細(xì)胞紅蛋白在低氧預(yù)適應(yīng)小鼠大腦組織中的表達(dá)及其臨床意義

黃麗華，邵 國，賈平平，張 冬

·論著·

細(xì)胞紅蛋白在低氧預(yù)適應(yīng)小鼠大腦組織中的表達(dá)及其臨床意義

黃麗華，邵 國，賈平平，張 冬

目的 探討細(xì)胞紅蛋白(CYGB)在低氧預(yù)適應(yīng)小鼠大腦組織中的表達(dá)及其臨床意義。方法 2014年11月8—12日，選取昆明種雄性成年小鼠60只，隨機(jī)分為空白對照組、實驗對照組和低氧預(yù)適應(yīng)組，每組20只?？瞻讓φ战M小鼠常氧條件下正常飼養(yǎng)，實驗對照組小鼠進(jìn)行1次低氧預(yù)適應(yīng)模型制備過程，低氧預(yù)適應(yīng)組小鼠完成4次低氧預(yù)適應(yīng)模型制備過程。采用免疫蛋白印跡試驗檢測各組小鼠CYGB蛋白表達(dá)情況，實時定量PCR檢測各組小鼠CYGB mRNA表達(dá)情況。結(jié)果 低氧預(yù)適應(yīng)組小鼠CYGB蛋白相對表達(dá)量高于空白對照組和實驗對照組，實驗對照組小鼠CYGB蛋白相對表達(dá)量高于空白對照組(P<0.01)。低氧預(yù)適應(yīng)組、實驗對照組小鼠CYGB mRNA表達(dá)量高于空白對照組(P<0.01)，而實驗對照組與低氧預(yù)適應(yīng)組小鼠CYGB mRNA相對表達(dá)量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論 低氧預(yù)適應(yīng)是一種內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制，CYGB可能參與低氧預(yù)適應(yīng)過程。

低氧預(yù)適應(yīng)；海馬；細(xì)胞紅蛋白；小鼠

近年研究發(fā)現(xiàn)，低氧預(yù)適應(yīng)是機(jī)體耐受低氧或缺血損傷的內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制，其定義為：預(yù)先給予機(jī)體一個亞致死性低氧/缺血刺激可增強(qiáng)機(jī)體對隨后發(fā)生的致死性低氧/缺血的耐受性，低氧預(yù)適應(yīng)已被證實為細(xì)胞內(nèi)源性防護(hù)機(jī)制的啟動因子[1]。低氧預(yù)適應(yīng)的作用機(jī)制一直是國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)，Shao等[2]研究認(rèn)為，急性重復(fù)低氧預(yù)適應(yīng)的細(xì)胞組織分子作用機(jī)制可能是抑制腦組織損傷基因上調(diào)，促進(jìn)腦組織損傷基因下調(diào)。細(xì)胞紅蛋白(CYGB)是近年研究發(fā)現(xiàn)的第4種攜氧球蛋白[3]，廣泛分布于腦神經(jīng)元胞質(zhì)和胞核[4-5]，在機(jī)體缺氧應(yīng)激過程中具有重要的組織細(xì)胞保護(hù)作用[6-7]。腦組織中海馬區(qū)對低氧/缺血較敏感，本研究通過制備急性重復(fù)低氧預(yù)適應(yīng)小鼠模型，探討CYGB在低氧預(yù)適應(yīng)小鼠大腦組織中的表達(dá)及其臨床意義。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與試劑 昆明種雄性成年小鼠60只，體質(zhì)量18～22 g，周齡6～8周，由內(nèi)蒙古大學(xué)動物實驗中心提供。主要試劑：Tris堿購自SIGMA公司，丙烯酰胺購自SIGMA公司，DEMD購自SIGMA公司；BCA蛋白試劑盒購自PIERCE公司，ECL試劑盒購自PIERCE公司；β-actin兔多克隆抗體購自Santa Cruze公司，Cytoglobin兔多克隆抗體購自Santa Cruze公司，辣根酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，Kodak X-Omat BT Film購自Kodak公司；TRIzol(GIBCO BRL)、溴化乙啶(EB)、三氯甲烷購自重慶化學(xué)試劑廠，異丙醇和乙醇購自博奧公司。

1.2 動物模型制備 2014年11月8—12日，將所有小鼠隨機(jī)分為空白對照組、實驗對照組和低氧預(yù)適應(yīng)組，每組20只，空白對照組小鼠常氧條件下正常飼養(yǎng)；實驗對照組和低氧預(yù)適應(yīng)組小鼠參照呂國蔚教授[8-9]模型制備方法制備急性重復(fù)低氧預(yù)適應(yīng)模型：先將小鼠置于經(jīng)過標(biāo)定的125 ml廣口瓶內(nèi)，使用橡皮塞密閉瓶口，并進(jìn)行觀察，當(dāng)小鼠出現(xiàn)大口喘式呼吸、翻轉(zhuǎn)反射消失、大小便失禁、煩躁不安和不停跳躍等低氧表現(xiàn)時立即拔除橡皮塞，將小鼠取出，小鼠第1次低氧完成(實驗對照組)；第1次低氧完成后，立即將小鼠轉(zhuǎn)移至另一相同容積且含有新鮮空氣的廣口瓶內(nèi)，迅速使用橡皮塞密閉并再次進(jìn)行觀察，小鼠出現(xiàn)上述低氧癥狀時取出，上述步驟重復(fù)4次(低氧預(yù)適應(yīng)組)。模型制備完成后對所有小鼠進(jìn)行斷頭處死，迅速小心剝離海馬組織，置于-80 ℃冰箱保存。

1.3 免疫蛋白印跡試驗 取各組小鼠海馬組織勻漿液，采用BCA 法進(jìn)行總蛋白定量并配置樣品緩沖液，每組小鼠取緩沖液60 μg上樣，配置成10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠，電泳約2 h；電泳完成后將膠上的總蛋白通過轉(zhuǎn)膜器轉(zhuǎn)到硝酸纖維膜上，5%脫脂奶粉封固1 h后采用Cytoglobin兔多克隆抗體稀釋液進(jìn)行稀釋，稀釋比例為1∶8 000，孵育4 h，4 ℃冰箱過夜；采用TTBS洗膜3次，辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗，1∶5 000稀釋，孵育硝酸纖維膜，TTBS洗膜3次，將ECL化學(xué)發(fā)光試劑按比例加在硝酸纖維膜上，暗房X線膠片上曝光、顯影、定影。以β-actin為內(nèi)參照，采用凝膠成像分析系統(tǒng)掃描膠片，以目的蛋白條帶面積/β-actin面積為CYGB蛋白相對表達(dá)量。

1.4 實時定量PCR 采用Triziol提取各組小鼠海馬組織總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將總mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，總量為20 μl，置于-20 ℃冰箱保存；在含ABI的96孔板中依次在每孔中加入cDNA 1 μl，上、下游引物各12.5 μl，無菌水等；之后將96孔板置于7900實時定量PCR反應(yīng)儀上，每個樣本設(shè)6個復(fù)孔；實時定量PCR反應(yīng)條件：95 ℃變性2 min，94 ℃，30 s；56 ℃，35 s，72 ℃，30 s，共40個循環(huán)；72 ℃延伸7 min后停止反應(yīng)。實時定量PCR反應(yīng)引物序列：CYGB上游引物：3′-CCATCCTGGTGAGGTTCTTT-5′，下游引物3′-CTTCCTTGTAGGCTGCGGT-5′；β-actin 上游引物：3′-GAACGGTGAAGGCGACAG-5′，下游引物：3′-TTGGGAGGGTGAGGGACT-5′。以β-actin 為內(nèi)參，CYGB mRNA相對表達(dá)量以2-△△CT表示，△CT=CT目的基因-內(nèi)參基因。

2 結(jié)果

2.1 CYGB蛋白表達(dá)情況 空白對照組小鼠CYGB蛋白相對表達(dá)量為(0.358±0.047)，實驗對照組為(0.469±0.083)，低氧預(yù)適應(yīng)組為(0.732±0.065)，3組小鼠CYGB蛋白相對表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=166.150，P=0.000)；低氧預(yù)適應(yīng)組小鼠CYGB蛋白相對表達(dá)量高于空白對照組和實驗對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(q值分別為25.098、17.649，P<0.01)，實驗對照組小鼠CYGB蛋白相對表達(dá)量高于空白對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(q=7.449，P<0.01，見圖1～2)。

圖1 3組小鼠CYGB電泳圖

注：與空白對照組比較，aP<0.01；與實驗對照組比較，bP<0.01

圖2 3組小鼠CYGB蛋白相對表達(dá)量比較

Figure 2 Comparison of CYGB protein expression among the three groups

2.2 CYGB mRNA表達(dá)情況 空白對照組小鼠CYGB mRNA相對表達(dá)量為(23.00±4.90)，實驗對照組為(33.85±6.40)，低氧預(yù)適應(yīng)組為(38.60±10.24)，各組小鼠CYGB mRNA相對表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=22.590，P=0.000)。低氧預(yù)適應(yīng)組、實驗對照組小鼠CYGB mRNA表達(dá)量高于空白對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(q值分別為9.273、6.449，P<0.01)，而實驗對照組與低氧預(yù)適應(yīng)組小鼠CYGB mRNA相對表達(dá)量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(q=2.823，P>0.05，見圖3)。

注：與空白對照組比較，aP<0.05

圖3 3組小鼠CYGB mRNA相對表達(dá)量比較

Figure 3 Comparison of CYGB mRNA expression among the three groups

3 討論

氧是細(xì)胞、組織代謝和維持生命的重要物質(zhì)，在與氧相關(guān)儲存和轉(zhuǎn)運(yùn)生理過程中，攜氧球蛋白——血紅蛋白和肌紅蛋白發(fā)揮著重要作用。2002年，Burmester在人類和小鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了第4種攜氧球蛋白——CYGB，其廣泛分布于人體各組織和器官，具有攜氧和運(yùn)輸氧功能[3，10]。大量研究表明，組織和細(xì)胞缺氧時CYGB表達(dá)明顯上調(diào)，這可能是組織細(xì)胞自我保護(hù)的機(jī)制之一[11-13]。

腦低氧預(yù)適應(yīng)是腦組織對低氧/缺血的一種內(nèi)源性防護(hù)機(jī)制，自從腦低氧預(yù)適應(yīng)被發(fā)現(xiàn)以來，大量研究對其作用機(jī)制進(jìn)行了探討和分析，提出了包括氧化應(yīng)激、一氧化氮作用、低溫等在內(nèi)的多種假說，但其確切作用機(jī)制目前尚不清楚。鑒于CYGB在組織缺氧中的重要作用，探討CYGB在低氧預(yù)適應(yīng)小鼠大腦組織中的表達(dá)對闡明低氧預(yù)適應(yīng)作用機(jī)制具有重要意義。

馬海然等[14]在體外培養(yǎng)的神經(jīng)元中發(fā)現(xiàn)，CYGB mRNA及蛋白表達(dá)量隨低氧時間延長而增高，推測CYGB可能參與低氧預(yù)適應(yīng)及腦保護(hù)作用；本研究結(jié)果顯示，低氧預(yù)適應(yīng)組小鼠CYGB蛋白相對表達(dá)量高于空白對照組和實驗對照組，實驗對照組小鼠CYGB蛋白相對表達(dá)量高于空白對照組，低氧預(yù)適應(yīng)組、實驗對照組小鼠CYGB mRNA表達(dá)量高于空白對照組，與上述文獻(xiàn)報道結(jié)果基本一致。本課題組前期研究結(jié)果顯示，急性重復(fù)低氧可上調(diào)低氧誘導(dǎo)因子1(HIF-1)的表達(dá)[15-16]；Wystub等[17]研究發(fā)現(xiàn)，CYGB啟動子的上游基因序列包含能與HIF-1特異位點(diǎn)結(jié)合的低氧應(yīng)答元件(HREs)，并在3′端非翻譯區(qū)發(fā)現(xiàn)了保守的可經(jīng)缺氧誘導(dǎo)的mRNA信號位點(diǎn)，因此推測低氧預(yù)適應(yīng)過程中HIF-1促進(jìn)了CYGB的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而導(dǎo)致CYGB表達(dá)上調(diào)。CYGB參與低氧預(yù)適應(yīng)及腦保護(hù)作用的可能機(jī)制主要有以下幾個方面：(1)CYGB能夠通過與NO緊密結(jié)合而清除低氧/缺血導(dǎo)致的機(jī)體分泌的過量NO[18]，從而避免過量的NO對神經(jīng)元造成損傷；(2)CYGB具有過氧化物酶和超氧化物歧化酶作用[19]，可利用亞鐵原卟啉和硫醇?xì)埢宄钚匝?，能在氧化?yīng)激時保護(hù)細(xì)胞免受損傷；(3)CYGB具有過氧化氫酶作用，能促進(jìn)糖酵解和ATP生成，在低氧/缺血時為細(xì)胞提供能量[20]；(4)低氧環(huán)境下，有氫離子和還原性物質(zhì)存在時，CYGB易發(fā)生變構(gòu)而利于釋放氧，從而更好地發(fā)揮運(yùn)輸氧和儲氧功能。

綜上所述，低氧預(yù)適應(yīng)是一種內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制，CYGB可能參與低氧預(yù)適應(yīng)過程，但其具體作用機(jī)制目前尚不清楚，如能分離、純化或在體外合成低氧預(yù)適應(yīng)過程中產(chǎn)生的具有腦保護(hù)物質(zhì)，這將為臨床防治腦卒中或其他低氧缺血疾病提供新選擇，本研究擬在今后的研究中通過敲除小鼠CYGB基因而進(jìn)一步驗證CYGB在低氧預(yù)適應(yīng)中的作用。

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(本文編輯：鹿飛飛)

Expression and Clinical Significance of Cytoglobin in Brain Tissue of Hypoxia Preconditioning Mice

HUANGLi-hua，SHAOGuo，JIAPing-ping，etal.

PublicHealthSchoolofBaotouMedicalCollege，Baotou014010，China

Objective To explore the expression and clinical significance of cytoglobin in brain tissue of hypoxia preconditioning mice.Methods From November 8 to 12 in 2014，a total of 60 Kunming species male adult mice were randomly divided into A group，B group and C group，each of 20 mice.Mice of A group were normally feed in normal oxygen content，mice of B group were prepared for hypoxia preconditioning model for one time，while mice of C group were prepared for hypoxia preconditioning model for four times.Immune protein imprinting test was used to detect the cytoglobin protein expression，real-time quantitative PCR was used to detect the cytoglobin mRNA expression.Results The relative cytoglobin protein expression of C group was statistically significantly higher than that of B group and A group，respectively，and relative cytoglobin protein expression B group was statistically significantly higher than that of A group(P<0.01).The relative cytoglobin mRNA expression of C group and B group was statistically significantly higher than that of A group，respectively(P<0.01)，while no statistically significant differences of relative cytoglobin mRNA expression was found between B group and C group(P>0.05).Conclusion Hypoxia preconditioning is a kind of endogenesis protect mechanisms，and cytoglobin maybe play an important role in the process.

Hypoxia preconditioning；Hippocampus；Cytoglobin；Mice

國家自然科學(xué)基金(81160244)；內(nèi)蒙古自治區(qū)高等學(xué)校科學(xué)研究項目(NJZY12225)

014010內(nèi)蒙古包頭市，包頭醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院(黃麗華，張冬)，生物醫(yī)學(xué)中心(邵國)，藥學(xué)院(賈平平)

黃麗華，邵國，賈平平，等.細(xì)胞紅蛋白在低氧預(yù)適應(yīng)小鼠大腦組織中的表達(dá)及其臨床意義[J].實用心腦肺血管病雜志，2015，23(7)：43-46.[www.syxnf.net]

R 854.22 R 332

A

10.3969/j.issn.1008-5971.2015.07.012

2015-04-15；

2015-07-10)

Huang LH，Shao G，Jia PP，et al.Expression and clinical significance of cytoglobin in brain tissue of hypoxia preconditioning mice[J].Practical Journal of Cardiac Cerebral Pneumal and Vascular Disease，2015，23(7)：43-46.