c小鼠胃炎模型，為評價防治Hp感染藥物的效果奠定了實驗基礎(chǔ)。

幽門螺旋桿菌; 胃炎模型；小鼠

自1983 年澳大利亞學(xué)者Warren 和Marshall成功地從人胃黏膜樣品中分離到幽門螺旋桿菌(Helicobacterpylori, Hp)[1]，針對Hp 的研究一直是近20年來胃腸病學(xué)的熱點課題之一。Hp是慢性胃炎、胃潰瘍的病原菌，且與胃癌密切相關(guān)[2]。研制治療性或預(yù)防性疫苗是防治Hp感染的有效措施，但迄今尚無產(chǎn)品上市。建立穩(wěn)定可靠的動物感染模型是Hp疫苗研制的必備條件，對Hp致病機制的研究和抗Hp藥物的篩選也有重要意義。

研究者們在不同動物中篩選Hp合適的宿主，同時也嘗試用不同的菌株攻擊宿主，發(fā)現(xiàn)不同菌株在動物體內(nèi)的致病過程有所不同，用于藥物篩選和疫苗評價時的效果也有差異，從而認(rèn)識到菌株的選擇對于Hp 動物模型的成功構(gòu)建起關(guān)鍵作用。1988年，Lee等[3]從貓胃里分離到1株與Hp形態(tài)相似的細(xì)菌, 命名為貓胃螺桿菌(Helicobacterfelis,Hf)。Hf能夠自然感染無菌小鼠，引起與Hp感染人后類似的胃部炎癥發(fā)展過程。Hf 感染小鼠模型主要用于研究螺桿菌屬細(xì)菌的致病機制。然而，針對Hf 細(xì)菌的基礎(chǔ)性研究相對較少。其次，在與Hp 的比較中，只有病理進程方面的宏觀比較，缺少對二者菌株本身差異方面的認(rèn)識，使得Hf感染小鼠模型對Hp的代表性和說服力不足。1997年，Lee等[4]報道了篩選得到的一種可在小鼠胃部定植的Hp突變株，命名為Hp SS1(sydney strain)。Hp SS1菌株小鼠感染模型被用于觀察抗炎癥藥物的作用，評價Hp 獲得耐藥基因的頻率等方面的研究。

Hp SS1作為小鼠適應(yīng)菌株對Hp研究具有重要的推動作用。然而，在研究Hp SS1致病機制中，發(fā)現(xiàn)Hp SS1雖然有cag毒力島及cagA和vacA基因，但其cagA基因的功能不完整。篩選Hp SS1 的初衷是使疫苗的評價有一個公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)，但是就進入臨床研究的少數(shù)Hp疫苗來說，對小鼠有保護性的疫苗卻在人體內(nèi)缺乏保護性，似乎SS1的出現(xiàn)只是推動了Hp可以直接用于小動物模型這一進程?；诖?，本研究采用國際標(biāo)準(zhǔn)菌株Hp ATCC 43504建立了BALB/c小鼠感染模型，對感染動物胃粘膜組織的Hp尿素酶活性、Hp的培養(yǎng)、病理性變化等進行了初步研究，以期為Hp致病機制研究、篩選Hp疫苗候選抗原及安全的黏膜佐劑提供實驗材料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及培養(yǎng)基 國際標(biāo)準(zhǔn)菌株Hp 43504購自美國菌種保藏中心(ATCC)，編號為ATCC 43504。培養(yǎng)基為含8%羊血的幽門螺旋桿菌BHI培養(yǎng)基(青島海博生物技術(shù)有限公司)，培養(yǎng)時的氣體條件為5%氧氣、10%二氧化碳和85%氮氣。

1.1.2 動物 BALB/c小鼠12只，無特定病原體級別(specefic pathogen Free；SPF級)，雄性，6～8周齡，購自揚州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心。

1.2 方法

1.2.1 Hp 43504感染BALB/c小鼠動物胃炎模型的建立 結(jié)合前人研究[5,6]設(shè)計BALB/c小鼠Hp感染模型的建立方法，在感染Hp之前，首選灌胃混合抗生素溶液(氨芐青霉素10 mg/mL、慶大霉素 1.2 mg/mL、阿奇霉素10 mg/mL)；12只BALB/c小鼠，0.3 mL/只，1 次/d，共3 d。灌胃混合抗生素一周后，6只小鼠灌胃0.3 mL新鮮培養(yǎng)的Hp(1×109CFU/mL)；6只小鼠灌胃0.3 mL生理鹽水，作為陰性對照。

1.2.2 Hp 43504感染BALB/c小鼠動物胃炎模型的鑒定 ①Hp尿素酶活性的檢測。取一條小鼠胃組織，加入500 μL Hp尿素酶試劑(胃幽門螺旋桿菌診斷試劑盒)，混勻，室溫孵育4 h，觀察Hp尿素酶試劑顏色變化。

② Hp的定量培養(yǎng)。根據(jù)參考文獻設(shè)計實驗方法[7,8]如下：稱取一定重量的小鼠胃組織，用生理鹽水沖去內(nèi)容物，在0.5 mL生理鹽水中制備組織均漿液，吸取20 μL組織均漿液，按照1∶10、1∶100和1∶1 000比例稀釋。每個稀釋度各取100 μL均勻涂布在BHI血平板上，37℃，微需氧(10% CO2、5% O2、85% N2)培養(yǎng)3～5 d。用Hp診斷試劑盒等方法鑒定Hp菌落。

③PCR檢測。Hp 16S rRNA的DNA大小為154 bp，根據(jù)Thoreson等[9]的結(jié)果設(shè)計引物：P1-Hp 16S：5′-TTTGTTAGAGAAGATAATGACGGTATCTAAC-3′，P2-Hp 16S：5′-CATAGGATTTCACACCTGACTGACTATC-3′。PCR反應(yīng)體系為(50 μL)：模板DNA 5 μL，10×Buffer 5 μL，dNTP體系濃度為200 μmol/L，MgCl2體系濃度為2.5 mmol/L，引物P1-Hp 16S和P2-Hp 16S的體系濃度為2.5 μmol/L，Taq酶1.25 U。PCR反應(yīng)程序：94℃ 5 min；94℃ 1 min，60℃ 1 min，72℃ 1 min，30個循環(huán)；72℃ 10 min。

④ 組織病理學(xué)檢測。用石蠟包埋經(jīng)10% 甲醛固定的小鼠胃組織，切成約6 μm厚的組織切片，通過HE染色法觀察胃組織炎癥情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 Hp尿素酶活性鑒定

幽門螺旋桿菌可產(chǎn)生大量Hp尿素酶，尿素酶可以分解尿素產(chǎn)生氨，pH升高，使酚紅指示劑變色。小鼠胃部Hp尿素酶活性間接反映了幽門螺旋桿菌在小鼠胃部的感染狀況。幽門螺旋桿菌感染BALB/c小鼠40 d后，處死2只小鼠，縱向剪取一條小鼠胃組織，按照胃Hp診斷試劑盒說明書操作，鑒定BALB/c小鼠Hp感染模型是否構(gòu)建成功。實驗結(jié)果表明：造模組小鼠的胃組織能使Hp尿素酶試劑變色，呈現(xiàn)玫瑰紅色，說明造模小鼠胃部定植有可產(chǎn)生尿素酶的細(xì)菌，推測可能為Hp。而健康小鼠的胃組織不能使Hp尿素酶試劑變色，依舊呈現(xiàn)黃色(圖1,彩圖見圖版二)，說明陰性對照組小鼠胃部無產(chǎn)尿素酶的細(xì)菌存在，初步判斷BALB/c小鼠Hp感染模型構(gòu)建成功。

圖1 通過Hp診斷試劑盒檢測小鼠胃部Hp尿素酶活性

2.2 Hp的培養(yǎng)

利用小鼠胃組織勻漿選擇性培養(yǎng)Hp，可以反映Hp在小鼠胃部是否定植及其定植密度。由圖2(彩圖見圖版二)可見利用BHI血平板培養(yǎng)造模組小鼠胃組織勻漿，6只造模組小鼠均可培養(yǎng)出較多半透明、呈針尖狀的菌落，完全符合Hp的菌落特征；挑取菌落通過革蘭氏染色在顯微鏡下可見紫紅色彎曲狀桿菌。用牙簽挑取BHI平板上針尖狀的菌落放入胃幽門螺旋桿菌診斷試劑盒的Hp診斷試劑中(圖3,彩圖見圖版二)，進一步鑒定所培養(yǎng)出的菌落能否產(chǎn)尿素酶，實驗表明：BHI血平板上的菌落可使Hp尿素酶試劑變成玫瑰紅色，說明所培養(yǎng)的細(xì)菌可產(chǎn)生尿素酶，推斷其可能為Hp。而本實驗利用E.coliDH5α(本實驗室保存)作為陰性對照菌，E.coliDH5不能使Hp尿素酶試劑變色，依舊為黃色。

圖2 通過造模組小鼠胃組織勻漿培養(yǎng)Hp

圖3 通過Hp診斷試劑盒鑒定造模組小鼠胃組織培養(yǎng)出的Hp細(xì)菌

2.3 Hp的PCR鑒定

根據(jù)幽門螺旋桿菌16S rRNA編碼基因設(shè)計引物，利用PCR對造模組和對照組BALB/c小鼠的胃組織進行Hp檢測。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳可見單一的DNA片段，大小約為150 bp，與理論值一致(圖4)。將基因產(chǎn)物送交金斯瑞生物科技有限公司測序，序列與理論序列完全一致。結(jié)合造模組小鼠胃部Hp尿素酶檢測和小鼠胃組織勻漿Hp選擇性培養(yǎng)的結(jié)果，可以斷定Hp感染小鼠模型構(gòu)建成功。

圖4 造模組小鼠胃組織的Hp鑒定

2.4 小鼠胃部組織病理學(xué)鑒定

幽門螺旋桿菌定植胃部，可導(dǎo)致胃部發(fā)生炎癥反應(yīng)，長時間定植可導(dǎo)致胃潰瘍乃至胃癌的發(fā)生。用肉眼觀察造模組小鼠胃部，有2只小鼠胃組織呈現(xiàn)潰瘍病變，進一步用甲醛固定和石蠟包埋胃組織，切成 6 μm厚的組織切片，通過HE染色法觀察小鼠胃部病理變化和炎癥情況。與健康BALB/c小鼠比較，造模組6只小鼠的胃黏膜和黏膜下層均有大量白細(xì)胞浸潤，胃部炎癥明顯，說明Hp的定植導(dǎo)致小鼠胃部炎癥病變(圖5，彩圖見圖版三)。

圖5 造模組(A)和對照組(B)小鼠胃組織病理學(xué)分析

3 討論

幽門螺旋桿菌是慢性胃炎、消化性潰瘍的主要致病因素，與胃腺癌和胃淋巴瘤密切相關(guān)[10]，世界衛(wèi)生組織(World Health Organization,WHO)已將其列為一類致癌物，Hp 感染動物模型的研究具有重要的臨床意義。Hp的自然宿主是人[9]和非人靈長類，宿主譜狹窄，最初人們在傳統(tǒng)小型嚙齒類實驗動物中人工感染Hp均未獲得成功。Hp動物模型的缺乏一度成為疫苗研究的限制因素 。目前已建立的Hp感染動物模型主要有無菌乳豬、屏障飼養(yǎng)小豬、普通飼養(yǎng)小豬、小獵犬，嚙齒類動物如無菌或SPF 級的豚鼠、BALB/c 小鼠、裸鼠、沙鼠和ICR小鼠等[12]。

Hp動物模型的建立主要與宿主的特異性有關(guān), 對Hp相當(dāng)敏感的動物有豬、犬、沙土鼠和豚鼠等。另外，Hp菌株的選擇也十分重要。1990 年Lee等從貓胃中分離出與人Hp相似的貓螺旋桿菌(Helicobacterfelis,Hf)，并將其感染無菌小鼠獲得成功[13]。但是Hf和Hp之間還是存在著較多本質(zhì)性的區(qū)別。早期有報道利用Hf 感染小鼠模型篩選Hp疫苗，但小鼠對Hp的低易感性與Hf 能自然感染小鼠的差別排除了被應(yīng)用的可能，且有研究證明以Hp 的外膜蛋白成分作免疫原并不能使小鼠獲得對Hf的免疫保護能力，說明Hf和Hp感染小鼠過程中的免疫反應(yīng)存在差異。其次，Hp能夠粘附于胃上皮細(xì)胞，而Hf不能；Hp有與致病性緊密相關(guān)的CagA和VacA蛋白，而Hf沒有CagA和VacA蛋白。1997年，Lee等[4]利用一種Hp的突變株(Hp SS1)建立了BALB/c和C57BL/6小鼠感染模型。Hp SS1感染率高、結(jié)果穩(wěn)定、病理檢查有類似人胃炎的病變，成為構(gòu)建Hp感染動物模型的理想菌株。但是，在研究Hp SS1 致病機制的過程中, 發(fā)現(xiàn)Hp SS1的cagA基因的功能不完整。篩選Hp SS1的初衷是使Hp疫苗的評價有一個公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)，但是就臨床使用過的少數(shù)疫苗來說，對小鼠有保護性的Hp疫苗在人體卻缺乏保護性，似乎Hp SS1的出現(xiàn)只是推動了Hp可以直接用于小動物模型這一進程。因此，利用非突變的國家標(biāo)準(zhǔn)Hp菌株建立動物模型具有重要意義。

為了提高國際標(biāo)準(zhǔn)菌株Hp ATCC 43504感染BALB/c小鼠的成功幾率，本研究首先灌胃混合抗生素，清除BALB/c小鼠胃部細(xì)菌，破壞小鼠胃腸道細(xì)菌微生態(tài)平衡，增加Hp在小鼠胃部的定植幾率。有研究報道利用50%酒精也可破壞胃環(huán)境，便于Hp在小鼠胃部的定植，但是酒精并不能徹底清除小鼠胃部已定植的細(xì)菌[14]。若僅用小鼠胃部勻漿Hp培養(yǎng)的方法來檢測是否感染Hp，檢出率往往較低。Hp是一種微需氧細(xì)菌，對培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件有較高的要求。當(dāng)周圍環(huán)境不利于細(xì)菌的生長時，如小鼠胃部感染其他細(xì)菌、培養(yǎng)期間與空氣接觸、溫度不恒定、培養(yǎng)基pH升高等，都會導(dǎo)致Hp產(chǎn)生變異體或不生長。其次，培養(yǎng)期間濕度掌握不好，很容易感染霉菌，給Hp菌落的判斷帶來困難。本研究利用國際標(biāo)準(zhǔn)菌株成功構(gòu)建Hp感染小鼠模型，為Hp治療藥物篩選、預(yù)防性或治療性Hp疫苗的研究及Hp致病機理探討奠定了實驗基礎(chǔ)。

[1] Czinn S J, Blanchard T. Vaccinating againstHelicobacterpyloriinfection [J]. Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol., 2011, 8: 133-140.

[2] Luther J, Kao J Y. Considering global vaccination againstHelicobacterpylori[J]. South Med. J., 2010, 103: 185-186.

[3] Lee A, Fox J G, Otto G, Murphy J. A small animal model of human Helicobacter pylori active chronic gastritis [J]. Gastroenterology,1990, 99(5): 1315-1323.

[4] Lee A, O’Rourke J, De Ungria M C,etal.. A standardized mouse model ofHelicobacterpyloriinfection: Introducing the Sydney strain [J]. Gastroenterology, 1997,112:1386-1397.

[5] Zhou W Y, Shi Y, Wu C,etal.. Therapeutic efficacy of a multi-epitope vaccine againstHelicobacterpyloriinfection in BALB/c mice model [J]. Vaccine, 2009, 27:5013-5019.

[6] Zhao W, Wu W, Xu X. Oral vaccination with liposome-encapsulated recombinant fusion peptide of urease B epitope and cholera toxin B subunit affords prophylactic and therapeutic effects againstH.pyloriinfection in BALB/c mice [J]. Vaccine, 2007, 25: 7664-7673.

[7] Guo L, Yin R, Liu K,etal.. Immunological features and efficacy of a multi-epitope vaccine CTB-UE againstH.pyloriin BALB/c mice model [J]. Appl. Microbiol. Biotechnol., 2014, 98:3495-3507.

[8] Guo L, Liu K, Zhao W,etal.. Immunological features and efficacy of the reconstructed epitope vaccine CtUBE againstHelicobacterpyloriinfection in BALB/c mice model [J]. Appl. Microbiol. Biotechnol., 2013, 97: 2367-2378.

[9] Thoreson A C, Borre M B, Andersen L P,etal.. Development of a PCR-based technique for detection ofHelicobacterpylori[J]. FEMS Immunol. Med. Microbiol., 1995,10: 325-333.

[10] Yamaoka Y, Graham D Y.Helicobacterpylorivirulence and cancer pathogenesis [J]. Future Oncol., 2014,10:1487-1500.

[11] Covacci A, Telford J L, Del Giudice G,etal..Helicobacterpylorivirulence and genetic geography [J]. Science, 1999, 284:1328-1333.

[12] Hoffelner H, Rieder G, Haas R.Helicobacterpylorivaccine development: optimisation of strategies and importance of challenging strain and animal model [J]. Int. J. Med. Microbiol., 2008, 298: 151-159.

[13] Mendes E N, Queiroz D M, Rocha G A,etal.. Histopathological study of porcine gastric mucosa with and without a spiral bacterium (Gastrospirillumsuis) [J]. J. Med. Microbiol., 1991,35:345-348.

[14] 王毅超,郭 剛,劉開云,等.不同預(yù)處理方法建立幽門螺桿菌感染動物模型的比較[J]. 中國生物制品學(xué)雜志,2002,15:292-294.

Establishment and Analysis of Gastritic Model ofHelicobacterpyloriATCC 43504 Infection in BALB/c Mice

LIU Kun-mei1,2, LIU Hong-peng1*, GUO Le1,2*

1.KeyLaboratoryofClinicalPathogenicMicroorganisms,ClinicalMedicalCollege,NingxiaMedicalUniversity,Yinchuan750004,China;2.NingxiaKeyLaboratoryofCerebrocranialDiseases,NingxiaMedicalUniversity,Yinchuan210009,China

The establishment of stable and reliable mouse gastritic model usingHelicobacterpylori(Hp) standard strains has important significance in the research of Hp vaccine development, Hp pathogenesis and screening of anti-Hp drugs. In this study, the BALB/c mouse gastritic models were constructed by international standard strain Hp ATCC 43504. Then the BALB/c mouse gastritic models were analyzed by Hp urease activity detection, Hp quantitative culture, PCR detection and histopathological staining methods. The mice gastric tissues from BALB/c mouse gastritic models could make Hp urease reagent appear rose red by analysis of Hp diagnostic kit. But mice gastric tissues from control group could not enable Hp change color and still appear yellow. Hp could grow up at BHI blood plate by Hp quantitative culture using gastric homogenate from BALB/c mouse gastritic models, but Hp could not emerge at BHI blood plate by Hp quantitative culture using gastric homogenate from control group. 150 bp DNA products could be amplified from gastric tissue of BALB/c mice in the model group by PCR, while the control group was no amplification products. HE staining method was used to observe the pathological changes and inflammation in mice. Compared with BALB/c mice from the control group, there was a large number of white blood cell infiltration in the gastric mucosa from the model group. BALB/c mouse gastritic models were constructed using Hp ATCC 43504, which could be used to evaluate the effect of the drug on the prevention and treatment of Hp infection.

Helicobacterpylori; gastritic model; mice

2015-08-09; 接受日期：2015-08-26

寧夏自然科學(xué)基金項目(NZ14089)資助。

劉昆梅，講師，研究方向生物技術(shù)藥學(xué)。E-mail：lkm198507@126.com。*通信作者：劉宏鵬，講師，研究方向為基因工程疫苗。E-mail:yangliang1027@163.com。郭樂，副教授，博士，研究方向為基因工程疫苗。E-mail:gouletian1982@163.com

10.3969/j.issn.2095-2341.2015.06.08