腎炎滴丸的制備與藥效學(xué)考察

于麗秀，楊玉，何秋月，陳東生

(華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院藥學(xué)部，武漢 430022)

腎炎滴丸的制備與藥效學(xué)考察

于麗秀，楊玉，何秋月，陳東生

(華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院藥學(xué)部，武漢 430022)

目的 制備腎炎滴丸并考察其藥效學(xué)。方法 正交實驗優(yōu)化腎炎滴丸的制備工藝；采用切除5/6腎的方法建立大鼠慢性腎衰竭模型，考察腎炎滴丸對慢性腎衰竭大鼠尿蛋白及腎臟組織結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)果 腎炎滴丸的最佳制備工藝為PEG4000：PEG6000=2：1，藥物：基質(zhì)=1：3，滴制溫度80 ℃，滴距7 cm；藥效學(xué)結(jié)果顯示：與模型對照組比較，腎炎滴丸組與腎衰丸組大鼠24 h尿蛋白水平均明顯降低(P<0.01)，腎炎滴丸組降低更為顯著(P<0.05)；病理組織檢查結(jié)果顯示治療組大鼠腎小管基本恢復(fù)正常，間質(zhì)有少量炎癥細胞浸潤，腎間質(zhì)纖維組織增生得到較好抑制。結(jié)論 腎炎滴丸制備工藝穩(wěn)定，且對慢性腎衰竭有較好的作用，但最佳治療劑量還有待進一步驗證。

腎炎滴丸；腎衰竭，慢性；尿蛋白

慢性腎衰竭(chronic renal failure，CRF)又稱慢性腎功能不全，是指各種腎臟病導(dǎo)致腎功能漸進性不可逆性減退，直至功能喪失所出現(xiàn)的一系列癥狀和代謝紊亂所組成的臨床綜合征。全球由慢性腎臟病所引起的終末期腎衰竭患者數(shù)量正以每年8%的速度增長[1]，CRF已經(jīng)成為影響我國居民健康的嚴(yán)重疾病。尋找治療CRF的藥物顯得尤為重要，臨床實踐證明腎衰丸在治療急慢性腎炎方面具有一定的優(yōu)勢[2-3]，尤其是在減少蛋白尿方面效果甚好，且對胃腸道刺激小，毒性低，但存在制劑技術(shù)落后、繁瑣等缺陷。為更好服務(wù)于臨床，本課題組在腎衰丸處方(大黃、黃芪、僵蠶、水蛭)[3]不變的基礎(chǔ)上，改進制備工藝，自制腎炎滴丸，并對工藝進行優(yōu)化及藥效學(xué)探討，為今后的進一步開發(fā)提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物 無特定病原體(specefic pathogen free，SPF) 級健康Wistar大鼠50 只，雄性，體質(zhì)量(180±20) g，由湖北省疾病預(yù)防控制中心實驗動物中心提供，并常溫飼養(yǎng)于華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院動物中心SPF級動物實驗室。動物質(zhì)量合格證號：第00019249號，使用許可證號：SYXK(鄂)2010-0057。

1.2 試藥與試劑 黃芪、大黃(安徽廣印堂制藥有限公司，批號分別為20110226，20110307)，水蛭、僵蠶(安徽亳州市藥材總公司中藥公司，批號分別為20101216，20110118)，均經(jīng)華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院天然藥物教研室鑒定；聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)4000，6000(國藥集團化學(xué)試劑有限公司，批號分別為T20100531，20100824)；腎衰丸(華中科技大學(xué)大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院藥學(xué)部制備，批號：20120223)；其他試劑為分析純。

1.3 儀器 自制滴丸設(shè)備；十萬分之一分析天平(AUW220D型，日本島津公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(RE-52AA型，上海亞榮生化儀器廠)；恒溫真空干燥箱(DZF-150 數(shù)顯型，鄭州長城科工貿(mào)有限公司)。

1.4 方法

1.4.1 腎炎滴丸的制備 分別取適量黃芪、大黃粉碎后，按腎衰丸組方比例混合后，置于圓底燒瓶中，加入10倍量70%乙醇浸提2 h，提取兩次，濾過，合并濾液，回收乙醇，減壓濃縮至相對密度1.26～1.30，恒溫真空干燥箱中干燥，得到藥粉備用。取處方量過篩的水蛭、僵蠶兩味中藥，與黃芪大黃藥渣一同置于圓底燒瓶中，加入10倍量水煎2次，過濾，合并濾液，減壓濃縮至相對密度1.26～1.30，恒溫真空干燥箱中干燥，得到藥粉備用[4-6]。將基質(zhì)(PEG4000與PEG6000)按一定比例混合，水浴加熱至澄明，然后加入干燥的藥粉(藥物與基質(zhì)按照一定的比例)，混合均勻，進行滴制，取出滴丸，除去其表面的冷凝液，即得腎炎滴丸。

1.4.2 正交實驗優(yōu)化腎炎滴丸的制備工藝 由預(yù)實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)影響腎炎滴丸成型工藝的幾個主要影響因素分別為：PEG4000：PEG6000(A)、藥物：基質(zhì)(B)、滴制溫度(C)、滴距(D)。每個因素各取3個水平，正交實驗因素水平表見表1。

表1 正交實驗因素水平

1.4.3 制備工藝考察 按照《中華人民共和國藥典》2010年版一部附錄IK滴丸項下的檢查項目(質(zhì)量差異檢查法和溶散時限檢查法)對制備的滴丸進行考察測定。

1.4.4 腎炎滴丸藥效學(xué)考察

1.4.4.1 動物模型的建立 用10%水合氯醛麻醉大鼠，距左脊肋骨1.5 cm處斜向外方切口，暴露左側(cè)腎臟，分離腎周圍脂肪囊后，用絲線離斷結(jié)扎上下極腎組織各約1/3，復(fù)位腎臟，縫合。1周后切除整個右腎，2次手術(shù)共切除5/6腎臟即為模型對照組大鼠。大鼠麻醉后，僅暴露雙側(cè)腎臟，剝離腎周脂肪組織后，復(fù)位縫合即為假手術(shù)組大鼠。

1.4.4.2 實驗動物分組及給藥 雄性Wistar大鼠40只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，按體質(zhì)量隨機分為4組：假手術(shù)組、模型對照組、腎衰丸組、腎炎滴丸組，每組10只。大鼠模型建立后，每天分早晚兩次給藥，其中假手術(shù)組、模型對照組灌服等量溫?zé)?.9%氯化鈉溶液；腎衰丸組灌服腎衰丸0.9%氯化鈉溶液混懸液，相當(dāng)于給予腎衰丸45 mg·kg-1·d-1；腎炎滴丸組灌服腎炎滴丸0.9%氯化鈉溶液混懸液，相當(dāng)于給予腎炎滴丸0.48 mg·kg-1·d-1。以上各組大鼠均自由飲水和進食，連續(xù)灌胃給藥8周，末次給藥后收集大鼠24 h尿液，并禁食12 h。第2天迅速脫頸處死大鼠，取出殘腎，留取腎皮質(zhì)，置于10%甲醛溶液中固定。

1.4.4.3 觀察指標(biāo) 24 h尿蛋白：末次給藥后，收集各組大鼠24 h尿液，測定其尿蛋白含量。腎臟病理組織切片：取10%甲醛溶液中固定的殘腎皮質(zhì)，按常規(guī)方法脫水、石蠟包埋、切片作蘇木精-伊紅(hematoxylin and eosin,HE)染色以觀察腎組織變化情況。

2 結(jié)果

2.1 正交實驗結(jié)果 以圓整度、流動性、硬度、丸重差異為評價指標(biāo)，由正交實驗結(jié)果(表2)和方差分析(表3)結(jié)果可知：影響腎炎滴丸成形性的主要因素D>A>B>C，其中A對腎炎滴丸的成形性差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，故而腎炎滴丸的最佳滴制工藝為A2B2C3D3，即PEG4000：PEG6000=2：1、藥物：基質(zhì)=1：3、滴制溫度80 ℃、滴距7 cm。

表2 正交實驗設(shè)計表L9(34)及結(jié)果

Tab.2 Design and results of orthogonal test(L9(34))

實驗號因素A(PEG4000PEG6000)B(藥物基質(zhì))C(滴制溫度)D(滴距)綜合評分/分1111116.32122218.43133318.04212317.85223117.16231216.97313218.48321319.79332117.2K117.26717.53317.66716.900K218.46718.43317.83317.933K317.73317.46717.93318.600R1.1660.9660.2661.700

表3 正交實驗的方差分析

按正交實驗獲得的優(yōu)化處方制備3批腎炎滴丸。實驗結(jié)果表明，3批腎炎滴丸的質(zhì)量差異(RSD<10%)和溶散時限(<30 min)均符合要求，所選工藝條件合理穩(wěn)定。結(jié)果見表4。

表4 正交實驗驗證結(jié)果

Tab.4 Results of verification experiment on orthogonal testn=6

2.2 腎炎滴丸藥效學(xué)考察結(jié)果

2.2.1 24 h尿蛋白的變化 由圖1可知，模型對照組24 h尿蛋白水平顯著高于假手術(shù)組(P<0.01)，與CRF的實驗?zāi)Ｐ拖嘁恢拢慌c模型對照組比較，腎衰丸組、腎炎滴丸組兩組24 h尿蛋白水平顯著降低(P<0.01)，腎炎滴丸組24 h尿蛋白水平較腎衰丸組亦有降低，且兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.2.2 組織病理學(xué) 見圖2，假手術(shù)組切面皮質(zhì)髓界限清晰，間質(zhì)炎癥細胞極少，間質(zhì)寬度均勻。模型對照組切面見腎皮質(zhì)增厚，皮髓質(zhì)分界模糊，腎小管萎縮，間質(zhì)炎癥細胞浸潤，間質(zhì)增寬，呈典型的CRF表現(xiàn)；腎衰丸組切面可見腎皮質(zhì)稍增厚，皮髓質(zhì)分界稍模糊，腎小管萎縮，間質(zhì)炎癥細胞浸潤，間質(zhì)略增寬，但較模型對照組清晰，腎功能得到改善；腎炎滴丸組切面可見腎皮質(zhì)略增厚，皮髓質(zhì)分界清晰，且較腎衰丸組清晰，腎小管基本恢復(fù)正常，間質(zhì)有少量炎癥細胞浸潤，腎間質(zhì)纖維組織增生得到了較好的抑制，腎功能得到改善。

A.假手術(shù)組；B.模型對照組；C.腎衰丸組；D.腎炎滴丸組；與模型對照組比較，F(xiàn)=75.39，*1P<0.01，F(xiàn)=68.98，*2P<0.01，F(xiàn)=143.88，*3P<0.01；與腎衰丸組比較，F(xiàn)=9.84，*4P<0.05

圖1 4組大鼠24 h尿蛋白結(jié)果

A.sham operation group；B.model control group；C.renal failure pill group；D.nephritis dripping pill group；Compared with model control group，F(xiàn)=75.39，*1P<0.01，F(xiàn)=68.98，*2P<0.01，F(xiàn)=143.88，*3P<0.01；compared with renal failure pill group，F(xiàn)=9.84，*4P<0.05

Fig.1 Results of 24 h urine protein in four groups of rats

3 討論

目前西醫(yī)尚未找到除透析和腎臟移植之外的比較有效的治療CRF方法，而中醫(yī)在預(yù)防治療CRF方面有較大的潛力。中醫(yī)藥采用辨證論治，給予益氣健脾、活血化瘀、滋陰補腎、瀉毒清濁之藥，對患者整體進行微調(diào)治療，適宜該病的預(yù)防與治療。腎炎滴丸在腎衰丸的基礎(chǔ)上依據(jù)上述原則，由大黃、黃芪、僵蠶、水蛭組成，具有多方面的藥理活性，可以針對慢性腎炎的癥狀與病因進行良好的糾正與施治。大黃具有瀉下攻積、清熱瀉火、涼血解毒、活血祛瘀之功效。黃芪作為我國歷來最被推崇的補氣藥之一，具有中等利尿作用，能顯著減少尿蛋白，在腎病的治療方面應(yīng)用廣泛，研究表明，黃芪通過核酸和蛋白水平抑制轉(zhuǎn)化生長因子-β1的表達，抑制腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化，同時抑制結(jié)締組織生長因子高表達，從而減輕和改善大鼠腎間質(zhì)纖維化[7-8]，黃芪也可通過抑制磷酸化MKK3/6和磷酸化p38MAPK蛋白的表達，發(fā)揮抑制白細胞介素-1β，誘導(dǎo)腎小球系膜細胞(mesangial cells，MCs)增殖作用，能抑制MCs的細胞外基質(zhì)積聚，從而減輕腎小球硬化，起到腎保護作用，延緩腎臟病進展。僵蠶主要含蛋白質(zhì)、脂肪，尚含多種氨基酸以及鐵、鋅、銅、錳、鉻等微量元素，既能息風(fēng)止痙，又能化痰定驚。水蛭有破血逐瘀通經(jīng)的功效，可用于DN的治療[9]。

A.假手術(shù)組； B.模型對照組；C.腎衰丸組；D.腎炎滴丸組

腎炎滴丸根據(jù)CRF的病因進行相應(yīng)的組方，可對因和對癥治療。本研究結(jié)果顯示，與模型對照組和腎衰丸組比較，腎炎滴丸組大鼠24 h尿蛋白水平顯著降低(P<0.01或P<0.05)。病理組織檢查結(jié)果亦表明腎炎滴丸對CRF大鼠有良好的治療作用。腎炎滴丸可以明顯降低CRF大鼠的蛋白尿，提示腎炎滴丸有較好的治療效果。綜上所述，腎炎滴丸在預(yù)防與治療CRF方面有其作用的效應(yīng)物質(zhì)基礎(chǔ)，其最佳劑量還有待進一步驗證。

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DOI 10.3870/yydb.2015.05.013

Preparation of Nephritis Dripping Pills and Its Pharmacodynamic Studies

YU Lixiu, YANG Yu, HE Qiuyue, CHEN Dongsheng

(DepartmentofPharmacy,UnionHospital,TongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430022,China)

Objective To prepare nephritis dripping pills and study its pharmacodynamic effects. Methods The preparation of nephritis dripping pills was optimized by using orthogonal method.The model of chronic renal failure was established through resection of 5/6 kidney, the effect of nephritis dripping pills on rats was investigated by urinary protein and renal pathology analysis. Results The optimal preparation for nephritis dripping pills was as follows：taking PEG4000：PEG6000 =2：1, drug：matrix =1：3,setting temperature at 80 ℃ and dropping distance as 7 cm.The pharmacodynamic results showed that: compared with the model control groups, the nephritis dropping pills and renal failure pills significantly reduced the 24 h urine protein levels (P<0.01)，and the nephritis dripping pills were significant superior to renal failure pills (P<0.05).The histopathological results showed that the renal tubular of treated groups remitted to normal, renal interstitial presented a small amount of inflammation cell infiltration and renal interstitial fibrosis was suppressed. Conclusion The preparation of nephritis dripping pills is relatively stable，and has good therapeutic effects on chronic renal failure，but the optimal dose should be further verified.

Nephritis dripping pill; Renal failure，chronic; Urinary protein

2014-04-09

2014-07-18

于麗秀(1981-)，女，山東青島人，主管藥師，碩士，研究方向：中藥藥理及制劑。電話：027-85726073，E-mail：ylx120515@163.com。

陳東生(1954-)，男，陜西富平人，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事醫(yī)院藥學(xué)、中藥藥理學(xué)研究。電話：027-85726073，E-mail：yjkchen@163.com。

R286；R283

A

1004-0781(2015)05-0617-04