結(jié)直腸癌原發(fā)腫瘤與轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中TAZ的表達(dá)情況及其與增殖相關(guān)蛋白的關(guān)系

王愛軍 王紅鈺 徐晉珩 張志勇 吳肖 程健 張超 鄭寶軍 施華 馮俊偉

結(jié)直腸癌原發(fā)腫瘤與轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中TAZ的表達(dá)情況及其與增殖相關(guān)蛋白的關(guān)系

王愛軍 王紅鈺 徐晉珩 張志勇 吳肖 程健 張超 鄭寶軍 施華 馮俊偉

目的:檢測(cè)轉(zhuǎn)錄共激活因子TAZ在結(jié)直腸癌原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中的表達(dá)情況，同時(shí)檢測(cè)2種組織中增殖相關(guān)的增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)、P16、P21、細(xì)胞周期素(Cyclin)E1的表達(dá)，并對(duì)TAZ與這些增殖相關(guān)蛋白的關(guān)系和意義進(jìn)行探討。方法免疫組化(SP)染色檢測(cè)62例伴有區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌石蠟組織標(biāo)本的TAZ、PCNA、P16、P21、Cyclin E1表達(dá)情況，并分析這些蛋白表達(dá)的關(guān)系。結(jié)果淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中TAZ、PCNA、Cyclin E1的陽(yáng)性率明顯高于原發(fā)灶中陽(yáng)性表達(dá)率(均P＜0.05)，P16、P21的陽(yáng)性率明顯低于原發(fā)灶(均P＜0.05)。TAZ、PCNA、P16、P21、Cyclin E1在原發(fā)灶和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中表達(dá)呈正相關(guān)(r分別為0.395、0.450、0.335、0.376、0.281，均P＜0.05)。在結(jié)直腸癌原發(fā)灶及轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中TAZ與PCNA、P16、P21、Cyclin E1之間表達(dá)均具有相關(guān)性(均P＜0.05)。結(jié)論TAZ蛋白表達(dá)在結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)生變化，但有一定規(guī)律，該蛋白可能通過(guò)調(diào)節(jié)增殖相關(guān)蛋白促進(jìn)了結(jié)直腸癌進(jìn)展轉(zhuǎn)移。

結(jié)直腸癌;淋巴結(jié)，轉(zhuǎn)移;TAZ;增殖相關(guān)蛋白

結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖迅速，易于導(dǎo)致轉(zhuǎn)移，是癌患者死亡的重要因素，但轉(zhuǎn)移機(jī)制還不明確。轉(zhuǎn)錄共激活因子(TAZ)是Hippo信號(hào)通路重要的轉(zhuǎn)錄共激活因子之一，參與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中的細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞增殖等多種功能，研究發(fā)現(xiàn)其與結(jié)直腸癌、肺癌等多種腫瘤發(fā)生密切相關(guān)［1，2］，但在結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮的具體作用也不清楚。本研究通過(guò)檢測(cè)TAZ與增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)、P16、P21、細(xì)胞周期素(Cyclin) E1在結(jié)直腸癌原發(fā)灶和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中的表達(dá)情況，初步探討TAZ表達(dá)與結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移與這些增殖相關(guān)蛋白的關(guān)系和意義。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源收集我院2010年1月至2011年12月年手術(shù)切除的伴有區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌組織石蠟標(biāo)本62例，均有原發(fā)灶及相應(yīng)的區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶均由病理證實(shí)。所有病例術(shù)前均未行放療和化療。病理學(xué)分型均為腺癌，其中男35例，女27例;年齡35～76歲，平均年齡57歲。

1.2 主要試劑TAZ、PCNA、P16、P21、Cyclin E1兔抗人單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa CRUZ公司，SP免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒均購(gòu)自北京中杉生物公司。

1.3 方法厚約4 μm的石蠟切片脫蠟水化后依免疫組化SP法染色試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。用已知陽(yáng)性組織切片作為陽(yáng)性對(duì)照，以PBS為陰性對(duì)照。根據(jù)組織陽(yáng)性細(xì)胞百分比和染色強(qiáng)度綜合評(píng)分，10個(gè)隨機(jī)高倍鏡視野下，無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)0分，＜25%計(jì)1分，25%～50%計(jì)2分，51～75%計(jì)3分，＞75%計(jì)4分。染色強(qiáng)度計(jì)分:未著色0分，淡黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分。根據(jù)樣本陽(yáng)性細(xì)胞百分比和染色強(qiáng)度計(jì)分之和的結(jié)果分為0～3分為陰性或弱陽(yáng)性;≥4分為陽(yáng)性和強(qiáng)陽(yáng)性［3］。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，組間相關(guān)性采用Spearmann相關(guān)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TAZ、PCNA、P16、P21、Cyclin E1在結(jié)直腸癌原發(fā)灶和相應(yīng)區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中表達(dá)的情況TAZ、PCNA、Cyclin E1區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率高于在結(jié)直腸癌原發(fā)灶中陽(yáng)性表達(dá)率(P＜0.05);區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率明顯低于結(jié)直腸癌原發(fā)灶中陽(yáng)性表達(dá)率(P＜0.05)。TAZ、PCNA、P16、P21、Cyclin E1在結(jié)直腸癌原發(fā)灶和相應(yīng)區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中表達(dá)呈正相關(guān)性(r= 0.395，r=0.450，r=0.376，r=0.281，r=0.335，均P＜0.05)。見表1。

表1 TAZ、PCNA、P16、P21、Cyclin E1在原發(fā)灶及相應(yīng)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中蛋白表達(dá)情況n=62，例(%)

2.2 TAZ、PCNA、P16、P21、Cyclin E1蛋白在結(jié)直腸癌原發(fā)灶中表達(dá)的相關(guān)性在62例結(jié)直腸癌原發(fā)灶中，TAZ蛋白表達(dá)與PCNA、Cyclin E1蛋白表達(dá)均呈正相關(guān)性(r=0.316，0.310，均P＜0.05)，TAZ蛋白表達(dá)與P16、P21蛋白表達(dá)呈均負(fù)相關(guān)性(r=－0.380，－0.310，均P＜0.05)，P16蛋白表達(dá)與PCNA、Cyclin E1蛋白表達(dá)呈均負(fù)相關(guān)性(r=－0.386，－0.350，均P＜0.05)，P21蛋白表達(dá)與PCNA、Cyclin E1蛋白表達(dá)呈均負(fù)相關(guān)性(r=－0.334，－0.414，均P＜0.05)，PCNA蛋白表達(dá)與Cyclin E1蛋白表達(dá)呈正相關(guān)性(r=0.267;P＜0.05)。

2.3 TAZ、PCNA、P16、P21、Cyclin E1蛋白在區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中表達(dá)的相關(guān)性在62例結(jié)直腸癌相應(yīng)區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中，TAZ蛋白表達(dá)與PCNA、Cyclin E1蛋白表達(dá)均呈正相關(guān)性(r=0.289，r=0.418，均P ＜0.05)，TAZ蛋白表達(dá)與P16、P21蛋白表達(dá)呈均負(fù)相關(guān)性(r=－0.399，r=－0.270，均P＜0.05)，PCNA、P16、P21、Cyclin E1蛋白表達(dá)之間的無(wú)明顯相關(guān)性(均P＞0.05)。

3 討論

TAZ是Hippo信號(hào)通路中一個(gè)主要的轉(zhuǎn)錄共激活因子，通過(guò)結(jié)合蛋白而發(fā)揮作用，蛋白具有7個(gè)同源體，可以與特定基序磷酸化絲氨酸位點(diǎn)結(jié)合，因此它能夠結(jié)合細(xì)胞內(nèi)不同磷酸化蛋白，參與多種細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控功能，如細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞分化等調(diào)控。TAZ又稱為轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子(WWTR)1結(jié)構(gòu)域包含兩個(gè)相同和保守位點(diǎn)色氨酸殘基的模序，TAZ通過(guò)其WW結(jié)構(gòu)域與含有PPXY結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子相互結(jié)合發(fā)揮轉(zhuǎn)錄共激活因子功能［4，5］。Chan等［6］研究發(fā)現(xiàn)具有侵襲性乳腺癌細(xì)胞中TAZ表達(dá)明顯升高，表明其可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲性。Ding等［7］研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌患者，其同一患者TAZ基因在轉(zhuǎn)移灶中的突變率明顯高于原發(fā)灶，表明其可能參與了乳腺癌轉(zhuǎn)移過(guò)程并發(fā)揮作用。Zhou等［8］研究發(fā)現(xiàn)在肺癌組織中TAZ表達(dá)明顯升高，通過(guò)沉默肺癌細(xì)胞中TAZ表達(dá)后，其肺癌細(xì)胞增殖活性明顯受到抑制。

PCNA為DNA聚合酶δ的輔助蛋白。PCNA表達(dá)伴隨細(xì)胞周期不斷變化，在G1早期開始出現(xiàn)上升，S期到達(dá)高峰，G2、M期開始不斷下降，到G0期后維持在極低水平，PCNA磷酸化發(fā)生在Gl/S轉(zhuǎn)換期，通過(guò)與DNA合成部位結(jié)合，激活DNA復(fù)制因子，從而促使細(xì)胞增殖，因此PCNA在增殖細(xì)胞核內(nèi)存在表達(dá)而在細(xì)胞靜止期缺乏表達(dá)［9］。有研究發(fā)現(xiàn)胃癌組織分化越差，PCNA表達(dá)率越高，與細(xì)胞增殖活躍有關(guān)［10，11］。P16基因又稱其為多腫瘤抑制基因，其蛋白功能可與CyelinD競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合CDK4或CDK6，從而使CyelinDCDK4或CyelinD-CDK6復(fù)合物形成受阻，阻止磷酸化，阻礙細(xì)胞從G1期到S期的過(guò)渡，阻止細(xì)胞增殖，對(duì)細(xì)胞周期起著負(fù)性調(diào)控作用［12，13］，P16蛋白低表達(dá)可導(dǎo)致腫瘤形成，Tetsuhiro等［14］研究胃癌組織中發(fā)現(xiàn)，p16表達(dá)明顯降低，并與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)性。還有研究發(fā)現(xiàn)P16在大腸癌組織中為低表達(dá)，并與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［15］，P21基因編碼的蛋白質(zhì)［16］可通過(guò)抑制細(xì)胞質(zhì)中的細(xì)胞周期蛋白(Cyclins)與CDK的復(fù)合物的活性，在S期前阻斷DNA的復(fù)制，從而抑制細(xì)胞的增殖。Cyclin E1出現(xiàn)于G1晚期，在細(xì)胞周期G1/S期轉(zhuǎn)換過(guò)程中起關(guān)鍵作用，使晚G1期和早S期的底物磷酸化，啟動(dòng)DNA復(fù)制。有研究發(fā)現(xiàn)，在結(jié)直腸癌腫Cyclin E表達(dá)與腫瘤浸潤(rùn)程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有相關(guān)性，細(xì)胞周期蛋白E表達(dá)強(qiáng)度與結(jié)直腸癌的細(xì)胞分化和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相［17］。

本研究發(fā)現(xiàn)TAZ、PCNA、Cyclin E在結(jié)直腸癌組織中高表達(dá)，P16、P21呈低表達(dá)，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目呈正相關(guān)(P＜0.05)，且在相應(yīng)區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中蛋白的表達(dá)率與結(jié)直腸癌原發(fā)灶比較，具有顯著差異(P ＜0.05)。提示TAZ、PCNA、P16、P21、Cyclin E的表達(dá)可能參與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展，并與腫瘤侵襲及轉(zhuǎn)移有密切的相關(guān)性，隨著淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目的增多，TAZ、PCNA、Cyclin E表達(dá)越高，P16、P21表達(dá)越低，進(jìn)一步說(shuō)明了結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖程度越高，其侵襲性就越強(qiáng)。此外，研究發(fā)現(xiàn)在在結(jié)直腸癌組織中TAZ、PCNA、P16、P21、Cyclin E蛋白表達(dá)相互之間均存在相關(guān)性(P＜0.05)，而在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中TAZ僅與PCNA、P16、P21、Cyclin E蛋白表達(dá)之間存在相關(guān)性(P＜0.05)，說(shuō)明結(jié)直腸的發(fā)生發(fā)展多因素、多步驟共同參與完成，而在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶與結(jié)直腸癌原發(fā)之間TAZ、PCNA、P16、P21、Cyclin E蛋白表達(dá)發(fā)生了異質(zhì)性變化，表明TAZ可能參與調(diào)控PCNA、P16、P21、Cyclin E表達(dá)，使腫瘤增殖程度增高，使其轉(zhuǎn)移性增加有關(guān)。

綜上所述，TAZ作為一轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，參與了結(jié)直腸癌的發(fā)生、轉(zhuǎn)移，其可能與調(diào)控增殖相關(guān)蛋白使腫瘤細(xì)胞增殖活躍有關(guān)。其可能成為抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移的新靶點(diǎn)，至于通過(guò)何信號(hào)傳導(dǎo)通路促進(jìn)腫瘤發(fā)生、促進(jìn)癌細(xì)胞增殖正在進(jìn)一步研究。

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A

1002－7386(2015)03－0355－03

2014－06－20)

10.3969/j.issn.1002－7386.2015.03.009

063000河北省唐山市工人醫(yī)院腫瘤外科(王愛軍、王紅鈺、吳肖、程健、張超、鄭寶軍、施華、馮俊偉)，病理科(徐晉珩、張志勇)