一株抑制擬南芥生長的真菌的鑒定

田長恩，周玉萍，陳瓊?cè)A，黃小玲，黃章科

（廣州大學(xué)a.生命科學(xué)學(xué)院；b.植物抗逆基因功能研究廣州市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510006）

一株抑制擬南芥生長的真菌的鑒定

田長恩，周玉萍，陳瓊?cè)A，黃小玲，黃章科

（廣州大學(xué)a.生命科學(xué)學(xué)院；b.植物抗逆基因功能研究廣州市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510006）

報道了一種在擬南芥種植介質(zhì)泥炭土上滋生且明顯抑制擬南芥（Arabidopsis thaliana）生長的黃褐色霉?fàn)钫婢?；并通過形態(tài)特征觀察，將該菌初步鑒定為黃色疣枝孢菌（Chromelosporium fulvum）；進(jìn)一步通過rDNA的ITS序列測序和比對分析，將其鑒定為黃色疣枝孢菌.該真菌種是廣東省新記錄種，且該菌抑制擬南芥的生長未見報道.

黃色疣枝孢菌；擬南芥；生長抑制；泥炭土

疣枝孢菌屬（Chromelosporium）由CORDA于1833年建立，隸屬于盤菌目（Pezizales）盤菌科（Pezizaceae），在真菌索引網(wǎng)站（Index Fungorum，http：／／www.indexfungorum.org／Names／Names.asp）共記錄有11個種.黃色疣枝孢菌［Ch．fulvum］是該屬的一種，首先在用于溫室植物栽培的泥炭土上發(fā)現(xiàn)，因而被稱為泥炭霉［1］，可導(dǎo)致十字花科植物甘藍(lán)（Brassica oleracea var.capitata）發(fā)生病害［2］.

本研究組在培養(yǎng)室種植模式植物擬南芥（Arabidopsis thaliana）時發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)用基質(zhì)——泥炭土表面長滿一種黃褐色霉，抑制擬南芥的生長.因此，對該真菌進(jìn)行了形態(tài)鑒定和rDNA ITS序列分析，明確了其分類地位，將其鑒定為Chromelosporium fulvum，為廣東省的新記錄種.

1 材料與方法

1.1 菌種

菌株源于本課題組所用的種植擬南芥的泥炭土（TREF，荷蘭），經(jīng)分離純化后保存于廣州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室.

1.2 主要試劑及儀器

Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0試劑盒和Taq酶，Takara公司產(chǎn)品；其它試劑均為國產(chǎn)分析純；PCR儀，德國Eppendorf公司；核酸蛋白分析儀，美國BECKMAN公司DU800；低溫高速離心機(jī)，美國Beckam Coulter AllegraTM X-22R；常溫高速離心機(jī)，美國Beckam Coulter Microfuge?18；核酸蛋白分析儀，美國Beckam Coulter DU?800；電子天平，瑞士Precisa XS 365M和XT 120A；酸度計，上海宇隆PHS-3C；電熱恒溫水槽，上海森信DKB-600A；全溫振蕩器，哈爾濱東聯(lián)技術(shù)開發(fā)有限公司.

1.3 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

培養(yǎng)基（PDA）：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，硫酸鎂1.5 g，磷酸二氫鉀3 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 L，pH 7.0.

培養(yǎng)條件：28℃，遮光培養(yǎng)3～5 d.

1.4 菌株的形態(tài)學(xué)與分子鑒定

1.4.1 菌株的形態(tài)學(xué)鑒定

依據(jù)植物及大型真菌的菌斑種類形態(tài)鑒定程序MS（i）／C015-C01《真菌鑒定手冊》［3］進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定.

1.4.2 菌株的分子鑒定

基因組DNA的提取采用CTAB法［4］.菌株rDNA ITS區(qū)段的PCR擴(kuò)增：擴(kuò)增引物為ITS-F：5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACA-3′和ITS-R：5′-CCTACCTGATCTGAGGTCA-3′.PCR反應(yīng)體系（50 μL）包括10×PCR Buffer 5 μL、dNTP 1 μL、DNA模板1 μL、引物各1 μL、Taq酶0.5 μL、MgCl25μL、ddH2O 35.5 μL.反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性1 min，54℃退火1 min，72℃延伸1 min，35個循環(huán)，72℃延伸7 min.PCR產(chǎn)物先經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離，然后用凝膠NDA回收試劑盒（Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0）純化后與pMD-18T（TaKaRa）載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH-5α，選取陽性克隆送上海生物工程公司測序，測序結(jié)果提交至GenBank進(jìn)行Blast同源序列搜索，找出該菌株與數(shù)據(jù)庫中同源性最高的模式菌株或保藏于ATCC等國際菌種保藏中心的菌株.

1.5 擬南芥的種植與生長觀測

將野生型擬南芥（colombia生態(tài)型）的種子浸泡于蒸餾水中，在4℃冰箱放置48 h后，點(diǎn)種在泥炭土（TREF，荷蘭）上，置于溫度22±1℃、16 h光照和8 h黑暗的培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)，定期澆水與施肥.將泥炭土在高壓滅菌鍋中經(jīng)121℃處理30 min，獲得無真菌基質(zhì).

生長觀測：用直尺測量4周苗齡植株的葉片長度和寬度；用天平（Precisa-XT 120A）稱量植株的鮮重.每處理隨機(jī)統(tǒng)計5個植株，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次.

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的發(fā)現(xiàn)

本實(shí)驗(yàn)室長期從事擬南芥基因功能的研究工作，需要種植擬南芥.從2009年8月起，發(fā)現(xiàn)用于栽培的泥炭土表面經(jīng)常滋生一種黃褐色的霉?fàn)钫婢▓D1C）.圖1所示的有、無真菌泥炭土上的植物的照片為同時播種、相同管理、同時拍攝而得.無真菌基質(zhì)是將泥炭土在高壓滅菌鍋中經(jīng)121℃處理30 min所得；有真菌基質(zhì)為未經(jīng)高壓滅菌的市場購回的泥炭土.比較有、無真菌泥炭土上的植物的長勢，不難發(fā)現(xiàn)，真菌的滋生，明顯地抑制了擬南芥的生長（圖1B）.此外，對4周苗齡植株的葉片長度和寬度以及植株的鮮重的觀測結(jié)果（表1）進(jìn)一步說明真菌的滋生，顯著地抑制了擬南芥的生長.

圖1 抑制擬南芥生長的黃褐色霉?fàn)钫婢闒ig.1 The yellow-brown mold-like fungal strain inhibiting Arabidopsis thaliana growth

表1 真菌滋生對擬南芥生長的影響Table 1 Effect of the growing fungal strain on growth of Arabidopsis thaliana

為了控制該菌的蔓延，有必要弄清該菌株的分類地位.于是，就從培養(yǎng)基質(zhì)——泥炭土中分離出相應(yīng)菌株，進(jìn)行形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定.

2.2 菌株的形態(tài)學(xué)鑒定

依據(jù)植物及大型真菌的菌斑種類形態(tài)鑒定程序［3］進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定.菌落在PDA培養(yǎng)基中呈流狀，絲絨狀至叢毛狀，初期白色或淡黃色，后呈淺赭黃色或棕土色.菌絲纖細(xì)，寬9.80～22.10 μm，多數(shù)為匍匐狀，但有些是松散的交織成網(wǎng)狀（圖2A，圖2B），透明（圖2A，箭頭所指）至淡黃褐色（圖2A，三角形所指），具分枝，有隔.分生孢子梗直立或分枝，單生或群居，有時在菌絲頂端出現(xiàn)二叉分枝；初期透明，后期會漸變成淺棕色，光滑，有隔膜.產(chǎn)孢細(xì)胞圓柱狀至棍棒狀，具細(xì)齒.分生孢子單個，頂側(cè)生，通常單個分生孢子無色透明（圖2C，箭頭所指）；當(dāng)聚在一起時有色，球形，光滑（圖2D）；孢子直徑4.90～7.84 μm.

上述宏觀特征和顯微特征符合黃色疣枝孢菌（Chromelosporium fulvum）種的特征范圍.

圖2 抑制擬南芥生長的真菌菌株的形態(tài)學(xué)觀察Fig.2 Observation for the fungal strain inhibiting Arabidopsis thaliana growth

2.3 菌株的分子鑒定

以該菌株基因組DNA為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得一段長度為606 bp的rDNA片段，序列結(jié)果見圖3（下劃線區(qū)域的序列為引物）.

將該序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blastn搜索，得到一系列同源性較高的ITS序列.其中，與GenBank連接號為HQ29059.1的ITS區(qū)段同源性最高，606個堿基中沒有任何差異，序列相似性為100%（表2）.RENSKE等［5］認(rèn)為，通過ITS區(qū)域比對，序列相似性≥99%的真菌可鑒定為同一個種. GenBank接收號為HQ29059.1的序列源于黃色疣枝孢菌Ch．fulvum，因此，可以確定該菌株為黃色疣枝孢菌Ch．fulvum.

可見，從形態(tài)特征上對目標(biāo)菌株所鑒定的種名與基于ITS序列、通過GenBank數(shù)據(jù)庫檢索所得到的最相似物種完全一致.

圖3 目標(biāo)菌株的rDNA序列Fig.3 The rDNA sequence of the strain

表2 目標(biāo)菌株的ITS序列與其他已知IST序列的比對Table 2 Alignment of the rDNA sequence of the strain to other known IST sequences

3 討 論

1975年，HENNEBERT等在用于溫室植物栽培的泥炭土上發(fā)現(xiàn)了真菌Ch．ollare，稱之為泥炭霉［1］.1977年，KILPATRICK發(fā)現(xiàn)“另一種”泥炭霉Ch．fulvum可導(dǎo)致十字花科植物甘藍(lán)發(fā)生病害［2］. 1985年，COETZEE等根據(jù)國際命名法規(guī)將病菌泥炭霉命名為黃色疣枝孢菌（Ch．fulvum），并將Ch．ollare歸為此菌［6］.截至目前，黃色疣枝孢菌已在北美［1］、歐洲［2，6］、南非［7］、中國的臺灣［8］和山東［9］等地相繼被發(fā)現(xiàn).

擬南芥屬十字花科植物，是植物生物學(xué)研究的模式植物，主要在培養(yǎng)室種植，可用泥炭土作為栽培介質(zhì).本研究組在擬南芥的栽培過程中發(fā)現(xiàn)，1種黃褐色的霉菌的滋生能非常明顯的抑制擬南芥的生長（圖1，表1）.繼而分離該菌株，并以傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)特征為依據(jù)，同時采用rDNA ITS序列的比較分析等分子生物學(xué)手段（圖2～圖4和表2），對霉菌進(jìn)行了分類鑒定，確定該菌株為黃色疣枝孢菌.經(jīng)查實(shí)，該真菌是廣東省新記錄種.就筆者所知，黃色疣枝孢菌抑制擬南芥生長未見報道.

本實(shí)驗(yàn)室所用的泥炭土是由荷蘭進(jìn)口的TREF品牌，黃色疣枝孢菌的滋生可能是對泥炭土的消毒滅菌不徹底所導(dǎo)致的結(jié)果.既然能導(dǎo)致十字花科植物甘藍(lán)發(fā)生病害［2］，那么黃色疣枝孢菌抑制同科植物擬南芥的生長就是完全可能的.

［1］ HENNEBERT G L，KORF R P.The peat mould，Chromelosporium ollare，conidial state of Peziza ostracoderma，and its misapplied names，Botrytis crystallina，B．spectabilis，Ostracoderma epigaeum and Peziza atrovinosa［J］.Mycologia，1975，67：214-240.

［2］ KILPATRICK R A.Symptoms and control of the peat mold，Chromelosporium fulvum，on Crambe abyssinica［J］.Plant Disease Rep，1977，61：93-95.

［3］ 曾大興.適于RAPD分析的真菌DNA提取方法［J］.生物技術(shù)，2003，13（2）：20-21. ZENG D X.A method of DNA extraction for RAPD analysis in fungi［J］.Biotechno logy， 2003，13（2）：20-21.

［4］ 魏景超.真菌鑒定手冊［M］.上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社，1979. WEI J C.Handbook for fungi identification［M］.Shanghai：Shanghai Sci＆Tech Press，1979.

［5］ RENSKE L，PAULA L，THANW K，et al.Molecular identification of Ectomycorrhizalm ycelium in soil horizons［J］.Appl Environ Microbiol，2003，69（1）：327-333.

［6］ COETZEE J C，EICKER A.Chromelosporium fulvum，the correct name for the anamorph of the peat mould［J］.Phytophylactica，1985，17（3）：173.

［7］ COETZEE J C，EICKER A.Chromelosporium ollare reported in South Africa［J］.Phytophylactica，1983，15：11-12.

［8］ TSENG H Y，CHEN Z C.Materials for the fungal flora of Taiwan（1）［J］.Tran Mycol Soc Rep China，1987，2（1）：65-72.

［9］ 金靜，王遠(yuǎn)路，李桂舫，等.殼皮盤菌2個無性型的報道［J］.菌物研究，2008，6（2）：67-69. JIN J，WANG Y L，LI G F，et al.Two anamorphic taxa of Peziza ostracoderma［J］.J Fung Res，2008，6（2）：67-69.

Identification of a fungal strain which inhibits Arabidopsis thaliana growth

TIAN Chang-en，ZHOU Yu-ping，CHEN Qiong-hua，HUANG Xiao-ling，HUANG Zhang-ke
（a.School of Life Sciences；b.Guangzhou Key Laboratory for Functional Study on Stress-Resistant Genes in Plants，Guangzhou University，Guangzhou 510006，China）

Firstly，a yellow-brown mold-like fungal species which propagated in the cultivation media peat and inhibited Arabidopsis thaliana growth was found in our laboratory.Then，the species was preliminarily distinguished as Chromelosporium fulvum（Link）McGinty based on its morphological characters.At last，through sequencing and alignment to other known IST sequences of rNDA，this strain was again identified as Ch．fulvum（Link）McGinty.This fungal species is a new record in Guangdong Province，China.To our knowledge，this is the first report for Ch．fulvum to inhibit A．thaliana growth.

Chromelosporium fulvum；Arabidopsis thaliana；growth inhibition；peat

Q 949.32

A

【責(zé)任編輯：周 全】

1671-4229（2015）01-0039-04

2014－09－24；

2014－12－14

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（31170204，31470014）；羊城學(xué)者科研資助項(xiàng)目（12A001G）

田長恩（1964－），男，教授，博士.E-mail：changentian＠aliyun.com