植物表達(dá)抗原蛋白及其免疫原性的研究進(jìn)展

張怡然，張占路，唐益雄，吳燕民

(1.蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院,甘肅 蘭州 730000; 2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所,北京 100081;3.深圳市農(nóng)科集團(tuán)有限公司，廣東 深圳 518040)

植物表達(dá)抗原蛋白及其免疫原性的研究進(jìn)展

張怡然1,2，張占路3，唐益雄2，吳燕民1,2

(1.蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院,甘肅 蘭州 730000; 2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所,北京 100081;3.深圳市農(nóng)科集團(tuán)有限公司，廣東 深圳 518040)

因利用植物生物反應(yīng)器表達(dá)疾病抗原蛋白用于疫苗生產(chǎn)具有安全、廉價(jià)和易推廣等獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，現(xiàn)已成為生物技術(shù)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。本文對(duì)利用植物生物反應(yīng)器生產(chǎn)口服疫苗的研究進(jìn)展及存在的弊端如蛋白產(chǎn)量低、口服疫苗易消化降解、免疫耐受等問(wèn)題進(jìn)行了綜述，并探討了其潛在的解決辦法。

轉(zhuǎn)基因植物疫苗; 抗原蛋白; 免疫原性; 人體臨床試驗(yàn)

病原微生物與消化道、呼吸道和生殖道的表面黏膜接觸會(huì)引起人和動(dòng)物的許多疾病，如乙型肝炎、傷寒、痢疾、霍亂和胃腸炎等[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球每年死于上述傳染性疾病的人數(shù)約占總死亡人數(shù)的25%，其中發(fā)展中國(guó)家約占45%[2]，由于發(fā)展中國(guó)家缺少資金購(gòu)買醫(yī)療設(shè)備或生產(chǎn)昂貴的疫苗，患病情況更為嚴(yán)重。

疫苗在傳染性疾病防治方面起到重要作用?，F(xiàn)今使用的常規(guī)疫苗常存在許多不足，如弱毒活疫苗的毒株的毒力易反強(qiáng)，影響使用安全；滅活疫苗所引發(fā)的免疫應(yīng)答反應(yīng)程度不足。此外，傳統(tǒng)的微生物發(fā)酵和哺乳動(dòng)物生產(chǎn)重組蛋白時(shí)，周期長(zhǎng)、成本高、不易運(yùn)輸難以實(shí)現(xiàn)快速生產(chǎn)和大規(guī)模推廣[3-4]。因此，利用植物蛋白表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)安全、價(jià)廉、易推廣的轉(zhuǎn)基因植物疫苗，將發(fā)揮巨大的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

1 植物表達(dá)抗原蛋白

轉(zhuǎn)基因植物作為一種新型分子材料可應(yīng)用于生產(chǎn)各種人類所需的外源蛋白[5]。轉(zhuǎn)基因植物疫苗(Plant-based Vaccine)運(yùn)用基因工程技術(shù)，將所需表達(dá)的抗原基因整合到受體植物內(nèi)，或與病毒載體重組后轉(zhuǎn)染至植物體，利用植物自身的生命活動(dòng)復(fù)制表達(dá)目的抗原基因，繼而生產(chǎn)出可被機(jī)體吸收利用并使其產(chǎn)生特異性抗病能力的疫苗[6]。

植物抗原蛋白疫苗是隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展應(yīng)運(yùn)而生并蓬勃發(fā)展的。1973年，美國(guó)斯坦福大學(xué)的Stanley成功開發(fā)了生物轉(zhuǎn)基因技術(shù)[7]。1983年第1株轉(zhuǎn)基因植物誕生。1990年，Cutisis和Cardineau[8]用表達(dá)鏈球菌的變異表面抗原蛋白A(Surface Protein Antigen A，SPAA)的轉(zhuǎn)基因煙草(Nicotianatabacum)飼喂小鼠，并檢測(cè)到小鼠產(chǎn)生了黏膜免疫反應(yīng)，是首個(gè)報(bào)道使用轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)的抗原蛋白。1992年，Mason等[9]將乙肝病毒表面抗原HBsAg基因轉(zhuǎn)入煙草并得到表達(dá)，檢測(cè)其免疫原性類似于人血清及酵母中提取的HBsAg抗原蛋白，就此提出了轉(zhuǎn)基因植物疫苗的概念。此后人們陸續(xù)在轉(zhuǎn)基因植物中成功表達(dá)了多種抗原，使用的表達(dá)宿主包括煙草、馬鈴薯(Solanumtuberosum)、苜蓿(Medicagosativa)、胡蘿卜(Daucuscarota)、大豆(Glycinemax)、玉米(Zeamays)、水稻(Oryzasativa)等多種植物。2006年2月，美國(guó)Dow Agrosciences公司研發(fā)的煙草表達(dá)轉(zhuǎn)雞新城疫基因的植物疫苗“NEWCASTLE Concent”得到美國(guó)農(nóng)業(yè)部批準(zhǔn)[10]，是第1個(gè)被許可上市的獸用轉(zhuǎn)基因植物疫苗，推動(dòng)了轉(zhuǎn)基因植物疫苗的發(fā)展。

1.1 植物表達(dá)抗原蛋白的優(yōu)勢(shì)

利用植物外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)生成疫苗自產(chǎn)生之初即得到極大關(guān)注，正是因?yàn)樗噍^于傳統(tǒng)動(dòng)物源疫苗生產(chǎn)方式具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，如：1)成本低廉、生產(chǎn)快速、使用方便。植物外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)與酵母、昆蟲和動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)相比，培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單，蛋白無(wú)需純化，成本低廉，是最經(jīng)濟(jì)的蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)。另外，植物細(xì)胞具有全能性，可再生植株，所轉(zhuǎn)基因一旦在植物中穩(wěn)定整合便可長(zhǎng)期使用[11]；2)植物具有真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)[12]，植物蛋白表達(dá)系統(tǒng)的翻譯和加工功能不僅可對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行糖基化、酰氨化、磷酸化、亞基的裝配等，其表達(dá)產(chǎn)物可保持自然狀態(tài)下的免疫原性，且免疫原性相似于動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)物[4]；3)可啟動(dòng)黏膜免疫。植物細(xì)胞壁作為天然的生物“膠囊”，可保護(hù)服用疫苗后不受胃酸消化影響，刺激引發(fā)黏膜及全身免疫反應(yīng)[13-14]。4)安全性好。不同于動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)基因工程疫苗，植物細(xì)胞中絕對(duì)不會(huì)含有潛在的動(dòng)物或人類病源而更安全可靠；5)運(yùn)輸方便，貯存簡(jiǎn)單，對(duì)環(huán)境無(wú)污染

1.2 植物表達(dá)抗原蛋白的研究進(jìn)展

自1992年乙肝表面抗原基因在煙草中的成功表達(dá)并提出可食用植物疫苗的概念[6]，植物抗原蛋白疫苗經(jīng)過(guò)數(shù)年發(fā)展成果頗豐，目前已報(bào)道在植物中成功表達(dá)的100多種用于人或動(dòng)物的抗原蛋白疫苗(表1)。選擇這些抗原基因基于以下理由：1)研究基礎(chǔ)堅(jiān)實(shí)。特別是抗原蛋白的免疫原性和分子結(jié)構(gòu)明確；2)檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)可行。外源基因在轉(zhuǎn)基因植物中隨機(jī)整合，因此必須選擇靈敏準(zhǔn)確、可靠易行的檢測(cè)技術(shù)對(duì)轉(zhuǎn)化植株進(jìn)行篩選鑒定；此外，若進(jìn)行動(dòng)物免疫試驗(yàn)，還需檢測(cè)血清和黏膜抗體的反應(yīng)水平，因此檢測(cè)方法必須成熟可行，才能開展此項(xiàng)研究；3)應(yīng)用前景廣。植物疫苗一旦研發(fā)成功，應(yīng)用市場(chǎng)廣闊，特別適用于經(jīng)濟(jì)落后國(guó)家。

2 免疫原性研究

2.1 轉(zhuǎn)基因植物疫苗的免疫機(jī)理

黏膜免疫系統(tǒng)既是整個(gè)機(jī)體免疫的重要組成部分，又是具有獨(dú)特結(jié)構(gòu)及功能的獨(dú)立免疫體系，它在抵抗傳染病方面起著極其重要的作用，粘膜表面與外界抗原直接接觸，是機(jī)體抵抗病原體感染的第1道防線。其廣泛分布于呼吸道、消化道、泌尿生殖道粘膜下及一些外分泌腺體處的淋巴組織中，是執(zhí)行局部特異性免疫的主要場(chǎng)所。試驗(yàn)證明，通過(guò)粘膜免疫后，粘膜局部的抗體比血清抗體出現(xiàn)早、效價(jià)高且維持時(shí)間長(zhǎng)[35-37]。許多文獻(xiàn)報(bào)道，轉(zhuǎn)基因植物疫苗作用于動(dòng)物體可誘導(dǎo)機(jī)體的系統(tǒng)免疫反應(yīng)，并引發(fā)黏膜免疫反應(yīng)[38-39]。誘導(dǎo)黏膜免疫是從位于小腸淋巴組織(如Peyer’s結(jié))的粘膜上的膜細(xì)胞(M細(xì)胞)識(shí)別抗原開始的，隨后M細(xì)胞捕獲抗原，這一功能被稱為“轉(zhuǎn)胞吞作用”[40]。隨后，生物體攝取特異性的轉(zhuǎn)基因植物抗原蛋白，并誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)的血清型IgA 和IgG反應(yīng)[13]。

表1 近十年在植物中表達(dá)的抗原蛋白

續(xù)表1

抗原Antigen轉(zhuǎn)化受體Plant表達(dá)水平Expressionlevel免疫原性Immunogenicity參考文獻(xiàn)Reference猴免疫缺陷病CTB?Gag融合蛋Smianimmunodeficieneyvires(SIV)馬鈴薯S．tuberosum0．016%～0．022%TSP未進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)Havenoanimaltest[26]輪狀病毒VP7Rotavirus(RV)馬鈴薯S．tuberosum0．018%～0．384%TSP小鼠口服產(chǎn)生免疫原性和保護(hù)性Micegetimmunogenicityandprotec?tivenessafteroralvaccine[27]大腸桿菌熱不穩(wěn)定內(nèi)毒素B亞單位E．coliheat?labileenterotoxinBsubunit(LT?B)玉米Z．mays10%TSP/0．1%FW小鼠和人口服后產(chǎn)生免疫原性和保護(hù)性Miceorhumangetimmunogenicityandprotectivenessafteroralvaccine[28]霍亂弧菌Choleratoxin(CT?B)番茄L．esculentum0．04%TSP/0．002%FW小鼠和人口服后產(chǎn)生免疫反應(yīng)和保護(hù)作用Miceorhumangetimmunogenicityandprotectivenessafteroralvaccine[29]人免疫缺陷病毒核衣殼蛋白p24HIV?1p24Protein煙草N．tabacum0．35TSP/0．05%FW未進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)Havenoanimaltest[30]炭疽病抗原Anthraxantigen番茄L．esculentum0．3%TSP小鼠注射后血清中檢到抗體Miceserumdetectedantibodyatfterintramuscularinjection[31]人乳頭瘤病毒HPV?16L1基因HPV?16L1capsidproteingene煙草N．tabacum11%TSP小鼠肌肉注射接種產(chǎn)生免疫反應(yīng)Micegetimmunogenicityafterintra?muscularinjection[32]麻風(fēng)病毒血凝素抗原蛋白Lepriasisvirushemagglutininproteinantigen胡蘿卜Daucuscarota小鼠口服產(chǎn)生免疫原性和保護(hù)性Micegetimmunogenicityandprotec?tivenessafteroralvaccine[33]lL?4和hGAD65基因Glutamicaciddecarboxylase(GAD)andIL?4馬鈴薯S．tuberosum聯(lián)合使用可預(yù)防小鼠糖尿病Conjunctiveusecanpreventmicedi?abetes[34]

注：TSP，總可溶性蛋白；FW，鮮重。

Note: TSP, total soluble protein; FW, fresh weight.

轉(zhuǎn)基因植物疫苗以口服為最終目的，而口服免疫成功的關(guān)鍵在于口服抗原經(jīng)過(guò)消化道時(shí)可誘導(dǎo)粘膜免疫系統(tǒng)產(chǎn)生粘膜免疫反應(yīng)。口服疫苗作用于消化道黏膜，先使機(jī)體在胃腸道黏膜產(chǎn)生局部免疫應(yīng)答繼而獲得全身的免疫保護(hù)[41-42 ]。有研究表明僅通過(guò)鼻腔滴定免疫時(shí)效果較好，而通過(guò)口服免疫時(shí)所檢測(cè)到的系統(tǒng)免疫反應(yīng)較弱[43-44]。由于口服疫苗時(shí)抗原蛋白在胃內(nèi)會(huì)被消化而無(wú)法對(duì)機(jī)體起到免疫作用，但植物細(xì)胞的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜可保護(hù)胞內(nèi)抗原蛋白經(jīng)過(guò)食道、抵達(dá)胃內(nèi)時(shí)不易被消化從而起到生物膠囊作用[45]。當(dāng)抗原蛋白進(jìn)入小腸組織，細(xì)胞壁和細(xì)胞膜會(huì)逐步降解，繼而M細(xì)胞識(shí)別并捕獲其釋放出的免疫原，再轉(zhuǎn)運(yùn)給抗原呈遞細(xì)胞(APC)處理，最終發(fā)揮口服免疫的效應(yīng)[46]。

2.2 人體臨床試驗(yàn)

迄今為止, 已有多種植物表達(dá)抗原蛋白在轉(zhuǎn)基因植物中成功表達(dá)，并進(jìn)行了動(dòng)物免疫試驗(yàn)且表現(xiàn)出免疫原性(表1)，但大多仍停留在初期研究階段。目前，已進(jìn)行人體臨床試驗(yàn)并見諸文獻(xiàn)的植物可食疫苗僅5種：LT-B[47]、HBsAg[48-49]、NVCP[50]、轉(zhuǎn)基因狂犬病疫苗[51]和麻疹疫苗[52]，分別用于預(yù)防或治療細(xì)菌性腹瀉、乙型肝炎、病毒性腹瀉、狂犬病和麻疹，研究結(jié)果顯示它們?cè)谌梭w中均具有一定的免疫效果。另有最新報(bào)道的一些植物疫苗(H5N1流感疫苗、H1N1流感疫苗)也已進(jìn)入人體臨床試驗(yàn)階段。

2.2.1 H5N1流感疫苗 H5N1禽流感是一種高致病性禽流感病毒(High Pathogenic Avian Influenza Virus,HPAIV)亞型，曾多次在全球范圍內(nèi)的爆發(fā)，導(dǎo)致大規(guī)模禽類死亡并能感染人類致死，在世界范圍內(nèi)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失[53]。2012年8月，美國(guó)傳染病研究中心(IDRI)聯(lián)合Medicago生物制藥公司獲美國(guó)食品藥物管理局(FDA)批準(zhǔn)，啟動(dòng)H5N1亞型高致病性禽流感病毒樣顆粒(VLP)候選植物疫苗(簡(jiǎn)稱H5N1疫苗)的I期臨床試驗(yàn)。該試驗(yàn)評(píng)價(jià)添加經(jīng)肌肉或皮下注射的吡喃葡萄糖基脂(GLA)佐劑的H5N1疫苗的安全性及免疫原性。作為第1個(gè)皮下注射佐劑的臨床試驗(yàn)，應(yīng)用于臨床可供人們?cè)诹鞲写罅餍兄凶孕凶⑸洹Ｔ揌5N1候選疫苗應(yīng)用Medicago公司開發(fā)的植物表達(dá)系統(tǒng)，利用野生型煙葉表達(dá)H7N9禽流感病毒關(guān)鍵蛋白，該生產(chǎn)方式比傳統(tǒng)的雞胚法疫苗生產(chǎn)速度快。Ⅰ期臨床試驗(yàn)自2012年9月開始實(shí)施，100位受試者均接受兩個(gè)劑量的疫苗免疫以評(píng)價(jià)疫苗的安全性及免疫反應(yīng)。試驗(yàn)共進(jìn)行15個(gè)月，于2013年完成初期的安全性及免疫學(xué)數(shù)據(jù)[54]。

2.2.2 H1N1流感疫苗 甲型H1N1流感是一種因甲型流感病毒引起的人畜共患的呼吸系統(tǒng)疾病。2012年3月21日美國(guó)伊利諾州的一家公司iBio宣布首次完成該公司自2010年10月13日開始研發(fā)制造的H1N1流感植物疫苗(HAC1)一期人體臨床試驗(yàn)。該試驗(yàn)旨在判定疫苗的安全性、反應(yīng)原性和免疫原性及適合的服用劑量，80名志愿者參與單盲，安慰劑控制，劑量逐步加大的試驗(yàn)。該疫苗依托iBio公司的iBio Launch疫苗研發(fā)平臺(tái)，此平臺(tái)以植物蛋白表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)所需工程蛋白。該研究表明，受試者使用低劑量或高劑量的該種疫苗，均表現(xiàn)良好的耐受性和安全性，且佐劑的使用與否不影響結(jié)果。同時(shí)，該轉(zhuǎn)基因植物疫苗可有效引發(fā)機(jī)體免疫反應(yīng)，在接受無(wú)佐劑的最高疫苗劑量的受試個(gè)體中檢測(cè)到最佳免疫應(yīng)答反應(yīng)，其觸發(fā)的免疫反應(yīng)相似于市售流感疫苗[55]。

2.2.3 大腸桿菌腸毒素疫苗(E.coliheat-labile enterotoxin B subunit,LT-B) 霍亂弧菌(V.cholera)和腸毒素大腸桿菌(EnterotoxigenicEscherichiacoli,ETEC)分泌腸毒素結(jié)合小腸上皮M細(xì)胞表面的神經(jīng)節(jié)苷脂(GM1) 會(huì)引起腹瀉?；魜y毒素(CT) 和大腸桿菌熱不穩(wěn)定性腸毒素B亞基(LTB) 蛋白同源性高。Mason等[9]曾檢測(cè)到轉(zhuǎn)LTB基因蛋白的馬鈴薯在塊莖中的最高表達(dá)量可達(dá)17.2 μg·g-1。隨后用轉(zhuǎn)基因馬鈴薯組織(含20～50 μg·g-1L TB) 飼喂小鼠, 小鼠免疫后血清中產(chǎn)生IgG抗體。Tacket等[56]曾于1998年利用轉(zhuǎn)基因馬鈴薯表達(dá)LTB蛋白，并進(jìn)行了人體臨床試驗(yàn)，多數(shù)受試者血清及糞便中均檢測(cè)到特異性抗體。隨后在2004年該研究團(tuán)隊(duì)實(shí)現(xiàn)LTB在玉米中的表達(dá)，再次進(jìn)行人體臨床試驗(yàn)。通過(guò)給9名志愿者口服2～3劑(每劑含1 mg·L-1TB)疫苗，其中7人抗LT血清IgG抗體至少提高4倍，4人抗LT血清IgA抗體至少提高4倍，4人的糞便sIgA至少提高了4倍[47]。

2.2.4 乙肝病毒表面抗原病毒疫苗(Hepatitis B Surface Antigen,HBsAg) HBsAg 是乙肝病毒(HBV)的主要表面抗原蛋白。Kong等[49]利用轉(zhuǎn)基因馬鈴薯喂食小鼠后，檢測(cè)到小鼠產(chǎn)生抗HBsAg的 IgG 血清, 電子顯微鏡觀察馬鈴薯葉片發(fā)現(xiàn)HBsAg VLPs積累于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的囊泡中，即保護(hù)HBsAg VLPs免于被胃酸消化。2005年Thanavala等[48]利用轉(zhuǎn)基因馬鈴薯制成疫苗(每劑含850 μg HBsAg CP)并進(jìn)行人體臨床實(shí)驗(yàn)，在16例口服了3劑疫苗的志愿者中，有10例的血清中抗HBsAg抗體滴度增加；在17例口服了2劑疫苗的志愿者中，有9例的血清檢測(cè)顯示抗HBsAg抗體滴度增加。而口服非轉(zhuǎn)基因馬鈴薯的志愿者的血清抗HBsAg抗體滴度未增加。此前，Kong等[49]曾于2001年成功實(shí)現(xiàn)HBsAg抗原蛋白在萵苣(Lactucasativa)中的表達(dá)并進(jìn)行了人體臨床試驗(yàn)，結(jié)果顯示多數(shù)志愿者的血清抗HBsAg抗體水平明顯提高。

2.2.5 諾沃克病毒疫苗 Mason等[36]曾于1996年在轉(zhuǎn)基因煙草及馬鈴薯中表達(dá)了諾沃克病毒(Norwalk Virus,NV) 外殼蛋白(NV CP)，檢測(cè)表明該蛋白可在馬鈴薯中正確裝配病毒樣顆粒VLPs，飼喂小鼠后可刺激其產(chǎn)生NVCP 特異的抗血清IgG以及小腸IgA 抗體。2000年Tacket等[50]利用轉(zhuǎn)NV基因的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯疫苗(每劑含500 μg NV CP)進(jìn)行了人體臨床試驗(yàn)。24名志愿者口服2～3劑疫苗，進(jìn)行雙盲、隨機(jī)、安慰劑作為對(duì)照的試驗(yàn)。在20例口服轉(zhuǎn)基因植物疫苗的志愿者中，19人分泌特異性IgA的抗體分泌細(xì)胞數(shù)量顯著提高，4人產(chǎn)生NV CP特異性的血清IgG(平均提高了12倍)，4人產(chǎn)生了NV CP特異性的血清IgM(平均提高了7倍)，6人產(chǎn)生了NV CP特異性的糞便sIgA(平均提高了17倍)。

2.2.6 狂犬病毒疫苗 狂犬病廣泛存在于發(fā)達(dá)國(guó)家及發(fā)展中國(guó)家, 由狂犬病毒(Rabies Virus)引起。Modelska等[51]用含狂犬病毒G 抗原的重組苜蓿花葉病毒顆粒(AlMV) 感染菠菜(Spinaciaoleracea)葉片, 用菠菜葉喂食小鼠, 檢測(cè)到小鼠產(chǎn)生了特異IgG 和IgA 抗體。隨后進(jìn)行了該轉(zhuǎn)基因植物疫苗的人體臨床試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果表明該候選疫苗可作為口服疫苗增強(qiáng)劑，以補(bǔ)充狂犬病免疫接種。5名已接種過(guò)傳統(tǒng)狂犬病疫苗的志愿者生食轉(zhuǎn)基因菠菜葉(3劑，每劑約含84 μg嵌合肽)后，有3人的抗狂犬病病毒特異性血清IgG顯著提高。9名未接種過(guò)傳統(tǒng)狂犬病疫苗的志愿者在生食轉(zhuǎn)基因菠菜葉后(3劑，每劑約含630 μg嵌合肽)，4人產(chǎn)生抗狂犬病病毒的特異性IgG抗體，3人產(chǎn)生抗狂犬病病毒的特異性IgA抗體。隨后對(duì)這9人不經(jīng)腸胃接種1劑商業(yè)狂犬病疫苗后，其中3人產(chǎn)生了狂犬病毒中和抗體，而對(duì)照組未檢測(cè)到中和抗體。

2.2.7 麻疹病毒疫苗 麻疹是由麻疹病毒(Measles Virus)引起的一種強(qiáng)傳染性疾病。目前已成功在煙草和胡蘿卜中表達(dá)轉(zhuǎn)麻疹病毒H 蛋白。Webster等[52]對(duì)曾被麻疹DNA疫苗免疫過(guò)的小鼠飼喂轉(zhuǎn)基因煙草中提取的H 蛋白, 小鼠均表現(xiàn)出了極強(qiáng)的免疫反應(yīng)，后將麻疹病毒基因轉(zhuǎn)入胡蘿卜并制成轉(zhuǎn)基因植物疫苗，對(duì)曾注射商業(yè)疫苗免疫或自然免疫過(guò)的志愿者進(jìn)行了免疫加強(qiáng)試驗(yàn), 結(jié)果表明，志愿者均產(chǎn)生了較強(qiáng)的免疫應(yīng)答反應(yīng)。

3 亟待解決的問(wèn)題

經(jīng)過(guò)科研工作者的多年努力，利用植物生產(chǎn)抗原蛋白疫苗已得到長(zhǎng)足發(fā)展，但仍存在許多亟待解決的問(wèn)題，如：1)轉(zhuǎn)基因植物外源蛋白表達(dá)量低，難以達(dá)到商業(yè)化生產(chǎn)疫苗的水平；口服免疫時(shí)需使用較大劑量方可誘發(fā)機(jī)體免疫反應(yīng)；2)口服疫苗時(shí)抗原易被消化降解，服用疫苗可能產(chǎn)生免疫耐受現(xiàn)象；3)轉(zhuǎn)基因植物存在生物安全性問(wèn)題等。能否合理高效的解決這些問(wèn)題，是衡量轉(zhuǎn)基因植物疫苗成功與否的重要標(biāo)準(zhǔn)。

首先，植物抗原蛋白表達(dá)量低是制約植物可食疫苗應(yīng)用的最大桎梏，直接影響到植物生物產(chǎn)品的純化等下游加工成本和轉(zhuǎn)基因植物疫苗的商業(yè)化及產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程。早期的研究報(bào)道中，抗原在植物中表達(dá)量大多僅占總可溶性蛋白(TSP)的0.001%～0.3%[57]。目前，提高外源蛋白在轉(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)量的方法很多，例如：1)針對(duì)不同植物選擇合適的表達(dá)系統(tǒng)。如能穩(wěn)定遺傳并特異性表達(dá)目的基因的核轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，可高效表達(dá)外源蛋白的葉綠體轉(zhuǎn)化系統(tǒng)、瞬時(shí)轉(zhuǎn)化系統(tǒng)、植物懸浮細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)等[58-61]；2)改造目的基因，增加目的基因的復(fù)制。改進(jìn)植物表達(dá)載體的性能，選擇植物偏愛密碼子、去除mRNA不穩(wěn)定信號(hào)、導(dǎo)入植物前優(yōu)化原核基因序列等[62-63]；3)實(shí)現(xiàn)外源基因的高效整合。通過(guò)增加目的基因的拷貝數(shù)，如，單拷貝純合植株的自交、高表達(dá)植株間的雜交。若拷貝數(shù)一定，可把目的基因整合到染色質(zhì)轉(zhuǎn)錄活躍區(qū)[64-65]；4)增加目的基因的轉(zhuǎn)錄。選擇適合植物高效表達(dá)的啟動(dòng)子、合理利用隔離子，如，細(xì)胞核基質(zhì)結(jié)合區(qū)(MAR)、轉(zhuǎn)化激活序列(TBS)及EcoRⅠ/SalⅠ片段(EXOB)等保證外源基因在時(shí)空上的正確表達(dá)。建立位點(diǎn)特異重組體系，實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)整合，避免基因插入位點(diǎn)不同造成的位置效應(yīng)[66-68]；5)提高目的基因的翻譯。增添優(yōu)化密碼子、增加增強(qiáng)子序列如： 5’UTR、3’UTR、Ω等元件。使目的基因表達(dá)多順?lè)醋觤RNA、優(yōu)化引發(fā)點(diǎn)、加入Kozak序列[69-75]；6)將蛋白定位在細(xì)胞特定部位，使高水平表達(dá)的外源蛋白在植物細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定存在并積累。如添加KDEL序列使外源蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中積累增加，或?qū)⒛康牡鞍锥ㄎ坏降鞍左w、種子中質(zhì)體、葉綠體中[76]；7)純化加工蛋白質(zhì)。避免植物外源蛋白提取過(guò)程中的污染及降解、采用親和層析技術(shù)進(jìn)行蛋白純化[77]等。

其次，除提高植物抗原蛋白表達(dá)量外，還可通過(guò)添加免疫佐劑、多種疫苗聯(lián)用等方法避免免疫耐受、增強(qiáng)免疫原性[78]。使用粘膜免疫佐劑與目的抗原蛋白融合表達(dá)的植物抗原疫苗, 可加快胃腸粘膜對(duì)疫苗的吸收和免疫應(yīng)答反應(yīng)速度，并增強(qiáng)抗原蛋白的免疫原性。新型免疫佐劑包括：病毒樣顆粒VLP、細(xì)菌毒素(LTB、CTB)、分子免疫佐劑、皂素衍生物、合成免疫佐劑等[79]。此外，不同的免疫途徑相結(jié)合可增強(qiáng)機(jī)體的免疫應(yīng)答，如被非腸道途徑免疫后再加以口服疫苗免疫可大大提高機(jī)體的粘膜免疫反應(yīng), 該種口服加強(qiáng)的免疫方式還簡(jiǎn)化了免疫過(guò)程[80]。另外，除使用合適的佐劑進(jìn)行協(xié)助免疫外，可采用口服給藥、鼻腔滴灌給藥、皮下注射等多種給藥方式，篩選出安全高效的免疫途徑[78]。

此外，轉(zhuǎn)基因植物的生物安全性一直是近年來(lái)備受爭(zhēng)論的焦點(diǎn)。因此，選擇更為安全的新型安全標(biāo)記基因，如：甘露糖-6-磷酸異構(gòu)(Mannose-6-Phosphate Isomerase,PMI)、木糖異構(gòu)酶(Xylose Isomerase,XI)[81]等替代抗生素和除草劑的基因等會(huì)對(duì)環(huán)境造成不利影響的傳統(tǒng)選擇標(biāo)記；采取切實(shí)可行的措施避免或降低外源基因漂移到環(huán)境中破壞生態(tài)環(huán)境，如利用葉綠體轉(zhuǎn)化法控制花粉漂移，或采用生殖隔離、物理隔離加以預(yù)防[82]；此外，防止食用轉(zhuǎn)基因食品后產(chǎn)生新的毒素或過(guò)敏原等均是解決轉(zhuǎn)基因植物疫苗安全性的有效措施。

4 展望

眾所周知，生物技術(shù)發(fā)展的最終目的是被人類利用到生產(chǎn)生活中。因此，不僅要提高農(nóng)牧產(chǎn)品的生產(chǎn)效率，還要打破傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)觀念的局限性，生產(chǎn)多元化的動(dòng)植物及其衍生產(chǎn)品。以往對(duì)轉(zhuǎn)基因植物疫苗的研究主要集中在人用疫苗上，近些年來(lái)為提高動(dòng)物制品的質(zhì)量，避免人畜共患疾病的威脅，畜禽動(dòng)物疫苗的研究越來(lái)越受到重視，這與農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)的發(fā)展密切相關(guān)。轉(zhuǎn)基因植物疫苗不僅能使人類獲得切實(shí)利益，貫穿農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)各個(gè)層級(jí)還可維持生態(tài)及產(chǎn)業(yè)平衡，使之健康可持續(xù)的發(fā)展。

綜上所述，作為生物技術(shù)領(lǐng)域中一門新興發(fā)展中的研究，植物表達(dá)抗原蛋白系統(tǒng)優(yōu)點(diǎn)明顯、發(fā)展?jié)摿薮螅?jīng)過(guò)多年探索發(fā)展，植物可食疫苗存在的弊端也已找到切實(shí)可行的解決方法。隨著研究的發(fā)展深入、障礙的妥善解決，今后若能進(jìn)入產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)并應(yīng)用于疾病防御，其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)必將發(fā)揮巨大的社會(huì)經(jīng)濟(jì)價(jià)值，最終造福于人類。

致謝：該論文是第二屆全國(guó)草業(yè)生物技術(shù)大會(huì)評(píng)選出的優(yōu)秀論文，并得到中國(guó)草業(yè)生物技術(shù)專業(yè)委員會(huì)提供的版面費(fèi)支持。

[1] 黃復(fù)深,袁鑫,邱元.植物基因工程疫苗研究進(jìn)展[J].湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2008,34(2):215-220.

[2] Arntzen C,Plotkin S,Dodet B.Plant-derived vaccines and antibodies:Potential and limitations[J].Vaccine,2005,23(15):1753-1756.

[3] Ma J K,Drake P M,Christou P.The production of recombinant pharmaceutical proteins in plants[J].Nature Reviews Genetics,2003(4):794-805.

[4] Davies A.An investigation into the serological poperties of dysentery stools[J].The Lancet,1992,200:1009-1012.

[5] Mor T S,Gómez-Lim M A,Palmer K E,Kenneth E Palmer.Perspective:Edible vaccines——a concept coming of age[J].Trends in Microbiology,1998,6(11):449-453.

[6] 郭應(yīng)林.轉(zhuǎn)基因植物疫苗研究進(jìn)展[J].四川畜牧獸醫(yī),2010(2):35-37.

[7] Stanley D,Rejzek M,Naested H,Smedley M,Otero S,Fahy B,Thorpe F,Nash R J,Harwood W,Svensson B,Denyer K,Field R A,Smith A M.The role of alpha-glucosidase in germinating barley grains[J].Plant Physiology，2011,155(2):932-943.

[8] Cardineau G A, Curtiss R 3rd.Nucleotide sequence of the asd gene of Streptococcus mutans. Identification of the promoter region and evidence for attenuator-like sequences preceding the structural gene[J].The Journal of biological chemistry，1987,262(7):3344-3353.

[9] Mason H S,Lam D M,Arntzen C J.Expression of hepatitis B surface antigen in transgenic plants[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,1992,89(24):11745-11749.

[10] Dow AgroSciences.When will the first plant-cell-produced vaccine be introduced?[EB/OL](2008)[2014-12-9].http://www.dowagro.com/animalhealth/resources/

[11] Gary H. Toenniessen.Plant Biotechnology and Developing Countries[J].Trends in Biotechnology,1995:13(9):404-409.

[12] Walmsley A M,Arntzen C J.Plant cell factories and mucosal vaccines[J].Current Opinion in Biotechno1ogy,2003,14(2):145-150.

[13] 王媛媛.口蹄疫病毒P1基因和乙型腦炎病毒E基因在轉(zhuǎn)基因水稻中的表達(dá)及其免疫原性研究[D].武漢:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)博士論文,2009.

[14] Lee J Y,Yu J,Henderson D,Langridge W H.Plant-synthesizedE.coliCFA/I fimbrial protein protects Caco-2 cells from bacterial attachment[J].Vaccine,2004,23(2):222-231.

[15] Yusibov V,Hooper D C,Spitsin S V,Fleysh N,Kean R B,Mikheeva T,Deka D,Karasev A,Cox S,Randall J,Koprowski H.Expression in plants and immunogenicity of plant virus-based experimental rabies vaccine[J].Vaccine,2002,20(25-26):3155-3164.

[16] Dus Santos M J,Carrillo C,Ardila F,Ríos R D,Franzone P,Piccone M E,Wigdorovitz A,Borca M V.Development of transgenic alfalfa plants containing the foot and mouth disease virus structural polyprotein geneP1 and its utilization as an experimental immunogen[J].Vaccine,2005,23(15):1838-1843.

[17] Streaffield S J,Jilka J M,Hood E E,Turner D D,Bailey M R,Mayor J M,Woodard S L,Beifuss K K,Horn M E,Delaney D E,Tizard I R,Howard J A.Plant-based vaccines:Unique advantages[J].Vaccine,2001,19(17-19):2742-2748.

[18] Kohl T,HitzerothⅡ,Stewart D,Varsani A,Govan V A,Christensen N D,Williamson A L,Rybicki E P.Plant roduced cottontail rabbit papillomavirus L1 protein protects against tumor challenge:A proof of conceptstudy[J].Clinical and Vaccine Immunology,2006,13(8):845-853.

[19] Rosales-Mendoza S,Soria-Guerra R E,Moreno-Fierros L,Alpuche-Solís A G,Martínez-González L,Korban S S.Expression of an immunogenic F1-V fusion protein in lettuce as a plant-based vaccine against plague[J].Planta,2010,232(2):409-416.

[20] Arlen P A,Singleton M,Adamovicz J J,Ding Y,Davoodi-Semiromi A,Daniell H.Effective plague vaccination via oral delivery of plant cells expressing F1-V antigens in chloroplasts[J].Infection and immunity,2008,76(8):3640-3650.

[21] Guo Q Q,Zhang Z L,Jiang S J，Ma J T,Xue W T,Wu Y M.Expression of an avian influenza virus(H5N1)hemagglutinin gene in transgenicLotuscorniculatus[J].Plant Molecular Biology Reporter,2012,30(5):1117-1124.

[22] Golovkin M,Spitsin S,Andrianov V,Smirnov Y,Xiao Y,Pogrebnyak N,Markley K,Brodzik R,Gleba Y,Isaacs S N,Koprowski H.Smallpox subunit vaccine produced in planta confers protection in mice[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2007,104(16):6864-6869.

[23] Pogrebnyak N,Golovkin M,Andrianov V,Spitsin S,Smirnov Y,Egolf R,Koprowski H.Severe acute respiratory syndrome(SARS)S protein production in plants:Development of recombinant vaccine[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2005,102(25):9062-9067.

[24] Khandelwal A,Renukaradhya G J,Rajasekhar M,Sita G L,Shaila M S.Systemic and oral immunogenicity of hemagglutinin protein of rinderpest virus expressed by transgenic peanut plants in a mouse model[J].Virology,2004,323(2):284-291.

[25] Molina A,Veramendi J,Hervs-Stubbs S.Induction of neutralizing antibodies by a tobacco chloroplast-derived vaccine based on a B cell epitope fromcanine parvovirus[J].Virology,2005,342(2):266-275.

[26] Kim T G,Gruber A,Ruprecht R M,Langridge W H.Synthesis and assembly of SIVmac Gag p27 capsid protein cholera toxin B subunit fusion protein in transgenicpotato[J].Molecular Biotechnology,2004,28(1):33-40.

[27] Wu Y Z,Li J T,Mou Z R,Fei L,Ni B,Geng M,Jia Z C,Zhou W,Zou L Y,Tang Y.Oral immunization with rotavirus VP7 expressed in transgenic potatoes induced high titers of mucosal neutralizing IgA[J].Virology,2003,313(2):337-342.

[28] Streatfield S J,Lane J R,Brooks C A,Barker D K,Poage M L,Mayor J M,Lamphear B J,Drees C F,Jilka J M,Hood E E,Howard J A.Corn as a production system for human and animal vaccines[J].Vaccine,2003,21(7-8):812-815.

[29] Jani D,Meena L S,Rizwan-ul-Haq Q M,Singh Y,Sharma A K,Tyagi A K.Expression of cholera toxin B subunit in transgenic tomato plants[J].Transgenic Research,2002,11(5):447-454.

[30] Zhang G G,Rodrigues L,Rovinski B,White K A.Production of HIV-1 p24 protein in transgenic tobacco plants[J].Molecular biotechnology,2002,20(2):131-136.

[31] Aziz M A,Sikriwal D,Singh S,Jarugula S,Kumar P A,Bhatnagar R.Transformation of an edible crop with thepagAgene ofBacillusanthracis[J].The FASEB Journal,2005,19(11):1501-1503.

[32] Maclean J,Koekemoer M,Olivier A J,Stewart D,Hitzeroth Ⅱ,Rademacher T,Fischer R,Williamson A L,Rybicki E P.Optimization of human papillomavirus type 16 (HPV-16) L1 expression in plants:Comparison of the suitability of differentHPV-16L1 gene variants and different cell-compartment localization[J].Journal of General Virology,2007,88(5):1460-1469.

[33] Marquet-Blouin E,Bouche F B,Steinmetz A,Muller C P.Neutralizing immunogenicity of transgenic carrot(DaucuscarotaL.)derived measles virus hemagglutinin[J].Plant Molecular Biology,2003,51(4):459-469.

[34] Ma S,Huang Y,Yin Z,Menassa R,Brandle J E,Jevnikar A M.Induction of oral tolerance to prevent diabetes with transgenic plants requires glutamic acid decarboxylase(GAD)and IL-4[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2004,101(15):5680-5685.

[35] Haq T A,Mason H S,Clements J D,Arntzen C J.Oral immunization with a recombinant bacterial antigen produced in transgenic plants[J].Science,1995,268:714-716.

[36] Mason H S,Ball J M,Shi J J,Jiang X,Estes M K,Arntzen C J.Expression of Norwalk virus capsid protein in transgenic tobacco and potato and its oral immunogenicity in mice[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,1996,93(11):5335-5340.

[37] 潘麗.口蹄疫病毒免疫原基因在番茄和擬南芥中的表達(dá)及轉(zhuǎn)基因番茄動(dòng)物免疫試驗(yàn)[D].蘭州:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士論文,2005.

[38] Koo M,Bendahmane M,Lettieri G A,Paoletti A D,Lane T E,Fitchen J H,Buchmeier M J,Beachy R N.Protective immunity against murine hepatitis virus (MHV) induced by intranasal or subcutaneous administration of hybrids of tobacco mosaic virus that carries an MHV epitope[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,1999,96(14):7774-7779.

[39] Wigdorovitz A,Carrillo C,Dus Santos M J.Induction of a protective antibody response to foot and mouth disease virus in mice following oral or parenteralimmunization with alfalfa transgenic plants expressing the viral structural protein VP1[J].Virology,1999,255(2):347-353.

[40] 王華.黏膜免疫細(xì)胞研究進(jìn)展[J].國(guó)外醫(yī)學(xué)(免疫學(xué)分冊(cè)),2000(3):143-145.

[41] Lauterslager T G,Hilgers L A.Efficacy of oral administration and oral intake of edible vaccines[J].Immunology Letters,2002,84(3):185-190.

[42] Walmsley A M,Arntzen C J.Plants for delivery of edible vaccines[J].Current Opinion in Biotechnology,2000,11(2):126-129.

[43] Durrani Z,McInerney T L,McLain L,Jones T,Bellaby T,Brennan F R,Dimmock N J.Intranasal immunization with a plant virus expressing a peptide from HIV-1 gp41 stimulates better mucosal and systemic HIV-1-specific IgA and IgG than oral immunization[J].Journal of Immunological Methods,1998,220(1-2):93-103.

[44] Brennan F R,Bellaby T,Helliwell S M,Jones T D,Kamstrup S,Dalsgaard K,Flock J I,Hamilton W D.Chimeric plant virus particles administered nasally or oral induce systemic and mucosal immune responses in mice[J].Journal of virology,1999,73(2):930-938.

[45] Biemelt S,Sonnewald U,Galmbacher P,Willmitzer L,Müller M.Production of human papillomavirus type 16 virus-like particles in transgenic plants[J].Jorunal of virology,2003,77(17):9211-9220.

[46] Holmgren J,Czerkinsky C,Eriksson K,Mharandi A.Mucosal immunization and adjuvants:A brief overview of recent advances and challenges[J].Vaccine,2003,21(S2):89-95.

[47] Tacket C O,Pasetti M F,Edelman R,Howard J A,Streatfield S.Immunogenicity of recombinant LT-B delivered orally to humans in transgenic corn[J].Vaccine,2004,22(31-32):4385-4389.

[48] Thanavala Y,Mahoney M,Pal S,Scott A,Richter L,Natarajan N,Goodwin P,Arntzen C J,Mason H S.Immunogenicity in humans of an edible vaccine for hepatitis B[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2005,102(9):3378-3382.

[49] Kong Q,Richter L,Yang Y F,Arntzen C J,Mason H S,Thanavala Y.Oral immunization with hepatitis B surface antigen expressed in transgenic plants[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2001,98(20):11539-11544.

[50] Tacket C O,Mason H S,Losonsky G,Estes M K,Levine M M,Arntzen C J.Human immune responses to a novel norwalk virus vaccine delivered in transgenic potatoes[J].Journal of Infectious Diseases,2000,182(1):302-305.

[51] Modelska A,Dietzschold B,Sleysh N,Fu Z F,Steplewski K,Hooper D C,Koprowski H,Yusibov V.Immunization against rabies with plant-derived antigen[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,1998,95(5):2481-2485.

[52] Takashima Y,Schluter W W,L Mariano K M,Diorditsa S,Quiroz Castro Md,Ou A C,U Ducusin M J,Garcia L C,Elfa D C,Dabbagh A,Rota P,Goodson J L.Progress toward measles elimination-Philippines,1998-2014[J].Morbidity and Mortality Weekly Report,2015,64(13):357-362.

[53] 張占路,唐益雄,薛文通,劉建利,梁哲,盧運(yùn)明,吳燕民.百脈根表達(dá)H5N1亞型禽流感血凝素的研究[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué),2008,41(1):303-307.

[54] IDRI,Medicago Get FDA Approval To Begin Phase 1 Clinical Trial For H5N1 Vaccine[EB/OL].(2012-08-16)[2014-12-09].http://www.rttnews.com/1949132/idri-medicago-get-fda-approval-to-begin-phase-1-clinical-trial-for-h5n1-vaccine.aspx

[55] Suzanne Elvidge.iBio shares jump with flu shot clinical trial[EB/OL].(2012-03-22)[2014-12-09]http://www.fiercevaccines.com/story/ibio-shares-jump-flu-shot-clinical-trial/

[56] Tacket C O,Mason H S,Losonsky G,Clements J D,Levine M M,Arntzen C J.Immunogenicity in humans of a recombinant bacterial antigen delivered in a transgenic potato[J].Nature Medicine,1998,4(5):607-609.

[57] Conrad U,Fiedler U.Expression of engineered antibodies in plant cells[J].Plant Molecular Biology,1994,26:1023-1030.

[58] Oey M,Lohse M,Kreikemeyer B,Bock R.Exhaustion of the chloroplast protein synthesis capacity by massive expression of a highly stable protein antibiotic[J].Plant Journal,2009,57(3):436-445.

[59] Salazar-Gonzlez J A,Bauelos-Hernndez B,Rosales-Mendoza S.Current status of viral expression systems in plants and perspectives for oral vaccines development[J].Plant Molecular Biology,2015,87(3):203-217.

[60] 楊帆,趙君,張之為.植物懸浮細(xì)胞的研究進(jìn)展[J].生命科學(xué)研究,2010(3):257-262.

[61] Perlak F J,Fuchs R L,Dean D A.Modification of the coding sequence enhances plant expressing of insect control protein genes[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,1991,88:3324-3328.

[62] Iannacoe R,Grieco P D,Cellini F.Specific sequence modification of a cry3 bendotoxin gene result in high levels of expression and insect resistance[J].Plant Molecular Biology,1997,34:485-496.

[63] Zhong G Y,Peterson D,Delaney D E.Commercial production of aprotinin in transgenic maize seeds[J].Molecular Breeding,1999(5):345-356.

[64] 曾凡鎖,詹亞光.轉(zhuǎn)基因植物中外源基因的整合特性及其研究策略[J].植物學(xué)通報(bào),2004(5):565-577.

[65] 侯丙凱,夏光敏,陳正華.植物基因工程表達(dá)載體的改進(jìn)和優(yōu)化策略[J].遺傳,2001(5):492-497.

[66] Van der Geest A H M,Hall T C.The b-phaseolin 50 matrix attachment region acts as an enhancer facilitator[J].Plant Molecular Biology,1997,33:553-557.

[67] Hily J M,Singer S D,Yang Y.A transformation booster sequence(TBS)from Petunia hybrida functions as an enhancer-blocking insulator inArabidopsisthaliana[J].Plant Cell Reports,2009,28:1095-1104.

[68] Stacy D.Singer,Jean-Michel Hily,Zongrang Liu.A 1kb bacteriophage lambda fragment functions as an insulator to effectively block enhancer promoter interactions inArabidopsisthaliana[J].Plant Molecular Biology Reporter,2010,28(1):69-76.

[69] Albert H,Dale E C,Lee E.Site-specific integration of DNA into wild-type and mutant lox sites placed in the plant genome[J].Plant Journal,1995(7):649-659.

[70] Puch H,Dujon B,Hohn B.Two different but related mechanism are used in plants for the repair of genomic double strand breaks by homologous recombination[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,1996,93:5055-5056.

[71] Joshi C P,Zhou H,Huang X,Chiang V L.Context sequences of translation initiation codon in plants[J].Plant Molecular Biology,1997,35(6):993-1001.

[72] Sharma A K,Sharma M K.Plants as bioreactors:Recent developments and emerging opportunities[J].Biotechnology Advances,2009,27:811-832.

[73] Sawant S V,Kiran K,Singh P K,Tuli R.Sequence architecture downstream of the initiator codon enhances gene expression and protein stability in plants[J].Plant Physiology,2001,126(4):1630-1636.

[74] Kozak M.Downstream secondary structure facilitates recognition of initiator codons by eukaryotic ribosomes[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,1990,87:8301-8305.

[75] Ko K,Tekoah Y,Rudd P M,Harvey D J,Dwek R A,Spitsin S,Hanlon C A,Rupprecht C,Dietzschold B,Golovkin M,Koprowski H.Function and glycosylation of plant-derived antiviral monoclonal antibody[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2003,100(13):8013-8018.

[76] Witte C P,Noel L D,Gielbert J,Parker J E,Romeis T.Rapid one-step protein purification from plant material using the eight-amino acid StrepⅡ epitope[J].Plant Molecular Biology,2004,55(1):135-147.

[77] Webster D E,Cooney M L,Huang Z,Drew D R,Ramshaw I A,Dry I B,Strugnell R A,Martin J L,Wesselingh S L.Successful boosting of a DNA measles immunization with an oral plant-derived measles virus vaccine[J].Journal of Virology,2002,76(5):7910-7912.

[78] 袁蓓,李京生,吳燕民.利用植物生產(chǎn)藥用蛋白的進(jìn)展、局限及應(yīng)對(duì)策略[J].草業(yè)學(xué)報(bào),2013,22(4):283-299.

[79] Lambrecht B N,Kool M,Willart M A,Hammad H.Mechanism of action of clinically approved adjuvants[J].Current Opinion in Immunology,2009,21(1):23-29.

[80] Pyzik M,Rath T,Lencer W I,Baker K,Blumberg R S.FcRn:The Architect Behind the Immune and Nonimmune Functions of IgG and Albumin[J].The Journal of Immunology,2015,194(10):4595-4603.

[81] Wei Z Y,Wang X Z,Xing S C.Current progress of biosafe selectable makers in plant transformation[J].Journal of Plant Breeding and Crop Science,2012,4(1):1-8.

[82] 何平,韋正乙,孫卉,邢少辰.紫花苜蓿轉(zhuǎn)基因研究進(jìn)展[J].草業(yè)科學(xué),2013,30(4):627-637.

(責(zé)任編輯 王芳)

The research progress of plants express antigen protein and immunogenicity

ZHANG Yi-ran1,2, ZHANG Zhan-lu3, TANG Yi-xiong2, WU Yan-min1,2

(1.College of Pastoral Agriculture Science and Technology, Lanzhou University, Lanzhou 730000, China; 2.Biotechnology Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China; 3.Shenzhen Nongke Group Corporation, Shenzhen 518040, China)

The research about plant as bioreactor for the production of vaccine antigen protein is the hotspots in the field of biotechnology because of it’s unique advantages, such as safety, cheap and easy popularization. The present paper reviewed the progress of plant express antigen protein research and some problems like low protein yield, digestion degradation and immune tolerance and proposed some potential solutions for those questions.

transgenic plant vaccine; antigen protein; immunogenicity; clinical test of human body

WU Yan-min E-mail:wuym65@sina.com

10.11829j.issn.1001-0629.2014-0557

2014-12-08 接受日期：2015-02-11

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃“973”項(xiàng)目(2014CB138701)；國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31372361)

張怡然(1988-)，女，甘肅蘭州人，在讀碩士生,研究方向?yàn)橹参锓肿由飳W(xué)。E-mail:zhangyiranlz@sina.com

吳燕民(1955-)，男，陜西子長(zhǎng)人，研究員,博導(dǎo)，博士，研究方向?yàn)橹参锓肿由飳W(xué)與基因工程。E-mail:wuym65@sina.com

Q946.1

A

1001-0629(2015)06-0967-11

張怡然,張占路,唐益雄,吳燕民.植物表達(dá)抗原蛋白及其免疫原性的研究進(jìn)展[J].草業(yè)科學(xué),2015,32(6):967-977.

ZHANG Yi-ran,ZHANG Zhan-lu,TANG Yi-xiong,WU Yan-min.The research progress of plants express antigen protein and immunogenicity[J].Pratacultural Science,2015,32(6)：967-977.