液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因沉默對(duì)霸王葉氣孔特征的影響

袁惠君，馬 清，未 麗，胡 靜，王 沛，王鎖民

(1.草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，甘肅 蘭州 730020；2.蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730050)

液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因沉默對(duì)霸王葉氣孔特征的影響

袁惠君1,2，馬 清1，未 麗1，胡 靜1，王 沛1，王鎖民1

(1.草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，甘肅 蘭州 730020；2.蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730050)

以霸王(Zygophyllumxanthoxylum)野生型植株(WT)、液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因(ZxNHX)的RNA干擾(ZxNHX-RNAi)株系L2和L7為材料，分析了ZxNHX沉默后霸王葉下表皮氣孔特征的變化情況。結(jié)果表明，50 mmol·L-1NaCl處理下，ZxNHX-RNAi株系葉下表皮氣孔開度達(dá)到峰值的時(shí)間比WT延遲了4 h；滲透脅迫下，L7氣孔開度的峰值比WT顯著下降12%。對(duì)照條件下，L7氣孔大小顯著低于WT，達(dá)到峰值的時(shí)間比WT延遲6 h。無論是對(duì)照條件還是鹽處理或滲透脅迫下，ZxNHX-RNAi株系葉組織含水量均顯著低于WT，尤其是鹽處理下，L7比WT低40%?？梢姡琙xNHX通過調(diào)控霸王葉的水分狀況，進(jìn)而影響氣孔運(yùn)動(dòng)。

霸王；氣孔；液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因ZxNHX；基因沉默

氣孔是由一對(duì)保衛(wèi)細(xì)胞圍成的孔狀結(jié)構(gòu)，是植物體與外界環(huán)境進(jìn)行水分、氣體交換的門戶[1]。保衛(wèi)細(xì)胞對(duì)環(huán)境條件非常敏感，在干旱、滲透脅迫等環(huán)境因素脅迫下能通過主動(dòng)調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透勢(shì)，引起水勢(shì)變化而發(fā)生膨壓運(yùn)動(dòng)，進(jìn)而調(diào)節(jié)氣孔孔徑大小[2]，應(yīng)答環(huán)境中水分的改變[3-5]。氣孔的運(yùn)動(dòng)直接調(diào)控植物的蒸騰作用和光合作用，進(jìn)而影響植物的生長(zhǎng)和作物的產(chǎn)量[6-7]。

霸王(Zygophyllumxanthoxylum)是一種廣泛分布在我國(guó)西北干旱荒漠區(qū)的蒺藜科多年生多漿旱生型灌木，具有超強(qiáng)的抗旱性和耐鹽性[8-10]。干旱脅迫下，霸王能大量吸收Na+并有效轉(zhuǎn)運(yùn)至葉中，作為一種有益的滲透調(diào)節(jié)劑降低細(xì)胞的滲透勢(shì)，提高細(xì)胞的吸水能力[11]。50 mmol·L-1NaCl能顯著促進(jìn)霸王生長(zhǎng)，提高其抗旱能力[11-13]。

液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(NHXs)介導(dǎo)Na+、K+區(qū)域化至液泡，以進(jìn)行滲透調(diào)節(jié)并維持促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)所必需的膨壓[14]。干旱和鹽處理下，霸王葉中Na+積累與ZxNHX基因轉(zhuǎn)錄豐度增加成正相關(guān)關(guān)系[15]，表明在干旱和鹽脅迫下ZxNHX基因在調(diào)控植物體內(nèi)Na+平衡方面起重要作用。最近的研究表明，在中生植物擬南芥(Arabidopsisthaliana)中，AtNHX1和AtNHX2蛋白在保衛(wèi)細(xì)胞中大量表達(dá)，AtNHX1和AtNHX2基因敲除導(dǎo)致atnhx1和atnhx2突變體液泡內(nèi)K+的濃度僅為野生型植株的30%，表明AtNHX1和AtNHX2蛋白介導(dǎo)K+區(qū)域化至液泡[16]。同時(shí)，AtNHX1和AtNHX2基因敲除導(dǎo)致細(xì)胞膨壓和細(xì)胞膨脹下降，氣孔保衛(wèi)細(xì)胞寬度減小，導(dǎo)致滲透脅迫下氣孔關(guān)閉變慢等氣孔的發(fā)育和功能缺陷[16-17]。但是，有關(guān)NHXs基因?qū)Χ酀{旱生植物氣孔發(fā)育和功能的影響尚未見報(bào)道。

為此，本研究以霸王ZxNHX-RNAi株系為材料，比較了轉(zhuǎn)基因株系與野生型材料在鹽處理和滲透脅迫條件下氣孔開度等的變化特征，以分析ZxNHX基因?qū)Χ酀{旱生植物氣孔功能的影響。

1 材料與方法

1.1 材料培養(yǎng)

霸王野生型植株(WT)及ZxNHX-RNAi株系(L2和L7)均為蘭州大學(xué)草類逆境生理與基因工程實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)。L2和L7分別為ZxNHX沉默程度不同的兩個(gè)株系[18]，與WT相比，在50 mmol·L-1NaCl處理下， L2和L7葉中ZxNHX的轉(zhuǎn)錄豐度分別下降8%和45%。

從WT、L2和L7母株剪取莖尖扦插至裝有蛭石的穴盤中，澆灌1/2Hoagland營(yíng)養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)得到T0代幼苗。1/2Hoagland營(yíng)養(yǎng)液包括2 mmol·L-1KNO3，0.5 mmol·L-1NH4H2PO4，0.25 mmol·L-1MgSO4·7H2O，0.1 mmol·L-1Ca(NO3)2·4H2O，0.5 mmol·L-1Fe-citrate，92 mmol·L-1H3BO3，18 μmol·L-1MnCl2·4H2O，1.6 μmol·L-1ZnSO4·7H2O，0.6 μmol·L-1CuSO4·5H2O，0.7 μmol·L-1(NH4)6Mo7O24·4H2O。每4天換一次營(yíng)養(yǎng)液，溫室的晝夜溫度為(24±2)℃/(18±2)℃，光照時(shí)間16 h·d-1，光照強(qiáng)度約600 μmol·m-2·s-1，相對(duì)濕度約為65%。4周后，挑選健壯整齊的WT、L2和L7幼苗移栽至裝有蛭石的花盆中。6個(gè)月后分別進(jìn)行鹽處理和滲透脅迫處理,并測(cè)定各株系氣孔大小。

1.2 材料處理方法

處理如下，(1)WT、L2和L7用正常的1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液澆灌7 d后，測(cè)定葉組織含水量及氣孔大小，并觀察葉下表皮保衛(wèi)細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)；(2)WT、L2和L7分別用正常的1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液(對(duì)照，Control)和含有50 mmol·L-1NaCl的1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液澆灌7 d(鹽處理組，50 mmol·L-1NaCl)，測(cè)定氣孔開度的日變化；(3)WT、L2和L7分別用正常的1/2Hoagland營(yíng)養(yǎng)液(對(duì)照組，Control)和用山梨醇(D-sorbitol)配成的總滲透勢(shì)為-0.5 MPa的1/2 Hoagland溶液(滲透脅迫組，-0.5 MPa)澆灌72 h，測(cè)定氣孔開度的日變化。每2 d更換一次處理液，以保持處理液濃度的相對(duì)恒定。每個(gè)處理取4個(gè)重復(fù)，并測(cè)定各株系氣孔大小。

1.3 各種指標(biāo)的測(cè)量方法

氣孔開度和氣孔大小的測(cè)定方法為：分別在9:00、11:00、15:00、17:00取下待測(cè)葉片后，立即撕取葉下表皮，制成臨時(shí)裝片，在光學(xué)顯微鏡下用測(cè)微尺測(cè)定氣孔的內(nèi)橫徑、內(nèi)縱徑、外橫徑、外縱徑，然后計(jì)算出氣孔開度、氣孔大小。氣孔開度和氣孔大小的計(jì)算參考文獻(xiàn)所用的方法[19]：氣孔開度=內(nèi)橫徑×內(nèi)縱徑；氣孔大小=外橫徑×外縱徑。

取各處理中從莖尖起第3莖節(jié)葉片，用蒸餾水迅速將其表面沖洗干凈，吸水紙吸干后，稱鮮重(Fresh weight，F(xiàn)W)；鮮材料放入105 ℃的烘箱中殺青10 min后，80 ℃烘干至恒重，稱干重(Dry weight，DW)，組織含水量的計(jì)算參考Wang等[20]報(bào)道的公式(FW-DW)/DW，式中,FW為鮮重，DW為干重。

1.4 數(shù)據(jù)計(jì)算和統(tǒng)計(jì)分析

用Excel制圖，SPSS 13.0軟件(SPSS Inc., Chicago, IL, USA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用單因素方差分析比較不同處理間各項(xiàng)指標(biāo)的差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽處理下ZxNHX沉默對(duì)霸王葉氣孔開度的影響

對(duì)照條件下，WT和L2葉下表皮氣孔開度均在11:00達(dá)到峰值，隨后減小，L7的氣孔開度在15:00才達(dá)到峰值，隨后減??；L2氣孔開度的峰值與WT無顯著差異(P<0.05)，但L7比WT減小30%(圖1)。50 mmol·L-1NaCl處理下，WT葉下表皮氣孔開度仍在11:00達(dá)到峰值，隨后減小，而L2和L7的氣孔開度均在15:00才達(dá)到峰值，隨后減小，WT、L2和L7氣孔開度的峰值之間差異不顯著(圖1)。

2.2 滲透脅迫下ZxNHX沉默對(duì)霸王葉氣孔開度的影響

無論是對(duì)照還是-0.5 MPa滲透脅迫下，WT和L2葉下表皮氣孔開度均在11:00達(dá)到峰值，隨后減小，L7的氣孔開度在15:00才達(dá)到峰值，隨后減小(圖2)。對(duì)照條件下，WT、L2和L7氣孔開度的峰值之間差異不顯著(P<0.05)；-0.5 MPa滲透脅迫下，L2與WT氣孔開度的峰值之間差異不顯著，但L7比WT減小12%(圖2)。

圖1 鹽處理下ZxNHX沉默對(duì)霸王葉氣孔開度的影響Fig.1 Stomatal aperture variation in abaxial leaves of 6-month-old wild-type(WT)and ZxNHX-silenced lines(L2，L7)ofZ. xanthoxylum under control conditions and 50 mmol·L-1 NaCl for 7 d

注：不同小寫字母表示同一時(shí)間不同株系的處理間差異顯著(P<0.05)。下圖同.

Note: Different lower case letters for the same time indicate significant difference among 6-month-old wild-type(WT) andZxNHX-silenced lines(L2, L7) ofZ.xanthoxylumat 0.05 level. The same below.

圖2 滲透脅迫下ZxNHX基因沉默對(duì)霸王葉氣孔開度的影響Fig.2 Stomatal aperture variation in abaxial leaves of 6-month-old WT and ZxNHX-silenced lines(L2， L7)ofZ. xanthoxylum under control conditions and -0.5 MPa osmotic stress treatment for 3 d

2.3ZxNHX沉默對(duì)霸王葉氣孔大小的影響

對(duì)照條件下，WT處理葉下表皮氣孔開度在上午9:00達(dá)到峰值，而L2和L7處理分別在11:00和15:00才達(dá)到峰值。L7處理在9:00、11:00、15:00時(shí)的氣孔開度分別比WT處理減小32%、27%、18%(圖3)。

2.4ZxNHX沉默對(duì)霸王葉組織含水量的影響

在對(duì)照和鹽處理下，L2和L7葉組織含水量均低于WT。與WT相比，L2和L7葉組織含水量在對(duì)照條件下分別降低21%和27%；50 mmol·L-1NaCl處理下分別降低30%和40%。滲透脅迫下，WT、L2和L7之間葉組織含水量差異不顯著(圖4)。

圖3 對(duì)照條件下ZxNHX基因沉默對(duì) 霸王葉氣孔大小的影響Fig.3 Stomatal size variation in abaxial leaves of 6-month-old WT and ZxNHX-silenced lines(L2，L7)ofZ. xanthoxylum under control conditions

注：不同小寫字母表示同一時(shí)間不同處理間差異顯著(P<0.05)。

Note: Different lowercase letters for the same time indicate significant difference among 6-month-old wild-type(WT) andZxNHX-silenced lines(L2, L7) ofZ.xanthoxylumat 0.05 level.

圖4 ZxNHX沉默對(duì)霸王葉組織含水量的影響Fig.4 Tissue water content of leaves in WT andZxNHX-silenced lines(L2，L7)of Z. xanthoxylumunder control，50 mmol·L-1 NaCl for 7 d and -0.5 MPa osmotic stress treatment for 72 h

注：不同小寫字母表示不同處理間差異顯著(P<0.05)。

Note: Different lowercase letter indicate significant difference among 6-month-old wild-type(WT) andZxNHX-silenced lines(L2, L7) ofZ.xanthoxylumat 0.05 level.

3 討論與結(jié)論

植物NHX屬于一價(jià)陽(yáng)離子/質(zhì)子反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族(Cation/proton antiporter，CPA)中的一類蛋白，這個(gè)超家族包括兩支CPA1和CPA2[21-22]。在擬南芥中，CPA2家族含有8個(gè)分支共28個(gè)基因，其中大部分基因?yàn)槿藗兯皇煜さ年?yáng)離子/ H+反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(CHXs)[23]。一些定位在內(nèi)膜系統(tǒng)膜泡上的CHXs可能在維持細(xì)胞pH穩(wěn)定，離子平衡和膜泡運(yùn)輸中起重要作用[23]，定位在保衛(wèi)細(xì)胞上的CHXs則與氣孔滲透調(diào)節(jié)有關(guān)[24]。擬南芥中NHX類蛋白包括8個(gè)成員，根據(jù)序列相似性和亞細(xì)胞定位分為兩組：一組為細(xì)胞內(nèi)膜系統(tǒng)組，定位在液泡膜和內(nèi)體膜上共6個(gè)成員(AtNHX1-AtNHX6)，又分為液泡組(AtNHX1-AtNHX4)和內(nèi)體組(AtNHX5和AtNHX6)[16]。另一組為質(zhì)膜組，定位在質(zhì)膜上，包括AtNHX7/SOS1和AtNHX8兩個(gè)成員，其序列、功能與內(nèi)膜系統(tǒng)組差異極大[16]。

與野生型相比，擬南芥nhx1/nhx2雙敲除突變體中氣孔保衛(wèi)細(xì)胞寬度減小，正常條件下nhx1/nhx2雙敲除突變體氣孔導(dǎo)度增加，易失水萎蔫，而滲透脅迫下氣孔關(guān)閉變慢[16-17]。本研究中，ZxNHX沉默導(dǎo)致正常條件下，氣孔開度達(dá)到峰值的時(shí)間推遲；50 mmol·L-1NaCl處理下氣孔開度達(dá)到峰值的時(shí)間從11:00推遲至15:00；而在滲透脅迫下氣孔開度顯著下降，表明ZxNHXs沉默影響氣孔的開閉運(yùn)動(dòng)的靈活性，使其對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性減弱。

影響氣孔開閉運(yùn)動(dòng)的一個(gè)重要因素是葉的水分狀況[25-26]。大量研究表明，干旱條件下，植物的水分供應(yīng)減少，葉水勢(shì)下降，膨壓隨之降低而引起氣孔關(guān)閉[5,27]。Franks[7]的研究表明，氣孔的開放和葉面積的增加依賴于細(xì)胞的膨脹，而細(xì)胞的膨脹取決于其滲透調(diào)節(jié)能力。實(shí)際上，對(duì)霸王而言，Na+作為一種有益的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)積累在葉中用于滲透調(diào)節(jié)。干旱脅迫下，多漿旱生植物霸王能大量吸收Na+并有效轉(zhuǎn)運(yùn)至葉中，通過ZxNHX將細(xì)胞胞質(zhì)中過多的Na+區(qū)域化至液泡中，降低細(xì)胞的滲透勢(shì)，提高細(xì)胞的吸水能力[11,13,15]。本研究中，ZxNHX沉默引發(fā)霸王葉組織含水量和氣孔開度顯著下降。在正常的生長(zhǎng)條件下，擬南芥中的AtNHX1和AtNHX2介導(dǎo)K+區(qū)域化至液泡，影響細(xì)胞的滲透調(diào)節(jié)和細(xì)胞膨脹[16-17]，并能通過介導(dǎo)K+在保衛(wèi)細(xì)胞液泡中的積累調(diào)控氣孔的開閉運(yùn)動(dòng)[28]?？梢姡琙xNHX通過調(diào)控霸王葉的水分狀況，進(jìn)而影響氣孔大小和氣孔開閉運(yùn)動(dòng)。

致謝：該論文是第二屆全國(guó)草業(yè)生物技術(shù)大會(huì)評(píng)選出的優(yōu)秀論文，并得到中國(guó)草業(yè)生物技術(shù)專業(yè)委員會(huì)提供的版面費(fèi)支持。

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(責(zé)任編輯 王芳)

Effects of tonoplast Na+/H+antiporters gene silence on leaf stomata characteristics ofZygophyllumxanthoxylum

YUAN Hui-jun1,2, MA Qing1, WEI Li1, HU Jing1, WANG Pei1, WANG Suo-min1

(1.State Key Laboratory of Grassland Agro-ecosystems, College of Pastoral Agriculture Science and Technology, Lanzhou University, Lanzhou 730020, China; 2.College of Life Science and Engineering, Lanzhou University of Technology, Lanzhou 730050, China)

The stomata characteristics of differentZygophyllumxanthoxylumlines including wild type(WT)andZxNHX-silenced lines(L2 and L7)using post-transcriptional gene silencing were analyzed. Under 50 mmol·L-1NaCl treatment, 4 more hours was required for stomatal aperture ofZxNHX-silenced lines reached to peak value compared with WT. Under -0.5 MPa osmotic stress treatment, the peak value of stomatal aperture in L7 lines significantly decreased by 12% compared with that of WT. Under control conditions, the stomatal size of L7 lines significantly reduced and 6 more hours was required for stomatal aperture reached to peak value compared with WT. Leaf tissue water contents inZxNHX-silenced lines were always significantly lower than that in WT under all the treatments, especially under 50 mmol·L-1NaCl treatment, leaf tissue water content of L7 lines was 40% less than that of WT. These results suggestedZxNHXregulated stomatal activities by controlling leaf water status ofZ.xanthoxylum.

Zygophyllumxanthoxylum; stomata; the tonoplast Na+/H+antiportersZxNHX; gene silencing

WANG Suo-min E-mail:smwang@lzu.edu.cn

10.11829j.issn.1001-0629.2014-0555

2014-12-08 接受日期：2015-03-25

973項(xiàng)目(2014CB138701)；國(guó)家自然科學(xué)基金(31170431、31460629)

袁惠君(1974-)，女，甘肅天水人，在讀博士生，研究方向?yàn)橹参锬婢成砼c分子生物學(xué)。E-mail:gsyhj@163.com

王鎖民(1965-)，男，甘肅寧縣人，教授，博導(dǎo)，博士，研究方向?yàn)橹参锬婢成砼c分子生物學(xué)。E-mail:smwang@lzu.edu.cn

Q943.2

A

1001-0629(2015)06-0902-06

袁惠君，馬清，未麗，胡靜，王沛，王鎖民.液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因沉默對(duì)霸王葉氣孔特征的影響[J].草業(yè)科學(xué),2015,32(6):902-907.

YUAN Hui-jun,MA Qing,WEI Li,HU Jing,WANG Pei,WANG Suo-min.Effects of tonoplast Na+/H+antiporters gene silence on leaf stomata characteristics ofZygophyllumxanthoxylum[J].Pratacultural Science，2015,32(6)：902-907.