匹伐他汀對野百合堿誘導(dǎo)大鼠肺動脈高壓的作用及其機制

周述博，張本斯

(大理學(xué)院人體解剖教研室，大理 671000)

匹伐他汀對野百合堿誘導(dǎo)大鼠肺動脈高壓的作用及其機制

周述博，張本斯

(大理學(xué)院人體解剖教研室，大理 671000)

目的 探討匹伐他汀在防治肺動脈高壓中的作用及其可能機制。方法 雄性斯?jié)娎鄹瘛ざ嗬?SD)大鼠50只，隨機分為5組(n=10)，分別為正常對照組、模型對照組、匹伐他汀預(yù)防組(1 mg·kg-1·d-1)和匹伐他汀大劑量(3 mg·kg-1·d-1)治療組、小劑量(1 mg·kg-1·d-1)治療組。除正常對照組外，其余4組均通過皮下注射野百合堿55 mg·kg-1，誘導(dǎo)大鼠形成肺動脈高壓。8周后，比較各組存活率、平均肺動脈高壓(mPAP)、血小板源性生長因子-B(PDGF-B)、Rac1mRNA的表達(dá)及白細(xì)胞介素-6(IL-6)分泌水平。結(jié)果 匹伐他汀預(yù)防組、正常對照組大鼠均存活，匹伐他汀小劑量治療組、大劑量治療組與模型對照組小鼠存活率分別為60.0%，80.0%，40.0%(P<0.01)；與模型對照組比較，匹伐他汀治療組mPAP均降低(均P<0.01)，肺組織PDGF-B表達(dá)、IL-6分泌及Rac1基因表達(dá)均降低(均P<0.01)。結(jié)論 匹伐他汀可能是通過對Rac1基因和PDGF-B表達(dá)的調(diào)節(jié)以抑制肺動脈平滑肌細(xì)胞增殖和抑制IL-6分泌等機制防治肺動脈高壓。

匹伐他??；野百合堿;肺動脈高壓;血管平滑肌

肺動脈高壓(pulmonary arterial hypertension，PAH)是在多種致病因素下使肺血管阻力增高及肺順應(yīng)性減退并肺血管重塑，最終發(fā)展為右心衰竭的一種病理生理過程[1]，具體的發(fā)生機制尚不完全清楚，已證實多種體液因素如內(nèi)皮素及生長因子等參與肺血管纖維化的發(fā)病過程，并使肺血管平滑肌細(xì)胞增殖。他汀類藥物已被證實具有抗血管平滑肌增殖、抗炎、抗凋亡作用，對小G蛋白翻譯后的修飾有抑制作用，可中斷細(xì)胞內(nèi)信號的傳導(dǎo)[2]。小G蛋白是一種具有GTP酶活性且相對分子質(zhì)量小的蛋白。Rac1是小G蛋白的一個亞群；血小板源性生長因子B(platelet-derived growth factor B，PDGF-B)在血管平滑肌增殖中起重要的調(diào)節(jié)作用；白細(xì)胞介素-6( interleukin-6，IL-6)是一種重要的炎癥遞質(zhì)。匹伐他汀屬于他汀類新型調(diào)脂藥。筆者通過觀察Rac1、PDGF-B和IL-6變化，進(jìn)一步闡明PAH形成及匹伐他汀對PAH的治療機制。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑與儀器 雄性斯?jié)娎鄹瘛ざ嗬?Sprague Dawley，SD)大鼠，無特定病原體(specific pathogen free，SPF)級，體質(zhì)量(253.8±14.2) g，由昆明動物實驗中心提供，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(滇)2011-004，動物使用合格證號：0024150。野百合堿(上海純優(yōu)生物有限公司，含量：98%，批號：P1014)，匹伐他汀鈣片(日本Kowa Company，Ltd，規(guī)格：每片2 mg，批號：20130101)，大鼠PDGF-B抗體(Bia-Swamp公司，批號：BSA-10308)，二抗及二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine，DAB)顯色試劑盒(上?；鶢栴D生物制劑公司，批號：201310A)，IL-6酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒(美國Rapidbio公司，批號：201310)，TRIZOL試劑(天根公司，批號：HG1310281004)，灌胃液均按每組設(shè)定的匹伐他汀的量用滅菌水稀釋至2 mL。大鼠右心導(dǎo)管(大理學(xué)院生理學(xué)教研室)，聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)擴增儀(德國Eppendorf公司)，熒光定量PCR儀(Applied Biosystems公司的7700型)。

1.2 動物分組與干預(yù)方法 大鼠50只，隨機分為5組，每組10只，分別為正常對照組、模型對照組、匹伐他汀預(yù)防組(1 mg·kg-1·d-1)和匹伐他汀大劑量(3 mg·kg-1·d-1)治療組、小劑量(1 mg·kg-1·d-1)治療組。除正常對照組外其余4組均通過皮下注射野百合堿55 mg·kg-1，誘導(dǎo)大鼠形成PAH[3-4]。其中匹伐他汀預(yù)防組自野百合堿皮下注射當(dāng)日起每日給予匹伐他汀(1 mg·kg-1·d-1)灌胃至第8周末；匹伐他汀大劑量組(3 mg·kg-1·d-1)和小劑量組(1 mg·kg-1·d-1)在第4周末開始給予匹伐他汀相應(yīng)劑量灌胃至第8周末。模型對照組和正常對照組給予0.9%氯化鈉溶液灌胃至第8周末。

1.3 血流動力學(xué)測定 用10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠后，參照孫波等[2]介紹的方法，血流動力學(xué)測定主要記錄平均肺動脈壓(mean pulmonary artery pressure，mPAP)，用右心導(dǎo)管及生理記錄儀記錄。

1.4 肺動脈形態(tài)學(xué)觀察 取右中肺約200 mg，經(jīng)石蠟切片、蘇木精-伊紅(hematoxylin and eosin，HE)染色后，顯微鏡下雙盲閱片，對肺小動脈管壁厚度進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，每張切片均選取3～5個肺小動脈測量血管內(nèi)外徑，其差值為血管壁厚度(wall thickness，WT)，血管壁厚度百分比=(管壁厚度×2)/外徑×100%，計算其平均值。

1.5 右心室肥厚的判斷 將心臟分離為右心室游離壁(right ventricular free wall，RV)和左心室加室間隔(left ventricle+ventricular septal，LV+S)，用濾紙吸干后稱其質(zhì)量，計算RV/(LV+S)比值，判斷右心室的肥厚程度。

1.6 肺組織中PDGF-B免疫組化染色和結(jié)果判斷 取肺組織經(jīng)石蠟切片后再免疫組化染色，依次脫蠟、抗原修復(fù)、用過氧化氫消除內(nèi)源性過氧化物酶、滴加一抗、再滴加二抗、DAB顯色等步驟。以棕黃色反應(yīng)物為陽性信號，每張切片選取直徑100～150 μm肺小動脈3～5支，染色深淺表示PDGF-B的表達(dá)強度。

1.7 RT-PCR法檢測肺組織Rac1的mRNA 引物合成由天根公司完成Rac 1引物序列：上游5′-CCTGCTCATCAGTTACACGAC- 3′，下游5′-GACGC-AGTCTGTCATAATCTT- 3′，擴增片段長度為180 bp。β-actin基因為內(nèi)參照，上游5′-CACCCGCG-AGTACAACCTTC-3′，下游5′-CCCATACCCACCATC-ACACC-3′，擴增長度片段為244 bp。PCR過程按照說明書進(jìn)行，擴增條件如下：①95 ℃、3 min預(yù)變性；②95 ℃、20 s變性，60 ℃、30 s退火延伸，40個循環(huán)。實時熒光定量PCR 分析：分別測定每個樣品Rac1和β-action mRNA 的Ct值，為了減少操作誤差，將每個樣品均作復(fù)孔。Ct值表示每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號達(dá)到設(shè)定的閾值時經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。采用相對定量方式表示各樣品Rac1的ΔCt。再按照ΔΔCt=ΔCt目的基因-ΔCt參照基因，計算2-ΔΔCt。在對PCR反應(yīng)過程中的每一個循環(huán)的系統(tǒng)熒光強度進(jìn)行實時監(jiān)測的過程中，根據(jù)擴增曲線確定Ct值，利用2-ΔΔCt法計算Rac1相對拷貝數(shù)。

1.8 ELISA檢測肺組織中IL-6 取已凍存的肺組織100 mg，剪碎，取滅菌水0.9 mL稀釋勻漿后，2 000 r·min-1(r=3 cm)離心10 min，取上清液50 μL用于檢測，按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作。

2 結(jié)果

2.1 實驗動物一般狀況 匹伐他汀預(yù)防組、正常對照組大鼠均存活。正常對照組大鼠強壯、呼吸平穩(wěn)；模型對照組、匹伐他汀小劑量治療組、匹伐他汀大劑量治療組大鼠在腹腔注射野百合堿1周后，3組大鼠較正常對照組均有不同程度活動減少，食量減少，至第 2 周末開始出現(xiàn)體質(zhì)量下降，部分大鼠出現(xiàn)喘息，第 3 周末上述癥狀更嚴(yán)重，鼻、唇發(fā)紺，至第4周末時模型對照組和匹伐他汀大劑量治療組各死亡1只，匹伐他汀小劑量治療組死亡2只；匹伐他汀大劑量、小劑量治療組在4周末給予匹伐他汀治療后，大鼠呼吸逐漸平穩(wěn)，體質(zhì)量開始增加，并且大劑量治療組優(yōu)于小劑量治療組；至8周末時模型對照組共死亡6只，匹伐他汀大劑量治療組死亡2只，匹伐他汀小劑量治療組死亡4只，匹伐他汀預(yù)防組和正常對照組無死亡。匹伐他汀小劑量治療組、大劑量治療組與模型對照組小鼠存活率分別為60.0%，80.0%，40.0%(χ2=2.326，P<0.01)。解剖死亡大鼠，可見胸腔積液，肺部有瘀點、瘀斑，且可見右心室游離壁明顯肥厚。

2.2 血液動力學(xué)測定和肺小動脈形態(tài)學(xué)、右心室肥厚判定 與正常對照組和匹伐他汀預(yù)防組、大劑量治療組、小劑量治療組比較，模型對照組mPAP值、肺小動脈管壁增厚程度及右心室肥厚程度顯著升高(1.476≤F≤13.264，均P<0.01)；匹伐他汀預(yù)防組、大劑量治療組、小劑量治療組上述指標(biāo)組間比較均差異有統(tǒng)計學(xué)意義(2.481≤F≤10.259，均P<0.05)，見表1和圖1。

2.3 肺組織中PDGF-B的表達(dá)情況 與模型對照組比較，匹伐他汀大劑量治療組、小劑量治療組及預(yù)防組的PDGF-B基因表達(dá)均不同程度抑制，均明顯低于模型對照組(1.354≤F≤13.368，均P<0.01)，匹伐他汀大劑量治療組及小劑量治療組間比較上述指標(biāo)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(1.375≤t≤6.316，P<0.05)，見表1和圖2。

2.4 實時熒光定量PCR檢測及ELISA檢測結(jié)果 Rac1 mRNA的表達(dá)在正常對照組中較低，匹伐他汀預(yù)防組和大、小劑量治療組較高，模型對照組最高(2.489≤F≤14.264，均P<0.01)；IL-6的表達(dá)量同樣是模型對照組最高，各組值明顯降低(3.549≤F≤13.470，均P<0.01)，見表1。

表1 5組大鼠各觀察指標(biāo)比較

組別大鼠數(shù)mPAP/mmHgWT/%RV/(LV+S)PDGF-BRac1mRNA陽性率%IL-6/(ng·L-1)正常對照組1017.32±1.21*118.87±3.12*10.34±0.01*112.92±2.470.97±0.12*135.69±3.62*1模型對照組1036.18±4.5157.01±4.380.55±0.0235.42±4.101.96±0.2587.49±5.28匹伐他汀預(yù)防組1024.20±2.31*135.37±2.15*10.37±0.01*119.30±3.62*11.57±0.28*154.38±2.37*1匹伐他汀 小劑量治療組1028.49±3.39*1*237.28±1.04*1*20.40±0.01*1*224.27±2.63*1*21.71±0.11*165.12±4.86*1 大劑量治療組1025.70±2.56*141.04±3.70*10.38±0.02*117.38±2.78*11.53±0.20*150.18±4.27*1

與模型對照組比較，*1P<0.01；與匹伐他汀大劑量治療組比較，*2P<0.05

Compared with model control group，*1P<0.01；compared with high-dose pitavastatin group，*2P<0.05

A.正常對照組； B.模型對照組； C.匹伐他汀預(yù)防組； D.匹伐他汀小劑量治療組； E.匹伐他汀大劑量治療組

A.normal control group；B.model control group；C.pitavastatin prevention group；D.low-dose pitavastatin group；E.high-dose pitavastatin group

Fig.1 Histopathology of pulmonary arteriole in five groups of rats(HE，×400)

A.正常對照組； B.模型對照組； C.匹伐他汀預(yù)防組； D.匹伐他汀小劑量治療組； E.匹伐他汀大劑量治療組

A.normal control group；B.model control group；C.pitavastatin prevention group；D.low-dose pitavastatin group；E.high-dose pitavastatin group

Fig.2 Immunohistochemical stain on PDGF-B in pulmonary tissue in five groups of rats(ISH，×400)

3 討論

PAH是臨床常見的病理生理過程，常繼發(fā)于心肺等多種疾病。隨著細(xì)胞和分子水平研究深入，目前對PAH發(fā)病機制及治療的研究有很大進(jìn)展[5-6]。新的治療藥物及方法也逐漸增多，他汀類藥物就是其中的一種。他汀類藥物為3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶抑制藥，除具有較強的降脂作用外，還具有抗血管平滑肌細(xì)胞增殖、抗調(diào)亡、抗氧化及抑制炎性因子產(chǎn)生等作用[7-8]。匹伐他汀在治療PAH中的抗炎作用筆者尚未見報道。本研究結(jié)果證實，匹伐他汀可以減少肺組織中IL-6的分泌，從而產(chǎn)生抗炎作用，并能在一定程度上逆轉(zhuǎn)PAH的發(fā)生。IL-6作為一種炎癥遞質(zhì)，在炎癥的發(fā)生、發(fā)展過程中有著重要地位[9]。目前，PAH發(fā)生機制雖未明確闡明，但認(rèn)為IL-6可介導(dǎo)肺血管平滑肌免疫和炎性反應(yīng)，并產(chǎn)生大量如C-反應(yīng)蛋白等急性炎性反應(yīng)產(chǎn)物；促進(jìn)誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶增加，使心肌環(huán)磷酸鳥苷水平升高，鈣內(nèi)流減少，最終出現(xiàn)肺動脈彈性減退，所以在PAH進(jìn)展中，由于各種因素導(dǎo)致炎癥反應(yīng)，引起IL-6在肺組織分泌增加，而IL-6又可進(jìn)一步損傷肺動脈，由此形成惡性循環(huán)。

研究顯示，他汀類藥物可以影響血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移，且能有效治療PAH[10]。推測可能的機制是與其誘導(dǎo)肺動脈平滑肌細(xì)胞或血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡、抑制靶細(xì)胞增殖有關(guān)，但是在PAH的進(jìn)展中，有關(guān)對肺動脈平滑肌細(xì)胞增殖的細(xì)胞因子暫未具體闡明。在本實驗中，通過對各組大鼠肺組織PDGF-B表達(dá)量的測定，結(jié)果表明對已誘導(dǎo)形成PAH的大鼠肺組織PDGF-B的表達(dá)量較正常大鼠增多，由此推測，PDGF-B的表達(dá)增多在一定程度上促進(jìn)肺動脈平滑肌細(xì)胞增殖。并且在使用匹伐他汀干預(yù)治療后，PDGF-B在肺組織中的表達(dá)量較模型對照組減少，進(jìn)一步提示匹伐他汀能夠通過抑制PDGF-B的表達(dá)而逆轉(zhuǎn)PAH的進(jìn)展。 PDGF-B 由巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，主要促進(jìn)細(xì)胞增殖及平滑肌纖維化[11]。所以可以推導(dǎo)，在PAH形成過程中，多種因素使肺組織產(chǎn)生炎癥反應(yīng)、巨噬細(xì)胞增多，PDGF-B表達(dá)增加，從而使肺血管平滑肌細(xì)胞增殖。

Rho家族成員中的GTP激酶(Rho GTPases)是Ras GTP激酶(Ras GTPase)超家族的一個主要分支，目前在哺乳動物細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)有8個亞群，共22種，Rac就是其中的一個亞群，并且Rac1是廣泛表達(dá)并且研究最多的亞型[12]。各種因素如低氧引起肺動脈平滑肌細(xì)胞Rac1激活，介導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)，ROS生成及肺動脈平滑肌細(xì)胞增殖促進(jìn)PAH形成[13-14]。

筆者在本實驗中同時觀察Rac1與PDGF-B、IL-6，旨在進(jìn)一步闡明PAH的進(jìn)展和匹伐他汀治療PAH的具體機制。由實驗結(jié)果可以推測：在PAH發(fā)生的各種致病因素如低氧誘導(dǎo)肺血管的Rac1激活，進(jìn)而介導(dǎo)細(xì)胞外向細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)，引起PDGF-B的表達(dá)，促進(jìn)肺血管增殖及炎癥遞質(zhì)如IL-6的產(chǎn)生而發(fā)生炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致肺血管重塑。另外研究表明[15]，低氧誘導(dǎo)Rac1激活，可介導(dǎo)ROS誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞核因子-κB1激活，活化的核因子-κB1可進(jìn)一歩激活炎性因子IL-6，而IL-6又能誘導(dǎo)ROS的大量產(chǎn)生，形成惡性循環(huán)，導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞炎性損傷，發(fā)生凋亡。本實驗結(jié)果也與此相符。但是在PAH的發(fā)生過程中，Rac1對肺組織中IL-6產(chǎn)生及PDGF-B的表達(dá)具體如何調(diào)控，還有待進(jìn)一步研究。

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DOI 10.3870/yydb.2015.05.002

Effects and Mechanism of Pitavastatin on Monocrotaline-induced Pulmonary Arterial Hypertension in Rats

ZHOU Shubo,ZHANG Bensi

(TeachingandResearchSectionofHumanAnatomy，DaliCollege，Dali671000,China)

Objective To investigate the effects and mechanism of pitavastatin on monocrotaline (MTC)-induced pulmonary arterial hypertension (PAH) in rats. Methods A total of 50 male Sprague-Dawley rats were randomly divided into five groups (n=10 each)：pitavastatin treatment at low dose (1 mg·kg-1·d-1)，high dose (3 mg·kg-1·d-1)，pitavastatin prevention regimen (1 mg·kg-1·d-1), the model control, and the normol control group. PAH was induced by applying a single subcutaneous injection of MTC(55 mg·kg-1)in the first four groups of rats. The treatment lasted for 8 weeks.At the end of the study，survival rates and mean pulmonary arterial pressure(mPAP) among groups were compared.The expression levels of platelet-derived growth factor-B(PDGF-B)and IL-6,Rac1 mRNA in small pulmonary artery were also detected. Results All rats in the prevention protocol and normal control group survived.Pitavastatin treatment improved survival in the treatment protocol(P<0.01).The survival rate in the low dose, high dose, and model control group was 60.0%, 80.0%, and 40.0%, respectively.Pitavastatin in both prevention and treatment protocol significantly lowered mPAP (P<0.01).Pitavastatin also inhibited PDGF-B and IL-6 expression (P<0.01)，and inhibited Rac1 mRNA expression in lung tissues (P<0.01). Conclusion Pitavastatin reduces mPAP in the MTC-induced PAH rat model, the mechanism of which may be related to inhibition of Rac1 expression，smooth muscle cell proliferation and inflammatory mediator IL-6.

Pitavastatin; Monocrotaline;Pulmonary arterial hypertension; Vascular smooth muscle

2014-03-26

2014-06-20

周述博(1986-)，男，湖南邵陽人，醫(yī)師，碩士，研究方向：肺動脈高壓。電話：(0)18587201753，E-mail：43602984@qq.com。

張本斯(1969-)，女，云南梁河人，教授，研究方向：形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)與臨床。電話：0872-2257104，E-mail：ben-si-zhang@163.com。

R972.6；R965

A

1004-0781(2015)05-0569-05