高通量篩選高特異性的檢測類風濕關節(jié)炎的生物探針分子

李洪偉，吳仲巋，楊家安，趙曉飛

（1.武漢理工大學材料科學與工程學院，湖北武漢430070；2.麥科羅醫(yī)藥科技有限公司，湖北武漢430075）

高通量篩選高特異性的檢測類風濕關節(jié)炎的生物探針分子

李洪偉1，吳仲巋1，楊家安2，趙曉飛2

（1.武漢理工大學材料科學與工程學院，湖北武漢430070；2.麥科羅醫(yī)藥科技有限公司，湖北武漢430075）

從靶蛋白-配體特異性結合角度，采用蛋白折疊碼（PFSC）技術在PDB數(shù)據(jù)庫中高通量地篩選出與TNFA_HUMAN靶點區(qū)結合靈敏度高的分子作為檢測類風濕關節(jié)炎的生物探針分子.結果顯示，小分子307具有相對較高的靈敏度和較低的檢出限，可以作為生物探針來檢測類風濕關節(jié)炎.結果顯示，蛋白指紋檢索技術是一種快速、有效的蛋白質結構檢索工具，通過對數(shù)據(jù)庫中海量數(shù)據(jù)的篩選，可為重大疾病的檢測試劑開發(fā)提供先導信息.①

蛋白折疊形狀碼；高通量篩選；類風濕關節(jié)炎；生物探針分子

0 引言

類風濕關節(jié)炎RA是一種常見的以關節(jié)炎癥和滑膜細胞增殖為特征的全身性自身免疫性疾病，具有極高的致畸性［1-2］，臨床癥狀類似于風濕性關節(jié)炎，但兩者病因病理相差巨大.傳統(tǒng)檢測RA的方法是檢測類風濕因子RF水平，但存在大量漏診和誤診狀況［3-5］.有大量資料表明，在RA滑膜病變的發(fā)展過程中有多種炎性因子，其中巨噬細胞分泌的細胞因子IL-1、TNF-α在發(fā)病過程中起主導作用，病患血液和炎性滑液中IL-1、TNF-α明顯高于健康人群，且隨疾病的活動度增高而升高，二者相互協(xié)同［6-9］.因此，我們可通過檢測其中之一來診斷RA，本研究中以TNF-α為例.

目前，基于靶點蛋白的藥物因具有高特異性和高敏感度成為當今藥物開發(fā)的研究熱點，TNFA_HUMAN是類風濕關節(jié)炎的一個重要治療靶蛋標［10］，本研究中從蛋白質-配體高特異性結合的角度，擬從與靶蛋白相互作用的小分子配位體的角度來檢測目標靶蛋白.目前，蛋白質數(shù)據(jù)庫（PDB）已經(jīng)積累了大量蛋白質結構數(shù)據(jù)，庫中除了含有蛋白質結構外，還包括將近兩萬小分子配位體.如何從海量已知數(shù)據(jù)庫中篩選針對特定蛋白靶標的配位體是非常困難的，在蛋白折疊形狀碼（PFSC）基礎上發(fā)展的蛋白指紋檢索技術可以對數(shù)以萬計的蛋白結構進行快速有效檢索［11-13］.因此本研究中采用PFSC技術從配位體分子角度高通量地篩選出與TNFA_HUMAN靶點區(qū)結合敏感度高的分子，為類風濕關節(jié)炎檢測試劑的開發(fā)提供先導信息.

1 實驗部分

1.1 數(shù)據(jù)來源TNF-α是由白血球產(chǎn)生具有抗腫瘤作用而導致炎癥的細胞因子，TNF-α拮抗劑是控制類風濕關節(jié)炎病情發(fā)展的有效藥物［10］，因此，本研究中從治療RA的靶點-配體分子的角度篩選配體分子.首先，從PDB中提取有關TNF-α的pdb晶體結構，共14個，分別是1A8M，1TNF，2AZ5，2E7A，2TUN，2ZJC，2ZPX，3ALQ，3IT8，3L9J，3WD5，4G3Y，4TSV，5TSW.我們以DrugBank數(shù)據(jù)庫發(fā)布的信息，找出其中能與小分子配位體作用的TNF-α蛋白結構，它們分別是3ALQ，3L9J，2AZ5，2ZJC和3IT8，其中3ALQ與3L9J是金屬配體，特異結合性較差，故范圍縮小至2AZ5、2ZJC與3IT8 3種.

理想的探針分子應該具有較高的選擇性，但小分子通常會作用于多個靶點蛋白，所以需要在全部的PDB數(shù)據(jù)庫中檢索出與小分子配體和TNFA_HUMAN作用相似的蛋白并進行打分排序，從中篩選出對TNFA_HUMAN兼具高特異性高敏感度的小分子用作類風濕關節(jié)炎檢測試劑的開發(fā).

表1 可與小分子配位體相互作用的蛋白結構

1.2 方法

1.2.1 蛋白三維結構轉換成一維PFSC碼蛋白形狀折疊碼（PFSC）技術是采用27個向量（包括26個英文字母和一個符號$）表示的描述蛋白質碳骨架從氨基端到碳基端的三維結構的方法，它可以將一個具有確定三維結構的蛋白質全部或部分的轉化為一維指紋結構的編碼，并且可以精細區(qū)分出相似三維結構及功能［12-13］.通過PFSC程序將全部PDB數(shù)據(jù)的蛋白質三維結構（截止到2015年1月15日，共106 082個）下載并轉化成一維指紋數(shù)據(jù)庫，以便高通量檢索提取有用信息.

1.2.2 分子作用模擬Accelrys Discovery Studio（DS）是基于結構的蛋白質模擬、優(yōu)化和藥物設計工具.分別模擬出2AZ5、2ZJC與3IT8 3種蛋白質與其小分子配體相互作用模型，觀察pdb文件中配體與蛋白質作用位置（即活性位點）以幫助定義目標靶點區(qū).

圖1 2AZ5與配體相互作用構象的側面視圖（A）和俯視圖（B）

圖2 2ZJC與配體相互作用構象的側面視圖（A）和俯視圖（B）

圖3 3IT8與配體相互作用構象的側面視圖（A）和俯視圖（B）

1.2.3 TNFA靶點區(qū)定義設置PFSC程序檢索條件值，結合Discovery Studio模擬中與配體較強作用的活性位點定義檢測靶點片段，通過PFSC程序先將蛋白靶點區(qū)結合位點片段的空間構型轉換為一維指紋碼，對結合位點在PDB一維指紋碼數(shù)據(jù)庫內進行高通量的相似性搜索，擬發(fā)現(xiàn)具有類似結合位點的復合物晶體結構.

1.2.4 數(shù)據(jù)庫掃描及處理從TNFA_HUMAN靶點區(qū)出發(fā)，利用上述藥物蛋白靶點檢索技術分別掃描全部的蛋白指紋數(shù)據(jù)庫，通過比較蛋白指紋數(shù)據(jù)庫中蛋白-配體特異性結合位點與TNFA蛋白-配體結合位點的相似性進行打分，打分系統(tǒng)由PFSC碼、關鍵殘基的物理化學性質（PHCP-k）和全部殘基的物理化學性質（PHCP-a）等組成，分數(shù)進行加權［13］，分值越高表示特異性結合程度越相似，將與同一蛋白作用的各片段分值導入Excel表格，根據(jù)加權分值降序排列，提取出特異性結合度高的排名前200的蛋白結構添加Uniport信息，最終篩選出與TNFA_HUMAN靶蛋白作用相似性最大的小分子配體，可以用作開發(fā)類風濕關節(jié)炎檢測試劑.

2 結果與討論

2.1 靶點區(qū)選取

2.1.1 2AZ5靶點區(qū)選取2AZ5共有4條多肽鏈與2個小分子配位體（307），結合Discovery Studio模擬結合位點圖示可以知道同側兩條鏈與同一個配體相互作用，整個模擬圖呈軸對稱，同側鏈（A鏈和C鏈）得到的靶點區(qū)也相似，本研究對與A鏈和C鏈作用的靶點區(qū)進行分析，PFSC確定結合位點編碼區(qū)如表2所示.

表2 2AZ5靶點區(qū)的氨基酸序列和PFSC編碼

表3 2JZC靶點區(qū)的氨基酸序列和PFSC編碼

表4 3IT8靶點區(qū)的氨基酸序列和PFSC編碼

2.1.2 2ZJC靶點區(qū)選取對于2ZJC結構，Discovery Studio模擬結合位點顯示其三條鏈均與配位體GOL作用，PFSC確定的結合位點靶點區(qū)見表3.

2.1.3 3IT8靶點區(qū)選取3IT8共有12條鏈，其中D、E、F、J、K、L共6條鏈可以與小分子NAG作用，結合Discovery Studio模擬結合位點，每條鏈與NAG作用的位點也相似，因此選擇E鏈上的靶點區(qū)作為檢索靶點，PFSC確定的結合位點靶點區(qū)見表4.

2.2 相似性檢索的數(shù)據(jù)處理

2.2.1 2AZ5的數(shù)據(jù)分析在全部檢索結果中選出前200名受體蛋白，添加Uniprot信息.正文中選取了應用PFSC碼在10萬蛋白結構數(shù)據(jù)庫中高通量篩選出的與2AZ5和小分子結合性相似度排名前20的蛋白質，藥物蛋白靶點檢索結果顯示小分子307可以作用于TNFA_HUMAN、OMPX_ECOLI、PAGP_ECOLI等多種受體蛋白.在我們選取的排名前200蛋白中，除了集中作用于TNFA_HUMAN之外，還集中作用于包括OMP、BGAL、Q8WSF8和Q8RLA6等類別受體（表5）.同時，根據(jù)藥物蛋白靶點檢索相似性打分的結果顯示307小分子優(yōu)先且集中作用于TNFA_HUAMN族蛋白，說明小分子307對TNFA_HUMAN靶蛋白兼具特異結合性和較高的敏感度，因此可以將小分子307作為類風濕關節(jié)炎檢測試劑的潛在探針分子.

2.2.2 2JZC的數(shù)據(jù)分析正文中選取了應用PFSC碼在10萬蛋白結構數(shù)據(jù)庫中高通量篩選出的與2JZC和小分子GOL結合度相似性排名前20的蛋白質，藥物蛋白靶點檢索結果顯示小分子GOL可以集中且優(yōu)先作用于CARP_YEAST蛋白靶標.在我們選取的排名前200蛋白中，除了集中作用于CARP_YEAST之外，還集中作用于包括GSA_SYNE、AMPM_ECOLI、Q89ZB9_BACTN、B2 MG_HUMAN等類別受體（表6）.同時，根據(jù)藥物蛋白靶點檢索相似性打分的結果顯示小分子GOL對目標蛋白TNFA_HUMAN只有特異結合性并無較高的敏感度，因此，不能將小分子GOL作為檢測類風濕關節(jié)炎的潛在探針分子.

表5 使用PFSC碼高通量篩選出與2AZ5和小分子307相似結合的排名前20的蛋白質（10萬數(shù)據(jù)庫）

表6 高通量篩選出與2JZC和小分子GOL相似結合的排名前20的蛋白質（10萬數(shù)據(jù)庫）

續(xù)表6

2.2.3 3IT8的數(shù)據(jù)分析正文中選取了應用PFSC碼在10萬蛋白結構數(shù)據(jù)庫中高通量篩選出的與3IT8和小分子NAG結合性相似度排名前20的蛋白質，藥物蛋白靶點檢索結果顯示小分子NAG可以優(yōu)先作用于TNFA_HUMAN蛋白靶標，但在我們選取的排名前200蛋白中來看，NAG并不集中作用于TNFA_HUMAN蛋白靶標，還集中作用于包括KDM6B_MOUSE、OMPA_ECOLI、PAGP_ECOLI、APEA_CLOAB等類別受體，說明NAG對于TNFA_HUMAN蛋白靶標敏感度不高（表7）.同時，根據(jù)藥物蛋白靶點檢索相似性打分的結果顯示小分子NAG對目標蛋白TNFA_HUMAN并無具有高度的敏感性，只具有特異結合性，因此不能將小分子NAG不能作為類風濕關節(jié)炎檢測試劑的潛在探針分子.

表7 使用PFSC碼高通量篩選出與3IT8和小分子NAG相似結合的排名前20的蛋白質（10萬數(shù)據(jù)庫）

3 結論

1）基于靶點診斷可以在RA的早期就具有較高的檢出限，同時，可以結合RA的其他征象進行綜合評估，為類風濕關節(jié)炎的早期診斷、疾病活動性和預后提供了重要的參考，另外，本方法在治療的過程中也可作為觀察療效的一個重要指征.

2）本研究從蛋白質-配體高特異性結合角度，高通量地虛擬篩選出與TNFA_HUMAN靶點區(qū)結合敏感度高的小分子307，為類風濕關節(jié)炎檢測試劑提供了先導信息.

3）采用PFSC技術進行的高通量篩選整個PDB數(shù)據(jù)庫（約十萬蛋白質）僅需幾個小時，大大提高了篩選效率，具有很大的應用前景.

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（責任編輯 胡小洋）

High-throughput screening of biological probe molecules with high specificity to detection of rheumatoid

LI Hongwei1，WU Zhongkui1，YANG Jiaan2，ZHAO Xiaofei2
（1.School of Materials and Engineering Science，Wuhan University of Technology，Wuhan 430070，China；2.Micro PharmaTech，Co.Ltd.，Wuhan 430075，China）

From the perspective protein-ligandspecific binding，the protein folding code（PFSC）will be used for high-throughput screening the molecule which is high sensitivity binding to TNFA_HUMAN target area from PDB database as biological probes molecular detection of rheumatoid disease.The results show that 307 small molecules have a relatively high sensitivity and low detection limits，so it can be used as biological probes to detect rheumatoid arthritis，also confirmed protein fingerprint retrieval technology is a rapid，efficient tool for the screening protein structure，also by screening for massive data in the database，providing information for pilot testing reagent development of major diseases.

protein folding shape code；high-throughput screening；rheumatoid arthritis detection；biological probe molecules

O69；Q599

A

10.3969/j.issn.1000-2375.2015.05.021

1000-2375（2015）05-0506-07

2015-02-03

研究生自主創(chuàng)新基金(2014-zy-014)資助

李洪偉（1988-），女，碩士生；吳仲巋，通信作者，教授，E-mail：zkwu@whut.edu.cn