不同酶制劑對烤煙上部葉化學(xué)成分、游離態(tài)和糖苷結(jié)合態(tài)中性香氣成分的影響

王 林, 朱金峰, 許自成*, 張景華

1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院, 鄭州 450002;2.河南省煙草公司漯河市公司, 河南 漯河 462000

不同酶制劑對烤煙上部葉化學(xué)成分、游離態(tài)和糖苷結(jié)合態(tài)中性香氣成分的影響

王 林1, 朱金峰2, 許自成1*, 張景華1

1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院, 鄭州 450002;2.河南省煙草公司漯河市公司, 河南 漯河 462000

為研究酶制劑對烤煙上部葉品質(zhì)提升的影響，以中煙100為材料，采用烘烤前葉面噴施酶制劑的方法，分析了不同酶制劑對烤煙上部葉化學(xué)成分、游離態(tài)和糖苷結(jié)合態(tài)中性香氣成分的影響。結(jié)果表明：不同酶制劑能不同程度的降低烤煙的蛋白質(zhì)含量，改善煙葉化學(xué)成分，提高游離態(tài)和糖苷結(jié)合態(tài)中性香氣成分的含量；噴施酶制劑對煙葉蛋白質(zhì)、總糖、還原糖、總氮均有顯著的影響，而對烤煙鉀、氯的影響則未達(dá)到顯著水平；混和噴施酶制劑相對于單獨噴施酶制劑對煙葉品質(zhì)的影響更顯著。

烤煙；酶制劑；蛋白質(zhì)；化學(xué)成分；游離態(tài)；糖苷結(jié)合態(tài)

煙草是一種經(jīng)濟(jì)作物，煙葉的內(nèi)在品質(zhì)直接決定了煙葉的可用性及等級高低[1]。煙葉必須經(jīng)過烘烤才能顯現(xiàn)、固定并改善其在田間形成的品質(zhì)質(zhì)量，最終成為商品煙葉[2,3]。調(diào)制是煙草加工過程中提高其品質(zhì)的一個重要環(huán)節(jié)，主要為煙葉內(nèi)含物質(zhì)的轉(zhuǎn)化過程，其中酶起著關(guān)鍵性作用[4～7]。國內(nèi)某些產(chǎn)區(qū)的上部葉品質(zhì)較差，可用性低，造成煙葉的大量浪費。由于煙葉本身的內(nèi)源酶和酶含量較少，單純依靠烘烤過程中煙葉自身酶的作用不足以在短時間內(nèi)把煙葉中不協(xié)調(diào)的成分充分轉(zhuǎn)化，使品質(zhì)得到改善，從而滿足工業(yè)生產(chǎn)對于煙葉品質(zhì)的需求[8,9]。因此適當(dāng)?shù)氖┘右恍┟钢苿┛赡軙绊憻熑~主要化學(xué)成分的含量，使煙葉內(nèi)在成分比例更協(xié)調(diào)合理，從而改善煙葉在田間生長發(fā)育過程中由于一些營養(yǎng)缺失導(dǎo)致的品質(zhì)降低，從本質(zhì)上提高煙葉的等級并改善品質(zhì)。目前，國內(nèi)已展開了許多關(guān)于外加酶提高煙葉品質(zhì)的研究，但研究多集中在利用外加酶在煙葉發(fā)酵過程中的作用來改善煙葉質(zhì)量方面[10～13]，而在煙葉烘烤階段利用外加酶的研究不多。本文研究了烘烤前噴施不同種類的酶制劑對上部葉化學(xué)成分、游離態(tài)和糖苷結(jié)合態(tài)中性香氣成分的研究，探索了酶制劑在煙葉品質(zhì)提高方面的優(yōu)勢，以及酶制劑通過煙葉內(nèi)部代謝的影響，在煙葉調(diào)制過程中內(nèi)含物質(zhì)和色、香、味的充分轉(zhuǎn)化方面的作用，分析比較了其變化規(guī)律和作用機制，以期為提高上部葉可用性提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2014年在河南省漯河市李集鎮(zhèn)煙草科技示范園進(jìn)行。實驗用品種為中煙100。所用煙葉為上部葉(第16、18位置葉片)。酶制劑：中性蛋白酶(酶活力60 000 U/g)；α-淀粉酶(酶活力3 700 U/g)；糖化酶(酶活力10 000 U/g)。試驗田土壤肥力中等，按當(dāng)?shù)厥┓柿亢侠硎┓省?/p>

1.2 試驗方法

將酶制劑按照表l的處理與適量蒸餾水混勻，烘烤前用噴霧器將酶制劑均勻地噴灑于上部葉正反面，對照處理以等量蒸餾水代替。煙葉處理后在陰暗處放置6 h，隨后進(jìn)行烘烤。

表1 酶處理條件

1.3 指標(biāo)測試

1.3.1 烤后樣品化學(xué)成分測定 可溶性蛋白采用考馬斯亮蘭法測定[14]；煙葉化學(xué)成分檢測指標(biāo)參照王瑞新等[15]的方法進(jìn)行。

1.3.2 游離態(tài)和糖苷結(jié)合態(tài)香氣物質(zhì)的分析測定方法 游離態(tài)香氣物質(zhì)用GC/MC法測定烤后煙葉在二氯甲烷中的萃取物，再由國家煙草栽培生理生化研究基地進(jìn)行測試[16]。糖苷結(jié)合態(tài)香氣物質(zhì)的測定包括糖苷類物質(zhì)的分離和UPLC-MS/MS分析樣品的制備，測定方法參考吳新華等[17]的方法進(jìn)行。

1.4 儀器分析條件

1.4.1 GC-MS分析條件 色譜柱：PE-5MS毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm，美國PE公司)；進(jìn)樣口溫度：250℃；程序升溫：50℃保持2 min，再以4℃/min的速率升至250℃；載氣：氦氣(He)；流速：1 mL/min；進(jìn)樣量：1 μL；分流比：30∶1。電子轟擊(EI)離子源；電離能量：70 eV；離子源溫度：170℃；傳輸線溫度：250℃；溶劑延遲時間：4 min；掃描范圍：35～350 m/z。

1.4.2 UPLC-MS/MS分析條件 色譜條件：Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流速：1.0 mL/min，柱溫為室溫，檢測波長：254 nm，進(jìn)樣量：5 μL，流動相A相：0.1%甲酸-甲酸銨水溶液;B相：甲醇;C相：乙腈，梯度洗脫程序如表2所示。

表2 梯度洗脫程序

質(zhì)譜條件：ESI離子源，毛細(xì)管電壓：3 500 V，干燥氣溫度350℃，干燥氣流速10.0 L/min，霧化氣壓力50.0 psi。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同酶制劑處理對烤煙上部葉蛋白質(zhì)含量的影響

蛋白質(zhì)是一類性質(zhì)相對穩(wěn)定的復(fù)雜高分子含氮化合物，優(yōu)質(zhì)煙葉的蛋白質(zhì)含量應(yīng)<10%，含量過高煙葉吸味差、刺激性強，影響煙葉的香味品質(zhì)和安全性[18]。從表3均值分析，各處理相對于對照D1均有不同程度的提高，增幅表現(xiàn)為D5>D2>D3>D4。D2、D5處理對烤煙蛋白質(zhì)的影響達(dá)到顯著差異(P<0.05)，D3、D4的影響不顯著(P>0.05)。說明酶制劑混合施用的效果最好，其次為中性蛋白酶，但單獨噴施糖化酶和α-淀粉酶無不利影響。

表3 不同酶制劑處理對烤煙上部葉蛋白質(zhì)含量的差異分析

注：表中數(shù)字為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，同行數(shù)據(jù)后的不同字母表示在P<0.05水平上差異顯著。

2.2 不同酶制劑對烤煙上部葉化學(xué)成分的影響

如表4所示，相對于對照，D2、D3、D4、D5的煙堿、總糖、還原糖、總氮、鉀含量均有提高，氯含量均有不同程度的減少。說明酶制劑可能在煙葉的烘烤過程中發(fā)揮作用，消耗或是轉(zhuǎn)化存在于煙葉中的某些成分，使煙葉化學(xué)成分更協(xié)調(diào)。從方差分析結(jié)果(表4、表5)看出，D5對烤煙煙葉的煙堿、總糖、還原糖、總氮、氮堿比、鉀氯比含量有顯著的影響(P<0.05)，D2、D3、D4對烤煙煙葉的還原糖、總氮含量有顯著影響，使煙葉化學(xué)成分更加協(xié)調(diào)；D3對烤煙煙葉總糖含量的影響顯著，可能與酶制劑能夠促進(jìn)蛋白質(zhì)和淀粉降解轉(zhuǎn)化為可溶性糖有關(guān)。

表4 不同酶制劑處理對烤煙上部葉化學(xué)成分含量的差異分析

注：表中數(shù)字為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，同列數(shù)據(jù)后的不同字母表示P<0.05水平上差異顯著。

表5 不同酶制劑處理對烤煙上部葉常規(guī)化學(xué)成分比值的差異分析

注：表中數(shù)字為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，同列數(shù)據(jù)后的不同字母表示P<0.05水平上差異顯著。

2.3 不同酶制劑對烤煙上部葉游離態(tài)中性香氣物質(zhì)的影響

圖1和圖2表明，D2、D3、D4、D5的香味物質(zhì)含量相對于對照D1的香味物質(zhì)含量均有增加，且通過比較3種酶制劑對中性香氣物質(zhì)的增加量，發(fā)現(xiàn)混合噴施酶制劑的作用效果最好。煙葉的美拉德反應(yīng)是指氨基酸和糖類發(fā)生的一類非酶棕色化反應(yīng)，試驗中D5的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物最高，其次為中性蛋白酶。新植二烯是煙草中性致香物質(zhì)中重要的增香劑，不僅本身具有香甜氣，又能氧化分解為呋喃等醇香味香氣物質(zhì)，直接影響煙草的香型風(fēng)格[19]。D5的新植二烯總量最高，且α-淀粉酶含量明顯優(yōu)于其他3個處理。

圖1 酶制劑對烤后煙葉苯丙氨酸類、美拉德反應(yīng)產(chǎn)物和類西柏烷類含量的影響

2.4 不同處理對烤煙上部葉糖苷結(jié)合態(tài)中性香氣物質(zhì)的影響

通過采用UPLC-MS/MS分析法，定性定量分析了所測樣品中的糖苷類香氣前體物質(zhì)的含量。對正負(fù)離子的多級質(zhì)譜圖進(jìn)行分析，推測9種糖苷類前體物質(zhì)其化學(xué)結(jié)構(gòu)分別鑒定為紫羅蘭醇-β-D-葡萄糖苷和其同分異構(gòu)體、新綠原酸和其同分異構(gòu)體、綠原酸和其同分異構(gòu)體、隱綠原酸、蕓香苷和山奈酚-3-蕓香糖苷[20～23]。進(jìn)而根據(jù)液相色譜圖和質(zhì)譜圖的保留時間進(jìn)行了相對含量的分析，發(fā)現(xiàn)不同酶制劑處理的糖苷類香氣前體物質(zhì)的總量表現(xiàn)為：D5最高，D2次之，說明D5處理對糖苷前體類物質(zhì)的影響最大。糖苷類香氣前體物質(zhì)中蕓香苷的含量明顯高于其他物質(zhì)，D5處理的蕓香苷含量最高。D3的紫羅蘭醇-β-D-葡萄糖苷和其同分異構(gòu)體、隱綠原酸的含量較高，且與其他處理存在顯著差異，說明α-淀粉酶對此類糖苷類物質(zhì)影響較大。D2的新綠原酸和其同分異構(gòu)體的含量較高，且新綠原酸的同分異構(gòu)體與其他處理結(jié)果相比說明中性蛋白酶對此類糖苷類物質(zhì)影響較大。D4的綠原酸和其同分異構(gòu)體的含量較高，說明糖化酶對此類糖苷類物質(zhì)影響較大。

圖2 不同酶制劑對烤后煙葉類胡蘿卜素降解產(chǎn)物、新植二烯含量的影響

表6 不同酶制劑處理對烤煙上部葉糖苷類香氣前體物質(zhì)含量的差異分析

注：表中數(shù)字為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，同行數(shù)據(jù)后的不同字母表示P<0.05水平上差異顯著。

3 討論

3.1 不同酶制劑對烤煙上部葉蛋白質(zhì)含量的影響

烘烤過程是煙葉生理生化活動反應(yīng)最為強烈的階段，也是蛋白質(zhì)降解的關(guān)鍵時期。酶制劑原理是當(dāng)煙葉細(xì)胞膜破裂，外源酶進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，將存在于煙葉中的一些內(nèi)源性大分子物質(zhì)酶解轉(zhuǎn)化成為小分子物質(zhì)，改善卷煙抽吸品質(zhì)，從而影響煙葉的使用價值。植株中的蛋白質(zhì)通過內(nèi)肽酶的作用水解為小肽，再被外肽酶分解為氨基酸[24,25]。宮長榮等[26,27]研究發(fā)現(xiàn)，蛋白酶的活性與蛋白質(zhì)的降解和氨基酸的積累有著顯著的關(guān)系。本試驗中各處理對煙葉蛋白質(zhì)均有影響，混合噴施酶制劑對煙葉蛋白質(zhì)的效果最優(yōu)，其次為中性蛋白酶，α-淀粉酶和糖化酶的影響不顯著，但對蛋白質(zhì)的降解無不利影響，且混合噴施時這兩種酶對蛋白酶都有一定的促進(jìn)作用。這與謝會雅等[28]研究得出的煙葉蛋白質(zhì)經(jīng)淀粉酶、糖化酶和蛋白酶處理后蛋白質(zhì)有所降解的結(jié)論相一致。姚光明等[29]研究了不同種類蛋白酶酶解法對煙葉蛋白質(zhì)的影響，發(fā)現(xiàn)中性蛋白酶的作用最顯著。

3.2 不同酶制劑對烤煙上部葉化學(xué)成分的影響

研究發(fā)現(xiàn)煙葉本身所含有的酶能調(diào)節(jié)自身內(nèi)含物質(zhì)的轉(zhuǎn)化，因此酶的催化能劇烈改變煙葉內(nèi)部各種化學(xué)成分的含量[30～32]。李少鵬[33]在研究煙葉化學(xué)成分和酶的關(guān)系時分析得出，陳化過程中煙葉化學(xué)成分的動態(tài)變化規(guī)律與α-淀粉酶、蛋白酶活性的動態(tài)變化規(guī)律是一致的，所以酶的活動與煙葉化學(xué)成分密切相關(guān)。本試驗結(jié)果初步顯示，噴施酶處理的烤后煙葉化學(xué)成分含量較為協(xié)調(diào)，增加了烤后煙葉中煙堿、總糖、還原糖及鉀含量，且效果顯著。中性蛋白酶處理的煙葉的煙堿、總糖和還原糖含量有增加，α-淀粉酶、糖化酶處理的煙葉總糖、還原糖含量有所提高，但效果不顯著，這與前人的研究結(jié)果一致。α-淀粉酶、糖化酶和蛋白酶混合使用的效果相對單一酶制劑的使用效果更優(yōu)，能顯著地改善煙葉內(nèi)在品質(zhì)。

3.3 不同酶制劑對烤煙上部葉中性香氣成分的影響

煙葉香氣質(zhì)量的優(yōu)劣在一定程度上取決于揮發(fā)性香氣物質(zhì)總量的多少。本試驗初步研究結(jié)果表明，相對于對照，混合噴施酶制劑的游離態(tài)中性香味物質(zhì)含量均增加最多，其次為糖化酶。各類中性香氣物質(zhì)以美拉德反應(yīng)的含量變化幅度最大，可能由于蛋白質(zhì)在酶制劑的作用下降解生成氨基酸，使反應(yīng)物增多，反應(yīng)得以充分進(jìn)行，產(chǎn)生更多的香氣物質(zhì)。糖苷類物質(zhì)以其分子量大、沸點高，本身屬于天然或者天然等同成分但不會干擾產(chǎn)品本身的香味，在陳化或燃燒過程中通過降解或裂解卻能產(chǎn)生重要的致香類物質(zhì)的特殊性質(zhì)成為現(xiàn)今改善卷煙香氣品質(zhì)的熱門方向[34]。糖苷類物質(zhì)與水溶性糖、游離態(tài)香味物質(zhì)、生物堿、色素等物質(zhì)相似的性質(zhì)，使得糖苷類物質(zhì)的定性定量分析具有一定的難度。且研究發(fā)現(xiàn)，糖苷類物質(zhì)受品種、生態(tài)條件、調(diào)制等多種因素的影響[35～39]。試驗采用超高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜分析法定性定量的鑒定了所選取煙葉中的9種糖苷類物質(zhì)，并分析了不同酶制劑處理對煙葉中糖苷類物質(zhì)含量的影響，發(fā)現(xiàn)混合噴施酶制劑對煙葉糖苷類物質(zhì)的影響較大，特別是蕓香苷含量的增幅比較大。

酶制劑的噴施對降低煙葉蛋白質(zhì)含量、協(xié)調(diào)化學(xué)成分、提高煙葉游離態(tài)和糖苷結(jié)合態(tài)中性香氣物質(zhì)含量方面具有顯著的作用，尤其以混合噴施酶制劑效果最好。而酶制劑均為酶類，本身也受溫度和濕度等多種烘烤條件的影響，如何在烘烤過程中充分發(fā)揮酶制劑的潛力，借助其體內(nèi)的物質(zhì)代謝及分泌的胞外酶，實現(xiàn)煙葉在調(diào)制過程中內(nèi)含物質(zhì)和色、香、味的充分轉(zhuǎn)化，將成為煙草行業(yè)研究的重點方向。

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Influence of Spraying Different Enzyme Preparations on Chemical Composition, Free and Glycosidic Neutral Aroma Components in Upper Leaves of Flue-cured Tobacco

WANG Lin1, ZHU Jin-feng2, XU Zi-cheng1*, ZHANG Jing-hua1

1.CollegeofTobaccoScience,HenanAgriculturalUniversity,Zhengzhou450002,China;2.LuoheBranchofHenanProvincialTobaccoCompany,HenanLuohe462000,China

In order to study the influence of different enzyme preparation on improving tobacco quality, the experiment was developed by spraying different enzyme preparation on the upper leaves of flue-cured tobacco before baking, and it made the Zhongyan100 as the material. The influence of different enzyme preparation on chemical composition, free neutral and glycosidic aroma components were analyzed. The results showed that different enzyme preparation could reduce the content of protein degradation in different degrees, improve the chemical composition of tobacco leaves, and increase the content of free neutral and glycosidic aroma components. Thus, enzyme preparation had a significant effect on protein degradation, total sugar, reducing sugar and total nitrogen of flue-cured tobacco, but its effect on potassium and chlorine of flue-cured tobacco was not significant. Above all, the mixed enzyme preparation spraying played a better role than the enzyme preparation spraying lonely.

flue-cured tobacco; enzyme preparation; protein; chemical composition; free form; glycosidic form

2015-08-31; 接受日期：2015-09-18

河南省煙草公司科技攻關(guān)項目(HYKJ201105；HYKJ201043)資助。

王林，碩士研究生，主要從事煙草栽培與質(zhì)量評價研究。E-mail:wlin128@126.com。*通信作者：許自成，教授，研究方向為煙草栽培與質(zhì)量評價研究。E-mail: zcxu@sohu.com

10.3969/j.issn.2095-2341.2015.06.10