類葉升麻苷對谷氨酸損傷PC12細胞的保護作用*

彭曉明，霍仕霞，高莉，何燕，閆明

(1.新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)藥研究所新疆維吾爾醫(yī)方劑學實驗室，烏魯木齊 830049；2.石河子大學藥學院，石河子 832003)

類葉升麻苷對谷氨酸損傷PC12細胞的保護作用*

彭曉明1，霍仕霞1，高莉1，何燕2，閆明1

(1.新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)藥研究所新疆維吾爾醫(yī)方劑學實驗室，烏魯木齊 830049；2.石河子大學藥學院，石河子 832003)

目的 研究類葉升麻苷對谷氨酸誘導的PC12細胞損傷的影響。方法 將PC12細胞分為正常對照組、模型對照組、陽性藥組和類葉升麻苷給藥組。除正常對照組外，其余各組均以1.5 mmol·L-1谷氨酸處理24 h，再分別以10 μmol·L-1維生素E 和15.625，31.25，62.5，125，250 μmol·L-1類葉升麻苷作用。通過倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)，采用四甲基偶氮唑鹽(MTT)比色法檢測細胞存活率，酶標法試劑盒測定乳酸脫氫酶(LDH)活性，硫代巴比妥酸(TBA)法試劑盒測定丙二醛(MDA)含量，WST[2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯基)-2氫-四唑鹽,二鈉鹽]法試劑盒測定超氧化物歧化酶(SOD)活性，酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測胞內(nèi)活性氧(ROS)含量。結(jié)果 與模型對照組比較，除類葉升麻苷Ⅰ組(15.625 μmol·L-1AS)以外，其余各類葉升麻苷給藥組均可明顯改善PC12細胞形態(tài)，提高細胞存活率和SOD酶活性(P<0.01)，抑制LDH活性及MDA和ROS生成(P<0.01或P<0.01)。結(jié)論 類葉升麻苷對谷氨酸誘導的PC12細胞損傷具有保護作用。

類葉升麻苷；谷氨酸；PC12細胞；損傷；保護作用

谷氨酸是哺乳動物腦內(nèi)含量最高的氨基酸，其作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)中主要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，不僅參與突觸傳遞，還具有神經(jīng)毒性[1-2]。目前研究表明[3]，谷氨酸是引起神經(jīng)退行性疾病——阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)的重要因素。谷氨酸在腦內(nèi)過度釋放可使神經(jīng)細胞內(nèi)鈣離子(Ca2+)和氧自由基升高，誘發(fā)成對螺旋樣細絲(paired helical filaments，PHF)形成，最終導致大量神經(jīng)元死亡[4]。因此，研究安全有效的谷氨酸神經(jīng)毒性阻斷藥物，是臨床神經(jīng)科學急需解決的問題。類葉升麻苷(acteoside，AS)是傳統(tǒng)補益中藥肉蓯蓉中的苯乙醇苷類活性成分。既往研究表明[5-7]，AS對D-半乳糖所致的小鼠AD樣模型、東莨菪堿所致的小鼠學習記憶障礙模型，以及過氧化氫(H2O2)誘導的PC12細胞氧化損傷模型均具有明顯改善作用。以上研究結(jié)果提示，AS在防治AD方面具有潛在應用價值。筆者在本實驗中通過谷氨酸誘導PC12細胞損傷，研究AS對PC12細胞的保護作用，以期為該藥治療AD提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑 AS由新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)藥研究所制備(批號：20130401)，其化學結(jié)構(gòu)經(jīng)磁共振波譜法和質(zhì)譜法確認，高效液相色譜(HPLC)面積歸一化法鑒定含量>90%；RPMI-1640培養(yǎng)液為GIBCO產(chǎn)品(批號：1181347)；胎牛血清為Hyclone產(chǎn)品(批號：NXA0547)。氨芐西林鈉(批號：119A035，含量≥98%)和硫酸鏈霉素(批號：423A058，含量≥98%)購自Solarbio公司。丙酮酸鈉購自天津市光復精細化工研究所(批號：20071022，含量≥99%)。谷氨酸(含量≥99%)為上海源葉生物科技有限公司產(chǎn)品(批號：YY10038)。Rat ROS Elisa Kit購自R&D公司(批號：201311)。乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)測定試劑盒(批號：20131202)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)測定試劑盒(批號：20131202)、微量丙二醛(malondialdehyde，MDA)測定試劑盒(批號：20131130)、二辛可寧酸(bicinchoninic acid, BCA)蛋白含量測定試劑盒(批號：20131204)均購自南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器 超凈工作臺(蘇凈安泰，型號：SW-CJ-1F)，倒置顯微鏡(上海光學六廠，型號：37XB)，二氧化碳(CO2)培養(yǎng)箱(Sanyo，型號：MCO-18AIC)，酶標儀(Thermo Fisher，型號：Multiskan Go 1510)。

1.3 細胞的培養(yǎng) 大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞PC12細胞系(高分化)購自中國科學院細胞庫。將PC12細胞以5×105個·mL-1接種于含10 %胎牛血清、0.11 g·L-1丙酮酸鈉、2.5 g·L-1葡萄糖、1.5 g·L-1碳酸氫鈉(NaHCO3)、100 U·mL-1青霉素和100 U·mL-1鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液中，置于37 ℃，5 %CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每隔3 d換液1次。

1.4 細胞損傷模型的建立及給藥 當培養(yǎng)瓶中PC12細胞融合率達到約80 %時，用含10 %胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液吹打下來，調(diào)節(jié)細胞密度至5×104個·mL-1，以每孔100 μL鋪至96孔培養(yǎng)板。細胞培養(yǎng)48 h后，分別設定8組：①正常對照組(N組，無血清RPMI-1640培養(yǎng)液)；②模型對照組(M組，無血清RPMI-1640培養(yǎng)液)；③陽性藥組(C組，10 μmol·L-1維生素E)；④AS Ⅰ組(15.625 μmol·L-1AS溶液)；⑤AS Ⅱ組(31.25 μmol·L-1AS溶液)；⑥AS Ⅲ組(62.5 μmol·L-1AS溶液)；⑦AS Ⅳ組(125 μmol·L-1AS溶液)；⑧AS Ⅴ組(250 μmol·L-1AS溶液)。除N組外，其余各組均用1.5 mmol·L-1谷氨酸誘導24 h，吸棄培養(yǎng)液，給予上述藥物處理。各組細胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，倒置顯微鏡下觀察形態(tài)并攝像。

1.5 噻唑藍(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)法測定細胞存活率 將細胞接種于96孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)48 h，經(jīng)“1.4”項方法處理后加入MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸棄培養(yǎng)液，加入二甲亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)震蕩溶解，于Multiskan Go 1510酶標儀測定490 nm處吸光度值(A值)，計算細胞存活率。細胞存活率(%)=A給藥/A正常×100%，N組細胞存活率記作100%。

1.6 細胞上清液中生化指標測定 將“1.4”項各組細胞與藥物共培養(yǎng)24 h后，分別收集培養(yǎng)上清液40 μL，根據(jù)說明書測定細胞培養(yǎng)液中LDH活性、MDA含量和SOD活性。

1.7 細胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species，ROS)測定 將細胞按“1.4”項處理，吸棄培養(yǎng)上清液，加入磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution,PBS，pH 7.2～7.4)50 μL，于-80 ℃冰箱反復凍融，以使細胞裂解。然后2 000 r·min-1(r=13.5 cm)離心15 min，收集上清液用于測定蛋白濃度及ROS含量。ROS測定方法：參照試劑盒說明書，稀釋標準品并在酶標包被板上設定標準孔15孔，空白孔3孔。在酶聯(lián)免疫吸附(enzymelinked immunosorbent assay,ELISA)板的空白孔和測定孔中分別加入樣品稀釋液40 μL，吸取測定樣品10 μL加入待測孔。封板膜封板置于37 ℃溫育30 min。小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30 s后棄去，如此重復5次，拍干。然后每孔加入酶標試劑50 μL(空白孔除外)。 37 ℃溫育30 min、洗滌液洗滌5次，拍干。每孔加入顯色劑A和顯色劑B各50 μL，輕輕震蕩混勻，37 ℃避光顯色15 min。每孔加終止液50 μL，450 nm測定A值。之后以標準品濃度為橫坐標，A值為縱坐標，繪制標準曲線并計算線性回歸方程。由線性回歸方程得出測定樣品中的ROS濃度(C)，然后計算樣品中實際ROS濃度。樣品中實際ROS濃度=C(U·mL-1)×稀釋倍數(shù)/待測樣本蛋白濃度(mg·mL-1)。

2 結(jié)果

2.1 AS對PC12細胞損傷后形態(tài)的影響 見圖1。N組PC12細胞輪廓層次較分明，立體感及折光性較強，突觸明顯且較多，數(shù)量也較多。M組細胞輪廓層次較差，神經(jīng)元胞體表面粗糙，且細胞突觸減少。與N組比較，15.625 μmol·L-1AS作用后細胞無明顯改善，其余AS給藥組PC12細胞立體感、折光性增強，細胞突觸增多并交織成網(wǎng)狀，胞質(zhì)內(nèi)顆粒物減少，退化死亡的PC12細胞明顯減少，提示AS在31.25 ～ 250 μmol·L-1濃度范圍內(nèi)對PC12細胞具有保護作用。

2.2 AS對PC12細胞存活率、ROS、LDH、MDA和SOD的影響 見表1。1.5 mmol·L-1谷氨酸誘導PC12細胞24 h后，細胞存活率和SOD活性明顯降低，ROS含量、LDH活性和MDA含量顯著升高，表明谷氨酸致PC12細胞損傷模型誘導成功。與M組比較，ASⅠ組PC12細胞存活率、ROS、LDH、MDA和SOD等無明顯改變，其他AS給藥組PC12細胞存活率和SOD活性顯著提高(P<0.01)，LDH活性和ROS、MDA的生成被抑制(P<0.05，P<0.01)，且隨著給藥濃度的增大，保護作用越強。

3 討論

AD作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病之一，是繼心血管病、腦血管病和惡性腫瘤之后老年人致死的重要誘因。目前其發(fā)病機制主要有膽堿能學說、β-淀粉樣蛋白假說、Tau蛋白假說、神經(jīng)血管假說、氧化應激學說等[8]。近年來越來越多的證據(jù)表明[9-10]，興奮性氨基酸毒性與AD的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系極其密切。谷氨酸是哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)最重要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，參與中樞興奮性突觸傳遞。其介導的信號轉(zhuǎn)導，構(gòu)成記憶和認知的基礎。當腦內(nèi)多余的谷氨酸過度激活谷氨酸受體時，Na+、Ca2+大量內(nèi)流，引起細胞內(nèi)外離子失衡，造成大量神經(jīng)元死亡。研究資料已證實[11]，對谷氨酸的N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartic acid，NMDA)受體進行持續(xù)刺激，可產(chǎn)生神經(jīng)毒性效應。PC12細胞膜上存在大量NMDA受體。在神經(jīng)生長因子(nerve growth factor，NGF)作用下，其與交感神經(jīng)細胞的形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能類似，成為近年來醫(yī)學工作者研究神經(jīng)細胞遞質(zhì)合成、儲存和釋放，以及離子通道及受體的細胞模型。因此本研究利用不同濃度AS作用于谷氨酸誘導損傷后的PC12細胞，從興奮性氨基酸的神經(jīng)毒性方面研究AS對AD的治療作用。結(jié)果表明，AS能顯著改善谷氨酸誘導損傷后的PC12細胞存活率及細胞形態(tài)。神經(jīng)元胞體特征由最初的表面粗糙、細胞突觸和細胞數(shù)量減少，逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)榱Ⅲw感、折光性增強，細胞突觸增多。

A.N組；B.M組；C.C組； D.ASⅠ組； E.ASⅡ組；F.ASⅢ組；G.ASⅣ組； H.ASⅤ組

與N組比較，*1P<0.01；與M組比較，*2P<0.01，*3P<0.05

Compared with group N，*1P<0.01；Compared with group M，*2P<0.01，*3P<0.05

LDH是細胞內(nèi)的標志酶，通常情況下細胞內(nèi)漏出量很少。但細胞受損后，LDH由胞內(nèi)滲漏至胞外。因此，測定細胞上清液中的LDH活性能夠客觀衡量細胞損傷或死亡程度[7]。ROS是以自由基和非自由基形式存在的高度活性的活性氧，普遍存在于細胞內(nèi)。正常生理狀態(tài)，ROS在細胞內(nèi)的濃度受胞內(nèi)內(nèi)源性抗氧化基因的調(diào)控，保持動態(tài)平衡。當機體受外部環(huán)境影響，活性氧動態(tài)平衡被打破，就會使細胞中的DNA、蛋白質(zhì)和細胞膜受到損傷，進而影響有絲分裂、突變及死亡[12]。因此，ROS水平也是細胞損傷程度的重要評價指標。MDA是脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，常作為脂質(zhì)過氧化的評價標準之一。SOD是細胞質(zhì)和線粒體中的一種金屬蛋白酶，也是細胞內(nèi)重要的抗氧化劑，其含量和活性大小是抗氧化能力的直接反映。本研究利用1.5 mmol·L-1谷氨酸誘導PC12細胞24 h后，與M組比較，除ASⅠ組外，其余各給藥組均細胞SOD活性顯著提高，LDH、MDA和ROS的生成抑制。研究結(jié)果提示，AS在31.25～250 μmol·L-1濃度范圍內(nèi)，對谷氨酸所致PC12細胞損傷具有顯著保護作用，其保護機制可能與抗氧化有關(guān)，但具體作用機制仍需進一步研究。

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DOI 10.3870/yydb.2015.03.005

Protective Effects of Acteoside on PC12 Cell Injury Induced by Glutamate

PENG Xiaoming1，HUO Shixia1，GAO Li1，HE Yan2， YAN Ming1

(1.PrescriptionLaboratoryofXinjiangTraditionalUyghurMedicine，InstituteofXinjiangTraditionalUyghurMedicine，Urumqi830049，China;2.PharmaceuticalCollegeofShiheziUniversity，Shihezi832003，China)

Objective To investigate the effect of acteoside on injury PC12 cells induced by glutamate. Methods PC12 cells were assigned into normal control group, model control group, positive drug group and acteoside(AS) treated group.Every group was treated by 1.5 mmol·L-1glutamate for 24 hours except for the control group, and the injury was antagonized by 10 μmol·L-1Vit E and acteoside at different concentration(15.625, 31.25, 62.5, 125 and 250 μmol·L-1).Cell morphology was observed by inverted microscope, cell survival was determined with MTT, LDH activity was measured by enzyme label kit, the MDA content and SOD activity were measured by TBA kit and WST kit, and the ROS was measured by Elisa kit. Results Compared with the model control group, all doses of acteoside could significantly improve the PC12 cell morphology and survival(P<0.05), inhibit LDH activity and production of MDA and ROS (P<0.05), increase the activity of SOD (P<0.05), except for the lowest dose group. Conclusion Acteoside has protective effects on PC12 cells injured by glutamate.

Acteoside; Glutamate; PC12 cell; Injury; Protective effect

2014-03-20

2014-04-15

*新疆維吾爾自治區(qū)科研機構(gòu)創(chuàng)新發(fā)展基金項目(2012015)；新疆維吾爾自治區(qū)公益性科研院所基金項目(KY2013103)

彭曉明(1983-)，男，湖南祁東人，助理研究員，碩士，研究方向：細胞與分子藥理學。電話：0991-2565663，E-mail： pxm1983@163.com。

閆明 (1959-)，男，山西原平人，研究員，碩士，研究方向：藥物分析與新藥研發(fā)。電話：0991-2565663，E-mail：yanming21cn@sohu.com。

R286；R965

A

1004-0781(2015)03-0302-04