MiR-106b對食管癌KYSE150細(xì)胞的生長及細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響

戴 芳， 劉 濤， 鄭樹濤， 劉 清， 王 棟， 伊力亞爾·夏合丁， 盧曉梅

(1新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究院， 2新疆維吾爾自治區(qū)食管癌研究所， 烏魯木齊 830054)

MiR-106b對食管癌KYSE150細(xì)胞的生長及細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響

戴 芳1， 劉 濤1， 鄭樹濤1， 劉 清1， 王 棟1， 伊力亞爾·夏合丁2， 盧曉梅2

(1新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究院，2新疆維吾爾自治區(qū)食管癌研究所， 烏魯木齊 830054)

目的 研究微小RNA106b(miR-106b)對食管癌KYSE150細(xì)胞增殖、遷移、侵襲及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT)的影響，為臨床治療食管癌提供新的理論依據(jù)。方法 用miR-106b慢病毒轉(zhuǎn)染KYSE150細(xì)胞，實驗分為3組：control組 (未轉(zhuǎn)染miR-106b的KYSE150細(xì)胞)、miR-NC組(轉(zhuǎn)染隨機(jī)序列)和miR-106b組 (轉(zhuǎn)染miR-106b的KYSE150的細(xì)胞)。采用實時熒光定量聚合酶聯(lián)反應(yīng)(qRT-PCR)和免疫印跡(Western Blot)檢測miR-106b和EMT的相關(guān)標(biāo)記物E-鈣黏蛋白(E-Cadherin)、神經(jīng)型鈣黏蛋白(N-Cadherin)的表達(dá)情況， 四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色法(MTT法)檢測細(xì)胞的增殖能力，劃痕實驗檢測細(xì)胞的遷移能力，Transwell方法檢測細(xì)胞的侵襲能力。結(jié)果 慢病毒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染miR-106b后，食管癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力均增強(qiáng)(P<0.05)；qRT-PCR與Westernblot檢測顯示miR-106b組E-Cadherin表達(dá)較miR-NC組、control組明顯降低(P<0.05)；N-Cadherin表達(dá)明顯升高(P<0.05)。結(jié)論miR-106b能夠促進(jìn)食管癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，同時能促進(jìn)上皮間質(zhì)的轉(zhuǎn)化。

miR-106b； 細(xì)胞增殖； 細(xì)胞遷移； 細(xì)胞侵襲； 上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化

食管癌是消化道最常見的惡性腫瘤之一。目前手術(shù)是治療食管癌最有效的方法，但晚期食管鱗癌5年生存率仍低于15%[1]，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移依然是預(yù)后不良的因素[2]。因此，分子病理學(xué)研究對食管癌的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移起著關(guān)鍵性的作用。MicroRNA(miRNA)是一類非編碼小RNA分子，其長度約22個核苷酸，參與轉(zhuǎn)錄后水平mRNA的降解或翻譯抑制來調(diào)控基因表達(dá),在腫瘤的形成中具有重要作用[3]。微小RNA106b(miR-106b)基因是miR-106b-25家族中的一員。多數(shù)研究表明，miR-106b-25基因簇的3個成員在腫瘤中同時存在是相當(dāng)少的，大部分只是其中1個或2個成員高表達(dá)。而miR-106b經(jīng)常作為致癌因素的miRNA分子，在喉癌[4]、胃癌[5]、乳腺癌[6]、肝癌[7]等多種腫瘤組織中高表達(dá)，具有調(diào)控腫瘤細(xì)胞遷移、侵襲、增殖等重要的功能。近年來研究發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)的miR-106b促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的發(fā)生，即腫瘤細(xì)胞由上皮表型向間質(zhì)表型發(fā)展，參與了腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[8]。本課題組通過微陣列法發(fā)現(xiàn)Has-miR-106b在食管癌組織中明顯表達(dá)上調(diào)，本研究在此基礎(chǔ)上，在細(xì)胞水平及分子水平上進(jìn)一步探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料食管鱗癌細(xì)胞株KYSE150由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院國家重點實驗室贈送，RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶(美國Gibco公司)，二甲基亞楓DMSO(美國Invitrogen公司)，慢病毒LV-hsa-mir-106b(14968-1)和陰性對照病毒CON238(上海吉凱公司)，RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Thermo公司)，熒光定量PCR試劑盒(日本Takara公司)，RIPA裂解液、BCA試劑盒(美國Thermo公司)，EMT抗體試劑盒(美國Cell Signaling公司)，內(nèi)參抗體(美國Abcam公司)，Western blot二抗試劑盒(美國Invitrogen公司)，PVDF膜(美國Thermo公司)，四甲基偶氮唑鹽MTT(美國Invitrogen公司)，Transwell 小室(美國BD公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染和分選 食管鱗癌細(xì)胞株KYSE150用含有10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液，在37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實驗分為3組：control組 (未轉(zhuǎn)染miR-106b的KYSE150細(xì)胞)、miR-NC組(轉(zhuǎn)染隨機(jī)序列)和miR-106b組 (轉(zhuǎn)染miR-106b的KYSE150的細(xì)胞)，用慢病毒試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染.。將細(xì)胞按約3×105個/孔的密度接種于6孔板中，第2天待細(xì)胞生長達(dá)70%～80%時，按說明書進(jìn)行慢病毒轉(zhuǎn)染，8～12 h后棄去含有病毒的舊培養(yǎng)液，換含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液，在37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h。 每組設(shè)3個復(fù)孔。 轉(zhuǎn)染48 h后，正常程序消化細(xì)胞并收集至15 mL離心管中，各組做好標(biāo)記，1 000 r/min離心5 min,后用無血清的1640培養(yǎng)液每管500 μL重懸，置于冰上，用流式細(xì)胞儀篩選帶有GFP標(biāo)記的轉(zhuǎn)染細(xì)胞。

1.2.2 實時熒光定量RT-PCR檢測各組細(xì)胞的 mRNA 的相對表達(dá)量 收獲各組細(xì)胞，按照 Trizol 試劑盒說明書提取總 RNA。按照PCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。PCR反應(yīng)體系包括TAKARA通用熒光染料SYBR Premix Ex TaqTM10 μL、miRNA上游及下游引物各1 μL 10 μM 、 cDNA產(chǎn)物2 μL、無核酸酶水6 μL，共20 μL。將PCR總反應(yīng)體系混勻，離心。每孔為20 μL PCR反應(yīng)體系，每組設(shè)3個復(fù)孔，離心。采用三步法，反應(yīng)條件：起始激活95℃反應(yīng)3 min；PCR循環(huán)50次，95℃反應(yīng)10 s，58℃反應(yīng)30 s； PCR再進(jìn)行81個循環(huán)，58℃反應(yīng)10 s。結(jié)果采用2-ΔΔCt法進(jìn)行分析。引物由上海生工公司設(shè)計合成(表1)。

表1 反轉(zhuǎn)錄及qRT-PCR所用引物序列表

1.2.3 Western blot實驗 收獲各組細(xì)胞，用RIPA裂解液裂解并提取細(xì)胞總蛋白，BCA試劑盒定量檢測蛋白濃度，將蛋白樣品和4×蛋白上樣緩沖液按3∶1的比例混勻、離心，置于PCR儀中使蛋白變性，100℃ 10 min。以每孔上樣量為50 μg，制備10%SDS-PAGE凝膠進(jìn)行電泳分離。分離的蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，室溫封閉1 h，分別加入1∶1 000稀釋的兔抗人的E-Cadherin抗體、N-Cadherin抗體和GAPDH抗體，于4℃孵育過夜，之后用PBS-Tween20洗膜3次，每次5 min，蒸餾水洗膜1次，每次5 min；加入人抗兔二抗室溫孵育1.5 h，用PBS-Tween20洗膜3次，每次5 min，蒸餾水洗膜1次，每次5 min；加入顯影液顯色，顯出紫色條帶后，用蒸餾水終止顯色，在成像分析系統(tǒng)上成像并進(jìn)行密度分析。以GAPDH為內(nèi)參，計算各組蛋白的相對表達(dá)量。

1.2.4 四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色法(MTT法) 正常消化呈對數(shù)生長期細(xì)胞，96孔板按3×103個/孔接種細(xì)胞，每組設(shè)4個復(fù)孔，每孔體積為200 μL。分別于轉(zhuǎn)染前及轉(zhuǎn)染后24、48、72、96、120 h時，將事先配好的MTT溶液按20 μL/孔加入，37℃、 5% CO2恒溫培養(yǎng)箱孵育4 h后棄去上清液，每孔再加入二甲基亞砜(DMSO)15 μL，搖床上搖10 min，使之充分溶解，見紫色結(jié)晶物出現(xiàn)，用酶標(biāo)儀檢測各組細(xì)胞，在波長為490 nm處測定各孔吸光度值，記錄結(jié)果并繪制生長曲線。

1.2.5 細(xì)胞劃痕實驗 正常消化呈對數(shù)生長期細(xì)胞，6孔板按5×105個/孔接種細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞生長面積達(dá)80%時，用10 μL無菌槍頭劃痕，每孔均勻劃3條線，再用PBS潤洗2遍，棄之，分別于轉(zhuǎn)染前及轉(zhuǎn)染后24、48 h時在倒置顯微鏡下觀察劃痕愈合速度并拍照。

1.2.6 細(xì)胞侵襲實驗 正常消化呈對數(shù)生長期細(xì)胞，Transwell小室按3×105個/孔接種細(xì)胞，用無血清的1640培養(yǎng)液200 μL重懸，下室為10% FBS 1640培養(yǎng)液500 μL，每組設(shè)3個復(fù)孔。分別于48 h后，將Transwell小室用無菌PBS洗2遍，甲醇固定30 min，PBS再次洗2遍，結(jié)晶紫染色30 min后用PBS洗2遍，干燥，在倒置顯微鏡下選取5個視野拍照并計數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 qRT-PCR檢測慢病毒轉(zhuǎn)染KYSE 150細(xì)胞后miR-106b的mRNA的表達(dá)變化control組和miR-NC組較miR-106b組的mRNA表達(dá)水平明顯增高(P<0.05)(圖1)。

2.2 miR-106b基因過表達(dá)后對KYSE150細(xì)胞增殖影響慢病毒轉(zhuǎn)染miR-106b基因后， 0 h和24 h時各組490 nm波長處吸光度值差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，48、72、96、120h時miR-106b組吸光度值明顯高于control組和miR-NC組(P<0.05)(圖2)。

與control組比較，*P<0.05； 與miR-NC組比較，△P<0.05。

圖1 qRT-PCR檢測慢病毒轉(zhuǎn)染KYSE 150細(xì)胞后miR-106b mRNA相對表達(dá)量

與control組比較，*P<0.05； 與miR-NC組比較，△P<0.05。

圖2 MTT檢測miR-106b轉(zhuǎn)染KYSE150后細(xì)胞增殖能力變化

2.3 miR-106b基因過表達(dá)后對KYSE150細(xì)胞遷移能力的影響慢病毒轉(zhuǎn)染miR-106b基因后， 與control組和miR-NC組比較，miR-106b組的遷移能力明顯更強(qiáng)并基本愈合，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而control組與miR-NC組遷移能力比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(圖3)。

2.4 miR-106b基因過表達(dá)后對KYSE150細(xì)胞侵襲能力的影響慢病毒轉(zhuǎn)染miR-106b基因后，與control組和miR-NC組比較，miR-106b組的侵襲能力明顯更強(qiáng)(P<0.05)(圖4)。

2.5 miR-106b基因過表達(dá)后對EMT的影響

2.5.1 miR-106b基因過表達(dá)后E-Cadherin和N-Cadherin的 mRNA的表達(dá)變化 與control組和miR-NC 組比較， miR-106b組E-Cadherin的mRNA表達(dá)水平下降(P<0.05)， N-Cadherin的 mRNA 表達(dá)水平升高(P<0.05) (圖5)。

2.5.2miR-106b基因過表達(dá)后E-Cadherin和N-Cadherin的蛋白的表達(dá)變化Westernblot檢測結(jié)果顯示,E-Cadherin蛋白條帶在135kDa處顯色，N-Cadherin蛋白條帶在140kDa處顯色，GAPDH蛋白條帶在37kDa處顯色。miR-106b組E-Cadherin蛋白的相對表達(dá)量明顯低于control組及miR-NC組細(xì)胞蛋白的相對表達(dá)量,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；miR-106b組N-Cadherin蛋白的相對表達(dá)量顯著高于control組和miR-NC組細(xì)胞蛋白的相對表達(dá)量,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖6)。

a: 劃痕細(xì)胞圖

b: 柱狀圖

與control組比較，*P<0.05； 與miR-NC組比較，△P<0.05。

圖3 細(xì)胞劃痕實驗檢測miR-106b轉(zhuǎn)染KYSE150后細(xì)胞遷移能力變化(放大倍數(shù)×100)

a: 侵襲細(xì)胞圖

b: 柱狀圖

與control組比較，*P<0.05； 與miR-NC組比較，△P<0.05。

圖4 細(xì)胞侵襲實驗檢測miR-106b轉(zhuǎn)染KYSE150后細(xì)胞侵襲能力變化(放大倍數(shù)×100)

a: E-Cadherin的mRNA的相對表達(dá)量 b: N-Cadherin的mRNA相對表達(dá)量

與control組比較，*P<0.05； 與miR-NC組比較，△P<0.05。

圖5 qRT-PCR檢測慢病毒轉(zhuǎn)染KYSE 150細(xì)胞后E-Cadherin和N-Cadherin mRNA相對表達(dá)量

圖6 Western blot 檢測慢病毒轉(zhuǎn)染KYSE 150細(xì)胞后E-Cadherin和N-Cadherin mRNA相對蛋白表達(dá)

3 討論

MiR-106b定位于人類染色體7q22，屬于miR-106b-25基因簇的一員，通過大量的研究表明,miR-106b在腫瘤中被視為癌基因,是與腫瘤生長、細(xì)胞生存和血管形成相關(guān)的miRNA[9]。

已經(jīng)有大量研究證實，miR-106b參與了多種重要的信號通路。在轉(zhuǎn)化生長(TGF-β)因子信號通路中，可以通過調(diào)控p21[10]或EMT相關(guān)信號通路[8]促使腫瘤細(xì)胞逃避TGF-β誘導(dǎo)的生長抑制作用，參與了腫瘤細(xì)胞的遷移、侵襲、凋亡、周期和增殖等生物進(jìn)程[11]。miR-106b基因也是insulin/IGF通路的一部分，通過下調(diào)PTEN的表達(dá)，影響細(xì)胞周期和腫瘤細(xì)胞微環(huán)境[12]。也可通過調(diào)控RB基因來參與細(xì)胞周期進(jìn)程[13]。多項研究報道，miR-106b在肝癌細(xì)胞中促進(jìn)了細(xì)胞的遷移和侵襲[10]。在胃癌細(xì)胞中，miR-106b通過調(diào)控靶基因PTEN來促進(jìn)細(xì)胞的遷移和浸潤[5]。

目前，miR-106b在食管癌方面的表達(dá)及功能研究報道比較少。研究發(fā)現(xiàn)miRNAs的異常表達(dá)可以明顯影響食管癌的進(jìn)程[14]。Kan等[15]用基因芯片和qRT-PCR方法分析食管細(xì)胞(HEEpiC、QhTRT、ChTRT、GihTRT和OE-33)和食管組織(正常上皮組織、Barrett食管組織和食管腺癌組織)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在腫瘤發(fā)生的不同階段，隨著miR-106b基因的擴(kuò)增，miR-106b的表達(dá)量也升高，在細(xì)胞功能實驗和動物實驗中顯示miR-106b具有促增殖、抗凋亡和細(xì)胞周期促進(jìn)作用。本研究顯示,與對照組相比，高表達(dá)miR-106b的KYSE150細(xì)胞促進(jìn)了細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。進(jìn)一步檢測發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)miR-106b的KYSE150細(xì)胞、上皮表型E-Cadherin的表達(dá)明顯降低，間質(zhì)表型N-Cadherin明顯升高，促進(jìn)了EMT的發(fā)生。而高表達(dá)的miR-106b可能通過TGF-β信號通路實現(xiàn)其功能。通常腫瘤細(xì)胞會逃避抑瘤作用，將TGF-β信號轉(zhuǎn)換成促進(jìn)信號，通過該信號誘導(dǎo)維持上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移等[16]。Smith等[17]對乳腺癌的研究發(fā)現(xiàn)，miR-106b可以靶向Smad7來激活TGF-β信號通路和促進(jìn)EMT的發(fā)生。最近，Zhou等[6]研究表明，miR-106b可以通過E-Cadherin介導(dǎo)激活蛋白EP300來調(diào)控EMT的發(fā)生，使乳腺癌細(xì)胞產(chǎn)生對阿霉素的耐藥性。Yau等[10]對肝癌細(xì)胞的研究證實，過表達(dá)miR-106b可以激活EMT，增加肝癌細(xì)胞的運(yùn)動和侵襲能力。然而，也有研究顯示高表達(dá) miR-106b對子宮內(nèi)膜癌起抑制轉(zhuǎn)移的作用[18]?？梢?，miR-106b在不同類型的腫瘤中擁有反應(yīng)癌基因或抑制癌基因的功能。

綜上所述，miR-106b具有促進(jìn)癌細(xì)胞生長的作用，且miR-106b可能通過EMT來促進(jìn)食管癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，但這還需要進(jìn)一步研究證實。本研究結(jié)果可為食管癌的預(yù)防診斷及治療提供新的理論依據(jù)。

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(本文編輯 楊晨晨)

MicroRNA-106b promotes proliferation of esophageal cancer cell and Epithelial-Mesenchymal Transition process

DAI Fang1, LIU Tao1, ZHENG Shutao1, LIU Qing1, WANG Dong1, Ilyar Sheyhidin2, LU Xiaomei2

(1ClinicalMedicalResearchInstitute,theFirstAffiliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversity,2EsophagealCancerResearchInstituteofXinjiangUygurAutonomousRegin,Urumqi830054,China)

Objective To investigate the effects of miR-106b in the esophageal cancer cell proliferation, migration, invasion. Methods Based on KYSE150 cell transfected with miR-106b, the expression of miR-106b and EMT-associated markers were detected by quantitative RT-PCR(qRT-PCR). EMT-associated proteins were measured by western blot and cell proliferation was detected by using MTT assay. In addition, cell migration and invasion ability were evaluated by wound healing assay and transwell assay. Results The results showed that the cell proliferation, migration and invasion was significantly increased in esophageal cancer KYSE150 (P<0.05)aftertransfectedwithmiR-106b.Furthermore,expressionofE-CadherinwassignificantlylowerinthegroupoftransfectedwithmiR-106bthanthecontrolgroup(P<0.05).Meanwhile,expressionofN-Cadherinwashigher(P<0.05). Conclusion The present data revealed that miR-106b could promote the cell proliferation and has potential in effect on EMT process in esophageal cancer.Keywords: miR-106b; cell proliferation; cell migration; cell invation; epithelial-mesenchymal transition (EMT)

國家自然科學(xué)基金(81160303，81260359、U1303321);新疆維吾爾自治區(qū)重大科技專項計劃(201430123-1)

戴 芳(1987-)，女，在讀碩士，研究方向：腫瘤分子病理學(xué)。

盧曉梅，女，博士，教授，研究員，博士生導(dǎo)師，研究方向：消化道腫瘤的轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究，E-mail：luxiaomei88@163.com。

R34;R

A

1009-5551(2015)12-1466-05

10.3969/j.issn.1009-5551.2015.12.002

2015-08-30]