外用絲裂霉素C抑制兔耳增生性瘢痕形成的實驗研究

鄒 杰，潘 寧

(1.四川省內(nèi)江市第一人民醫(yī)院燒傷整形科，四川 內(nèi)江 641000；2.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院皮膚外科，四川 成都 610031)

外用絲裂霉素C抑制兔耳增生性瘢痕形成的實驗研究

鄒 杰1，潘 寧2

(1.四川省內(nèi)江市第一人民醫(yī)院燒傷整形科，四川 內(nèi)江 641000；2.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院皮膚外科，四川 成都 610031)

目的 探討不同濃度絲裂霉素C外用對兔耳增生性瘢痕的抑制效果。方法 18只日本大耳白兔，耳腹側(cè)制作兔耳增生性瘢痕模型，創(chuàng)口按隨機數(shù)字表法分生理鹽水組(A組)、0.1 mg/ml絲裂霉素C組(B組)、0.05 mg/ml絲裂霉素C組(C組)、1 mg/ml曲安奈德組(D組)，用相應(yīng)溶液外用兔耳新鮮創(chuàng)面，局部保留，彩色多普勒觀察創(chuàng)面愈合后增生性瘢痕厚度，并切除瘢痕組織，病理切片HE染色，顯微鏡(×200倍)下計數(shù)單個視野下的成纖維細(xì)胞數(shù)。結(jié)果 A組瘢痕厚度及成纖維細(xì)胞數(shù)均高于B、C、D組，C組瘢痕厚度及成纖維細(xì)胞數(shù)高于B組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P< 0.05)。B組和D組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P> 0.05)。B組和C組切口未見明顯壞死和延遲愈合。結(jié)論 外用絲裂霉素C能夠抑制成纖維細(xì)胞生長，抑制兔耳瘢痕增生，并且不會造成局部組織壞死，具有較高的安全性。

絲裂霉素C；曲安奈德組；增生性瘢痕

增生性瘢痕是臨床上常見的瘢痕類型，目前臨床治療方法很多，如外科手術(shù)切除、放射治療、瘢痕內(nèi)藥物注射治療、壓力治療、硅凝膠治療等，但均各有利弊。絲裂霉素C是一種常用的臨床抗腫瘤藥物，多項研究已證實其具有強大的抑制成纖維細(xì)胞增殖的功能，能夠有效抑制瘢痕增生[1，2]。本研究采用兔耳瘢痕模型探討絲裂霉素C局部外用對增生性瘢痕的抑制效果。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 由四川大學(xué)華西動物實驗中心提供日本大耳白兔18只，雌雄各半，體重2.0～2.5 kg，月齡8～12月。在四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物房規(guī)范化喂養(yǎng)。

1.2 藥品、試劑與儀器 絲裂霉素C注射液(浙江海正藥業(yè)股份有限公司)；曲安奈德(浙江仙琚制藥股份有限公司)；蘇木精染液、伊紅染液。GE公司Vivid彩色多普勒超聲診斷儀(線陣探頭頻率10 MHz)、Olympus生物學(xué)顯微鏡。

1.3 方法

1.3.1 動物模型的建立和處理 將18只日本大耳白兔規(guī)范化喂養(yǎng)24小時，用1 mg/kg的氯胺酮肌肉注射麻醉，在雙側(cè)兔耳腹側(cè)內(nèi)側(cè)緣中、下部位分別做4個直徑約1 cm的正方形切口，切口間隔1.5 cm，完整切除皮膚至軟骨骨膜，止血，電刀燒灼創(chuàng)面邊緣皮膚，將每只耳朵創(chuàng)面隨機分4組，分別用浸有生理鹽水(A組)、0.1 mg/ml絲裂霉素C(B組)、0.05 mg/ml絲裂霉素C(C組)、1 mg/ml曲安奈德(D組)的小紗布塊外敷5分鐘并保留，后紗布包扎，在術(shù)后3、6、9、12及18天采用同樣的方法換藥。創(chuàng)面在術(shù)后12天可見創(chuàng)面肉芽組織生長，28天可見創(chuàng)面全部瘢痕愈合，愈合后20天開始出現(xiàn)高出皮面的增生性瘢痕。術(shù)后50天耳緣靜脈注射空氣處死動物，無菌條件下連同軟骨切取標(biāo)本，10%甲醛溶液固定，石蠟包埋后切片，HE染色。

1.3.2 瘢痕厚度及成纖維細(xì)胞計數(shù)測定 術(shù)后48天將兔耳放入水中用彩色多普勒超聲掃描測量每個兔耳瘢痕厚度。在HE染色每張切片隨機選取3個高倍視野(×200倍)，計數(shù)各單位視野的成纖維細(xì)胞數(shù)，最后取平均值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用方差分析。P< 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組瘢痕形態(tài)學(xué)特征 肉眼觀察A組瘢痕色澤較B組、C組和D組顏色深，質(zhì)地硬，表面不平整，B、D組瘢痕色澤淺。HE染色組織切片觀察：深部膠原纖維增厚，排列不規(guī)則，或呈旋渦形，或纏繞成繩索狀。在旋渦形或繩索狀的膠原中有粘蛋白的沉積。綜合大體與組織切片證實均為增生性瘢痕。其中A組瘢痕毛細(xì)血管增生明顯，成纖維細(xì)胞核大、密集增生，位于真皮全層，膠原排列紊亂。B組和D組瘢痕組織都較薄，表面平整，層次有序，成纖維細(xì)胞明顯減少(見圖1、圖2)。

2.2 不同組別瘢痕厚度及成纖維細(xì)胞數(shù)比較 A組瘢痕厚度及成纖維細(xì)胞數(shù)均高于B、C、D組，C組瘢痕厚度及成纖維細(xì)胞數(shù)高于B組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P< 0.05)。B組和D組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P> 0.05)。B組和C組切口未見明顯壞死和延遲愈合。

圖1 兔耳增生性瘢痕組織切片(HE染色，×40倍) a：A組；b：B組；c：C組；d：D組 圖2 兔耳增生性瘢痕組織切片(HE染色，×200倍) a：A組；b：B組；c：C組；d：D組

3 討論

瘢痕是創(chuàng)傷愈合的必然產(chǎn)物，除了極表淺的外傷不形成瘢痕外，其余創(chuàng)傷均以瘢痕愈合而告終。通常情況下，瘢痕愈合較平整，不會引起外形和功能障礙，稱為正常瘢痕。但是，如果瘢痕出現(xiàn)高出皮面的異常增生，影響外觀和功能，表現(xiàn)為真皮組織過度增生及細(xì)胞外基質(zhì)成分大量沉積，則稱為異常瘢痕或病理性瘢痕，包括臨床上的增生性瘢痕和瘢痕疙瘩。目前病理性瘢痕的治療主要有：外科手術(shù)切除、內(nèi)科保守治療，后者又包括：放射治療、瘢痕藥物治療、壓力治療、激光治療、冷凍治療和中醫(yī)藥治療等等。外科手術(shù)治療常用于功能部位的增生性瘢痕攣縮畸形，而對于影響外觀的片狀瘢痕效果較差，只能讓瘢痕縮小變窄，稍有不慎還可能造成附加的瘢痕。放射治療廣泛的應(yīng)用于臨床，配合手術(shù)治療，可以使瘢痕疙瘩的術(shù)后復(fù)發(fā)率顯著降低；但放療并發(fā)癥多，如影響皮瓣血供、植皮后早期暴露放療導(dǎo)致皮片易位壞死。所以內(nèi)科保守治療是大部分病理性瘢痕患者樂于采納的方法。內(nèi)科保守治療中，瘢痕內(nèi)藥物注射已應(yīng)用于臨床多年，近年來雖取得了一定進(jìn)步，可是仍沒有完全令人滿意的治療方法。多種激素可用于治療病理性瘢痕，如鹽酸氫化可的松、甲潑尼龍、地塞米松等，最常用的是曲安奈德，但反復(fù)多次局部注射對機體影響較大，如：注射時疼痛劇烈； 系統(tǒng)性不良反應(yīng)包括婦女月經(jīng)功能障礙、腎上腺皮質(zhì)功能抑制、加劇白內(nèi)障和青光眼的發(fā)展、多毛癥、尿糖、股骨頭缺血性壞死、骨質(zhì)疏松癥、蛋白質(zhì)高代謝、消化道出血、易感性增加和使現(xiàn)有感染加劇、高血壓、滿月臉、脂肪分布改變(庫欣綜合征表現(xiàn))、精神障礙等；局部不良反應(yīng)包括潮紅、粟丘疹、類固醇痤瘡、皮膚和皮下組織變薄萎縮、毛細(xì)血管擴張和色素減退或沉著；停藥后局部發(fā)紅、水腫、灼熱、瘙癢、干燥、脫屑等[3]?？鼓[瘤藥有其特殊的作用機制，近年來成為抗瘢痕治療的熱點。研究較多的抗瘢痕的腫瘤藥物有：平陽霉素、絲裂霉素C、5-氟尿嘧啶、博來霉素、秋水仙堿、羥基喜樹堿等。這類藥物可干擾細(xì)胞核酸合成，破壞DNA 復(fù)制，阻止細(xì)胞分裂增殖。

表1 不同組別瘢痕厚度及成纖維細(xì)胞數(shù)

與A組比較：*P< 0.05；**P< 0.01；與C組比較：△P< 0.05，△△P< 0.01

絲裂霉素C是由頭狀鏈霉菌分離出來的抗腫瘤抗生素，含有一個氮丙啶基團(tuán)、一個醌基以及一個米吐烷，它們都參與了與DNA間的烷化反應(yīng)，經(jīng)細(xì)胞內(nèi)酶或自發(fā)的醌基化學(xué)還原以及失去甲氧基后，成為一種雙功能或三功能烷化劑，與腺嘌呤上06位和鳥膘呤上N7位交叉連接，形成鏈間交叉連結(jié)，阻礙DNA復(fù)制，小部分起單鏈烷化作用，使DNA 斷裂，阻礙細(xì)胞的分裂增殖，抑制DNA合成，同時還可選擇性的抑制RNA合成。絲裂霉素C對瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的作用是通過下調(diào)cyclin D1 抑制細(xì)胞增殖和激活caspase-3誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡實現(xiàn)的。絲裂霉素C干擾細(xì)胞內(nèi)正常的維持細(xì)胞存活及增殖的信號蛋白細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1，2-蘇氨酸激酶的活性，促使caspase-3表達(dá)增加，使周圍組織中遷移至炎癥中心的成纖維細(xì)胞未發(fā)生過度增殖轉(zhuǎn)而發(fā)生凋亡，減少膠原纖維生成，從而抑制瘢痕形成[4]。已經(jīng)廣泛的應(yīng)用于眼科[5，6]、耳鼻咽喉科[7，8]、骨科[9，10]、泌尿外科[11]等專業(yè)的手術(shù)中，防治局部組織粘連，但外用于皮膚目前國內(nèi)外還少有報道。

吳曉明等[12]的研究采用濃度分別為2.5、12.5、50、100 和200 mg/L 絲裂霉素C 作用于體外培養(yǎng)的增生性瘢痕成纖維細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)絲裂霉素C可使增生性瘢痕成纖維細(xì)胞的生長阻滯于G0/G1期，并且能夠誘導(dǎo)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞發(fā)生凋亡，有著明顯的濃度依賴性。劉鶯等[13]通過MTT檢測證實100 mg/L絲裂霉素C對瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的增殖抑制效果為最佳(P< 0.01)。作者根據(jù)上述試驗結(jié)果設(shè)計了：0.1 mg/ml和0.05 mg/ml絲裂霉素C兩個濃度組，與1 mg/ml曲安奈德對照，并設(shè)生理鹽水空白組，上述藥物外用于兔耳瘢痕創(chuàng)面愈合早期，創(chuàng)面愈合后測量瘢痕厚度和瘢痕組織成纖維細(xì)胞數(shù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)絲裂霉素C能明顯抑制成纖維細(xì)胞增生，減少瘢痕的產(chǎn)生。0.1 mg/ml絲裂霉素C的抑制效果優(yōu)于0.05 mg/ml，進(jìn)一步證實了劉鶯等[13]的試驗結(jié)果。與1 mg/ml曲安奈德組相比，未見明顯統(tǒng)計學(xué)意義，認(rèn)為0.1 mg/ml絲裂霉素C對于增生性瘢痕的抑制效果等同于1 mg/ml曲安奈德。雖然在實驗中切口愈合早期創(chuàng)面出現(xiàn)局部蒼白等缺血的情況，但與對照組相比，切口最后愈合未出現(xiàn)延遲和切口感染，說明0.1 mg/ml絲裂霉素C外用是安全的。這為我們臨床應(yīng)用絲裂霉素C局部瘢痕注射提供了強有力的理論依據(jù)。

在實驗過程我們總結(jié)出以下經(jīng)驗：①制造模型選取兔子耳朵切口時，一般采用正方形或者長方形切口，且切口一般應(yīng)取在兔耳中部靠耳尖的部分。一方面這個部位產(chǎn)生的瘢痕更容易出現(xiàn)類似人增生性瘢痕的病理改變，另一方面我們在術(shù)后換藥過程中此部位更便于處理包扎。②實驗中使用的絲裂霉素C為臨時配置的生理鹽水溶液，主要是因為絲裂霉素C在水溶液中穩(wěn)定性較差，這也限制了其在皮膚的外用。近年來，隨著制藥工藝的發(fā)展，基礎(chǔ)研究中發(fā)現(xiàn)了一些復(fù)合制劑，有望解決這個問題，如：絲裂霉素殼聚糖納米粒[14]、絲裂霉素C-聚乙二醇控釋膜[15]等等。③國內(nèi)外對于瘢痕的評價方法很多，我們采用的彩色多普勒超聲測量瘢痕厚度，簡單易行，重復(fù)性好，當(dāng)把兔耳置于水中測量時圖像更清晰，測量數(shù)據(jù)精確度高，遠(yuǎn)比在顯微鏡下用測微尺測量方便快捷，但測量時應(yīng)該固定同一儀器和測量者以減少誤差。④絲裂霉素C作為一種抗腫瘤藥物，有多種毒副作用，如：骨髓抑制、胃腸道反應(yīng)、肝腎功能損害等。但同為抗腫瘤藥的平陽霉素用于治療血管瘤多年，取得了良好效果。所以密切的后期隨訪及準(zhǔn)確的劑量控制，可以減少上述毒副作用帶來的危害。⑤本實驗制定的藥物濃度參照了國內(nèi)的一些基礎(chǔ)研究成果[12，13，16]，由于各種條件限制本次實驗沒有制定更多的濃度對照，臨床患者的局部皮膚用藥濃度還需要進(jìn)一步的大樣本研究。

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潘 寧

R758

A

1672-6170(2015)03-0024-04

2015-01-11；

2015-03-06)