參附注射液對缺氧缺血性腦損傷新生大鼠腦保護(hù)機制研究

劉文強 王軍 徐艷 韓愛民 楊倩倩

參附注射液對缺氧缺血性腦損傷新生大鼠腦保護(hù)機制研究

劉文強 王軍 徐艷 韓愛民 楊倩倩

目的 探討參附注射液對缺氧缺血性腦損傷(HIBD)新生大鼠皮質(zhì)區(qū)鈣離子相關(guān)蛋白鈣網(wǎng)蛋白(CRT)的表達(dá)、細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度以及神經(jīng)元凋亡的影響，探討其可能的腦保護(hù)機制。方法 將7日齡新生SD大鼠隨機分為對照組、缺氧缺血組和參附干預(yù)組，各組進(jìn)一步分為缺氧缺血后3、6、12、24、72 h 5個亞組，每組均10只。參照Rice等法制備HIBD模型。參附干預(yù)組于造模成功后立即腹腔注射參附注射液10 mL/(kg·d)，連用3 d。缺氧缺血組和對照組注射等量生理鹽水。HE染色觀察大鼠病變側(cè)腦組織病理變化；RT-PCR及Western-blot法檢測各組CRT的表達(dá)變化；熒光顯微鏡法檢測腦細(xì)胞中游離Ca2+濃度；流式細(xì)胞術(shù)檢測神經(jīng)元凋亡率。結(jié)果 缺氧缺血組和參附干預(yù)組各時間點CRT mRNA及蛋白表達(dá)量均較對照組升高(P<0.05)，且參附干預(yù)組較缺氧缺血組升高(P<0.05)；缺氧缺血組各時間點細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度均較對照組明顯升高(P<0.05)，參附干預(yù)組細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度較缺氧缺血組降低(P<0.05)，但仍高于對照組(P<0.05)；參附干預(yù)組各時間點的神經(jīng)元凋亡率均明顯低于缺氧缺血組(P<0.05)，但較對照組仍升高(P<0.05)。結(jié)論 參附注射液可能通過上調(diào)CRT的表達(dá)，降低細(xì)胞內(nèi)鈣超載來減輕新生大鼠缺氧缺血性腦損傷。

參附注射液；缺氧缺血性腦損傷；鈣網(wǎng)蛋白；凋亡

新生兒缺氧缺血性腦損傷(hypoxic-ischemic brain damage，HIBD)是由于各種圍生期窒息引起的部分或者完全缺氧，腦血流減少或者暫停而導(dǎo)致胎兒或新生兒腦損傷性疾病，是引起新生兒急性死亡和慢性神經(jīng)系統(tǒng)損傷的主要原因之一[1]。本病發(fā)病機制比較復(fù)雜，細(xì)胞內(nèi)鈣超載是目前比較認(rèn)同的引起HIBD的機制之一，而鈣網(wǎng)蛋白(calreticulin，CRT)作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的一種多功能分子伴侶，在維持細(xì)胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用。目前研究認(rèn)為：壞死和凋亡是HIBD時神經(jīng)元死亡的兩種主要形式，腦缺氧缺血導(dǎo)致的遲發(fā)性神經(jīng)元死亡主要與細(xì)胞凋亡有關(guān)[2]。

參附注射液的主要成分是人參皂甙和烏頭類生物堿，其對心血管系統(tǒng)、缺血再灌注損傷、免疫系統(tǒng)以及抗腫瘤治療等具有良好的保護(hù)作用[3]。近年來國內(nèi)相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)參附注射液對顱腦損傷也有很好的保護(hù)作用[4]。作者所在課題組在前期研究中已從線粒體凋亡、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等方面證實其在HIBD中具有良好的腦保護(hù)作用[5-6]。該研究在前期研究的基礎(chǔ)上進(jìn)一步探討參附注射液對新生大鼠HIBD后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)蛋白CRT表達(dá)、細(xì)胞內(nèi)游離鈣濃度以及神經(jīng)元凋亡的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：7日齡新生SD大鼠150只，體質(zhì)量12～16 g，雌雄不拘，由徐州醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。將大鼠隨機分為對照組、缺氧缺血組和參附干預(yù)組，各組進(jìn)一步分為缺氧缺血后3、6、12、24、72 h 5個亞組，每組均10只，其中8只用于基因、蛋白、鈣離子濃度及凋亡率的檢測，另外2只用于蘇木精-伊紅(HE)染色。

1.1.2 主要試劑：Trizol Reagent試劑為Invitrogen公司產(chǎn)品，RT-PCR試劑盒購于北京天根生化科技有限公司，引物及內(nèi)參均由上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司提供；兔抗鼠CRT多克隆抗體購于美國CST公司，羊抗兔二抗以及β-actin 一抗、二抗均購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，F(xiàn)ura-2/AM由Sigma公司生產(chǎn)，參附注射液由雅安三九藥業(yè)有限公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 模型制備：參照Rice等[7]法制作HIBD模型。對照組僅切開頸部皮膚，游離右側(cè)頸總動脈后縫合切口，未進(jìn)行缺血缺氧處理。參附干預(yù)組于造模成功后立即腹腔注射參附注射液10 mL/(kg·d)，連用3 d。缺血缺氧組和對照組注射等量生理鹽水。

1.2.2 HE染色：大鼠腦缺血缺氧后72 h分離右側(cè)大腦半球標(biāo)本，常規(guī)固定、脫水、石蠟包埋，統(tǒng)一取相當(dāng)于耳間前線2 mm水平(即相當(dāng)于大腦中后1/3部位)行冠狀位腦組織切片，采用HE染色，光鏡下觀察大鼠皮層腦組織病理變化。

1.2.3 RT-PCR檢測CRT mRNA：取新鮮大腦皮質(zhì)標(biāo)本，用Trizol試劑提取總RNA，計算相當(dāng)量總RNA體積后，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒，按照說明書操作步驟進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。CRT以β-actin作為參照物。CRT引物序列：上游5′-CAAGGATATCCGGTGTAAGGA-3′；下游5′-CATAGATATTCGCATCGGGG-3′，產(chǎn)物長度445 bp；β-actin引物序列：上游5′-CGTAAAGACCTCTATGCCAACA-3′；下游5′-CGGACTCATCGTACTCCTGCT-3′，產(chǎn)物長度229 bp。PCR體系：cDNA 3 μL，2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL,上下游引物各1 μL，ddH2O 7.5 μL，總反應(yīng)體系為25 μL；PCR擴增條件為：94℃預(yù)變性3 min，94℃變性30 s，退火30 s，72℃延伸1 min，30個循環(huán)，最后經(jīng)過72℃延長7 min終止反應(yīng)。CRT退火溫度為55℃，β-actin退火溫度為57℃。取5 μL PCR產(chǎn)物在1.5%(質(zhì)量濃度)瓊脂糖凝膠電泳后，用凝膠成像分析系統(tǒng)掃描、拍照，分析數(shù)據(jù)。

1.2.4 Western blot方法檢測CRT蛋白含量：取新鮮右側(cè)大腦皮質(zhì)組織，用RIPA裂解液裂解蛋白，BCA法蛋白定量。上樣后SDS-PAGE凝膠電泳，半干法轉(zhuǎn)NC膜。一抗(1∶100)4℃孵育過夜后孵育二抗。DAB法顯色后拍照，用Image J圖像分析系統(tǒng)測條帶灰度值，并做統(tǒng)計學(xué)分析處理。

1.2.5 腦細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度測定：將大腦皮質(zhì)標(biāo)本制備成Hank′s懸浮液后用毛細(xì)吸管吸取一滴于潔凈載玻片上，蓋上蓋玻片靜置2 min，置熒光顯微鏡下觀察腦細(xì)胞，采用熒光圖像分析系統(tǒng)檢測單個腦細(xì)胞熒光強度(F)，激發(fā)波長340 nm和380 nm，發(fā)射波長505 nm，F(xiàn)340nm/F380nm比值測定胞質(zhì)游離鈣濃度。

1.2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組大腦皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡率：將新鮮大腦皮質(zhì)組織在磷酸鹽緩沖液(PBS)中輕柔剪碎，放離心管中用PBS稀釋為4 mL，反復(fù)吹打20次，沉淀5 min，取上清，經(jīng)200目尼龍網(wǎng)過濾2次，制成單細(xì)胞懸液，以70%(體積分?jǐn)?shù))乙醇4℃固定12 h，上機前再用PBS稀釋，再次離心去上清，加入PI染液，4℃避光放置30 min，24 h內(nèi)應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析(one-way analysis of variance, ANOVA)，兩兩比較采用LSD法。以P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腦組織病理改變 光學(xué)顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)：對照組腦組織結(jié)構(gòu)及細(xì)胞層次清晰，神經(jīng)細(xì)胞排列整齊緊密，形態(tài)正常。缺氧缺血組病變區(qū)腦組織細(xì)胞間隙增大，細(xì)胞稀疏，水腫明顯，表現(xiàn)為細(xì)胞體積增大，胞質(zhì)疏松、淡染，部分細(xì)胞嚴(yán)重水腫，胞質(zhì)透明如氣球，呈氣球樣變；并伴有細(xì)胞壞死，表現(xiàn)為核固縮、核碎裂等。參附干預(yù)組細(xì)胞排列尚規(guī)則，體積稍大，呈輕度水腫改變。結(jié)果見圖1。

2.2 各組大鼠CRT表達(dá)變化 結(jié)果見表1、2，圖2、3。對照組各時間點CRT mRNA及蛋白表達(dá)均相對較弱，且組內(nèi)各時間點間比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(F=0.462，P>0.05；F=0.181，P>0.05)。缺氧缺血組及參附干預(yù)組各時間點CRT的表達(dá)量均較對照組升高(P<0.05)，CRT mRNA表達(dá)高峰在造模后12 h，CRT蛋白表達(dá)高峰在造模后24 h；且與缺氧缺血組比較，參附干預(yù)組CRT 表達(dá)升高(P<0.05)。

A：對照組；B：缺氧缺血組；C：參附干預(yù)組

圖1 各組大鼠右側(cè)大腦皮質(zhì)區(qū)病理改變(HE)

表 1 各組缺氧缺血后不同時間點CRT mRNA的相對表達(dá)量

注：CRT：鈣網(wǎng)蛋白；與對照組比較，*P<0.05；與缺氧缺血組比較，#P<0.05；與同組其他時間點比較，△P<0.05。表2～4、圖2～3同

表 2 各組缺氧缺血后不同時間點CRT蛋白的相對表達(dá)量±s)

圖2 RT-PCR檢測各組大鼠腦缺氧缺血后不同時間點腦組織CRT mRNA的表達(dá)(n=8)

圖3 Western blot方法檢測各組大鼠腦缺氧缺血后不同時間點腦組織CRT蛋白的表達(dá)(n=8)

表 3 各組大鼠腦缺血缺氧后不同時間點右側(cè)大腦皮質(zhì)胞質(zhì)內(nèi)游離Ca2+濃度的變化±s)

表 4 各組大鼠腦缺血缺氧后不同時間點右側(cè)皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡率±s)

2.3 各組大鼠腦皮質(zhì)細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度變化 缺氧缺血組各時間點細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度較對照組明顯升高(P<0.05)，并隨時間推移，游離Ca2+水平升高逐漸明顯；予參附注射液干預(yù)后，細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度較缺氧缺血組明顯下降(P<0.05)，但仍高于對照組(P<0.05)。見表3。

2.4 各組大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡率 對照組各時間點腦皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡率極低，而缺氧缺血組和參附干預(yù)組各時間點神經(jīng)元凋亡率均較對照組明顯升高(P<0.05)，且參附干預(yù)組各時間點的神經(jīng)元凋亡率與缺氧缺血組比較則明顯降低(P<0.05)。見表4。

3 討論

缺氧缺血導(dǎo)致的腦損傷一般分為原發(fā)性損傷(窒息后4～6 h)和更為劇烈持久的繼發(fā)性損傷(窒息后6～72 h)兩個階段。因此該研究選擇缺氧缺血后3 h、6 h、12 h、24 h以及72 h作為觀察點。無論原發(fā)損傷還是繼發(fā)損傷都會因能量衰竭造成Na+/K+-ATP失活，最終均導(dǎo)致大量鈣離子內(nèi)流，造成鈣離子超載，從而介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)一系列依賴鈣離子的生化反應(yīng)，誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡。CRT是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中主要的Ca2+結(jié)合蛋白，通過調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng) Ca2+貯存而影響細(xì)胞胞質(zhì)游離Ca2+水平，并作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶參與蛋白質(zhì)折疊，具有調(diào)節(jié)Ca2+穩(wěn)態(tài)、蛋白質(zhì)折疊、細(xì)胞凋亡等多種生物學(xué)功能，在缺血再灌注損傷、缺氧缺血損傷中引起高度關(guān)注。CRT能與Ca2+-ATP酶(sarco endoplasmic reticulurn calcium ATPase，SERCA)糖基化的C-端末尾直接作用，當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中Ca2+耗竭時，兩者解離，ATP酶活化，回收胞質(zhì)內(nèi)Ca2+；當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中Ca2+充足時，兩者結(jié)合，抑制ATP酶活性，胞質(zhì)內(nèi)Ca2+向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)運停止，提示CRT可能通過SERCA來調(diào)節(jié)Ca2+穩(wěn)態(tài)。目前文獻(xiàn)中關(guān)于CRT在缺血(氧)、氧化應(yīng)激等致細(xì)胞凋亡中的作用尚有爭議。有報道認(rèn)為CRT參與了應(yīng)激細(xì)胞的保護(hù)：Liu等[8]研究發(fā)現(xiàn)，在創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙大鼠海馬中，胞質(zhì)內(nèi)游離Ca2+濃度升高，Ca2+平衡失調(diào)，CRT表達(dá)升高，參與Ca2+超載與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的調(diào)節(jié)，減輕了細(xì)胞損傷。在微波輻射誘導(dǎo)的大鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型中，外源性CRT可以通過減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)發(fā)揮保護(hù)作用[9]。與上述研究相反，有報道認(rèn)為CRT過表達(dá)增加細(xì)胞對凋亡刺激的敏感性：Prathyuman等[10]報道人類乳腺癌MCF-7細(xì)胞中過表達(dá)CRT可誘發(fā)凋亡的發(fā)生。Shi等[11]通過對先兆子癇患者胎盤的研究發(fā)現(xiàn)，CRT能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖與侵犯。本研究發(fā)現(xiàn)，新生大鼠腦皮質(zhì)中CRT的表達(dá)在缺氧缺血后3 h即已明顯增加，其基因表達(dá)在缺氧缺血后 12 h達(dá)高峰，蛋白在24 h達(dá)到高峰，隨后逐漸下降，72 h仍明顯高于對照組。推測CRT相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在缺氧缺血性腦損傷新生大鼠大腦皮質(zhì)中被激活。

參附注射液的主要成分為人參皂甙和烏頭類生物堿。近年來研究發(fā)現(xiàn)參附注射液具有多種藥理作用和神經(jīng)保護(hù)作用，包括清除氧自由基，抑制脂質(zhì)過氧化物的產(chǎn)生；抑制過量鈣離子內(nèi)流，減輕鈣超載；降低炎性反應(yīng)因子，減輕炎性反應(yīng)；上調(diào)Bcl-2表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡等[3]。在腦保護(hù)中起主要作用的是人參皂甙。陳大慶等[12]研究發(fā)現(xiàn)，人參皂甙能降低顱腦損傷大鼠神經(jīng)細(xì)胞的凋亡率；莊嚴(yán)等[13]研究表明，人參皂甙對大鼠腦損傷的保護(hù)作用可能與抑制細(xì)胞內(nèi)的Ca2+超載、降低神經(jīng)細(xì)胞凋亡有關(guān)。目前烏頭類生物堿在心肌損傷、抗腫瘤等方面具有良好的作用[14-15]，而其在腦保護(hù)方面的報道則較少。

李鋒等[16]研究表明參附注射液在低(5 mL/kg)、中(10 mL/kg)、高(20 mL/kg)不同劑量經(jīng)腹腔注射對SD大鼠顱腦損傷均有保護(hù)作用，且無劑量效應(yīng)關(guān)系。本研究選擇中等劑量的參附注射液(10 mL/kg)，結(jié)果顯示：與缺氧缺血組相比較，參附干預(yù)組腦組織病理損傷明顯減輕，而且皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)元的凋亡率顯著下降，此外，參附干預(yù)組各時間點CRT表達(dá)量均高于缺氧缺血組，胞質(zhì)游離鈣濃度明顯低于缺氧缺血組，提示參附注射液可能通過上調(diào)CRT的表達(dá)，降低鈣超載來減少神經(jīng)元凋亡，從而起到腦保護(hù)作用。這與陳大慶等[12]、莊嚴(yán)等[13]的研究結(jié)果基本一致。

綜上所述，本實驗結(jié)果顯示缺氧缺血后新生大鼠腦皮質(zhì)胞質(zhì)內(nèi)游離鈣濃度上升，CRT表達(dá)增加，表明缺氧缺血造成了細(xì)胞內(nèi)鈣超載，并且激活了鈣離子相關(guān)蛋白CRT。用參附注射液干預(yù)后CRT表達(dá)升高更加明顯，同時胞質(zhì)內(nèi)游離鈣濃度明顯下降，而大腦皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡率下降，腦組織病理損傷減輕，推測參附注射液可能通過上調(diào)CRT的表達(dá)、降低鈣離子超載來發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。當(dāng)然，參附注射液是否還存在其他神經(jīng)保護(hù)機制以及CRT是否通過SERCA來減輕鈣超載尚需進(jìn)一步研究。

[1]王衛(wèi)平.兒科學(xué)[M].第8版.北京:人民衛(wèi)生出版社,2013.107-108.

[2]Cao G, Xing J, Xiao X, et al. Critical role of calpain I in mitochondrial release of apoptosis-inducing factor in ischemic neuronal injury[J]. J Neurosci, 2007, 27(35): 9278-9293.

[3]徐軍,樓洪剛,樓宜嘉,等.參附注射液藥理作用的研究進(jìn)展[J].上海中醫(yī)藥雜志,2008,42(10):87-88.

[4]史偉,張良登,宋玉明,等.參附注射液在腦血管疾病方面的臨床應(yīng)用與實驗研究進(jìn)展[J].中國中醫(yī)藥信息雜志,2009,16(1):109-111.

[5]王偉，王軍，徐艷，等．缺血缺氧性新生大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元胞漿Smac/Diablo、caspase-9的表達(dá)及參附注射液的干預(yù)作用[J]．中華神經(jīng)醫(yī)學(xué)雜志，2011，10(3)：228-231．

[6]潘紅，王軍，曹修麗，等.參附注射液對缺氧缺血性腦損傷新生大鼠eIF2а(p)、ATF4的影響[J].中國婦幼保健，2011,26(34)：5429-5432.

[7]Rice JE, Vannucci RC, Brierley JB. The influence of immaturity on hypoxic-ischemic brain damage in the rat [J]. Ann Neurol, 1981, 9: 131-141.

[8]Liu H, Han F, Shi Y. Effect of calreticulin on Ca2+/CaM kinaseⅡalpha and endoplasmic reticulum stress in hippocampal in a rat model of post-traumatic stress disorder [J]. Neurochem Res, 2013, 38(7):1407-1414.

[9]Li WH, Li YZ, Song DD, et al. Calreticulin protects rat microvascular endothelial cells against microwave radiation-induced injury by attenuating endoplasmic reticulum stress [J]. Microcirculation, 2014, 21(6)： 506-515.

[10]Prathyuman S, Sellappa S, Joseph S, et al. Enhanced calreticulin expression triggers apoptosis in the MCF-7 cell line [J]. Asian Pac J Cancer Prev, 2010, 11(4):1133-1136.

[11]Shi Z, Hou W, Hua X, et al. Overexpression of calreticulin in pre- eclamptic placentas: effect on apoptosis, cell invasion and severity of pre-eclampsia [J]. Cell Biochem Biophys, 2012, 63(2): 183-189.

[12]陳大慶，朱烈烈，李永領(lǐng)，等．人參皂甙Rg1對顱腦損傷模型大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響[J]．實用醫(yī)學(xué)雜志，2010,26(1)：30-31．

[13]莊嚴(yán)，時京，呂燕華，等.人參皂甙Rb1對香煙煙霧誘導(dǎo)的大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的影響[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2013,13(31)：6019-6022.

[14]殷勝利，劉子由，張希，等.烏頭類生物堿在體外循環(huán)心內(nèi)直視手術(shù)中心肌保護(hù)作用及其機制[J].中華實驗外科雜志，2005,22(10)：1259-1261.

[15]饒朝龍，彭成.烏頭類生物堿對ras基因表達(dá)影響及其抗腫瘤分子機制研究[J].現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，2010,37(6)：1098-1100.

[16]李峰,鐘宏,陳喜志,等.參附注射液對顱腦損傷的腦保護(hù)作用[J].中醫(yī)藥臨床雜志,2006,18(5):455-456.

(本文編輯：時秋寬)

Neuroprotective effects of Shenfu injection on hypoxic-ischemic brain damage in neonatal rats

LIUWenqiang,WANGJun*,XUYan,HANAimin,YANGQianqian.

*DepartmentofNeonatology,theAffiliatedHospitalofXuzhouMedicalCollege,Xuzhou221002,China

WANG Jun, Email: snakewzh@sina.com

Objective To investigate the expression of calreticulin(CRT), the change of intracellular free calcium and neuronal apoptosis in cerebral cortex of neonatal rats with hypoxic-ischemic brain damage (HIBD), and the intervention effects of Shenfu injection. Methods Sprague-Dawley (SD) rats aged 7 days were randomly assigned to three groups: control group, hypoxic-ischemic group and Shenfu-treated group. Rat models of HIBD were established according to Rice’s method. Based on the observing time points, each group (n=50) was subdivided into 5 subgroups sacrificed at 3, 6, 12, 24 and 72 hrs. Rats in the control group were not performed ligation of the right common carotid artery and not underwent hypoxia but only performed the separation of right common carotid artery. Shenfu injection was administered by intraperitoneal injection right after H/I insult and then once daily at a dosage of 10 mL/kg for 3 days in the rats of Shenfu-treated group. Saline was also administered into the rats of hypoxic-ischemic group and control group by the same methods and the same dosage. The pathological changes of right cerebral cortex were observed under light microscope. The expression of CRT in the cerebral cortex was detected by RT-PCR and western blot. The cells of right cerebral cortex were isolated and incubated with Fura-2/AM and observed under fluorescent microscope. The free calcium concentrations were determined as the ratio of F340/F380via image analysis system. The apoptosis rate was measured by flow cytometry. Results Compared with the control group, the expressions of CRT in hypoxic-ischemic group and Shenfu-treated group were obviously up regulated (P<0.05), and the expressions of CRT in Shenfu-treated group were notably higher than those in hypoxic-ischemic group (P<0.05). The concentrations of intracellular free calcium in Shenfu-treated group were significantly decreased compared with hypoxic-ischemic group (P<0.05), but was also higher than those in control group (P<0.05). The apoptosis of neuron in cerebral cortex in Shenfu-treated group was significantly less than that in hypoxic-ischemic group (P<0.05), but was also more than that in control group (P<0.05). Conclusions Shenfu injection may be neuroprotective against HIBD by up-regulation of CRT expression and relief of calcium overload.

Shenfu injection; hypoxic-ischemic brain damage; calreticulin; apoptosis

10.3969/j.issn.1006-2963.2015.03.011

徐州市科技發(fā)展基金計劃項目(XF10C066)

221002 徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院新生兒科

王軍，Email:snakewzh@sina.com

R743.3

A

1006-2963 (2015)03-0200-06

2014-07-31)