側(cè)腦室微量注射ghrelin對(duì)大鼠小腸轉(zhuǎn)運(yùn)的作用及其機(jī)制

王 燕，史海濤，秦 斌，李 紅，姜 炅，宋亞華

（西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部第二附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，陜西省腸胃動(dòng)力疾病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西省胃腸疾病臨床研究中心，陜西西安 710004）

◇基礎(chǔ)研究◇

側(cè)腦室微量注射ghrelin對(duì)大鼠小腸轉(zhuǎn)運(yùn)的作用及其機(jī)制

王 燕，史海濤，秦 斌，李 紅，姜 炅，宋亞華

（西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部第二附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，陜西省腸胃動(dòng)力疾病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西省胃腸疾病臨床研究中心，陜西西安 710004）

目的 探討側(cè)腦室微量注射ghrelin對(duì)大鼠小腸運(yùn)動(dòng)的作用及對(duì)中樞和胃腸道c-Eos表達(dá)的影響。方法 ①給大鼠分別埋置十二指腸導(dǎo)管及側(cè)腦室套管，禁食24 h后經(jīng)側(cè)腦室微量注射生理鹽水或ghrelin（0.4、1.6μg/kg或6.4μg/kg），經(jīng)十二指腸導(dǎo)管注射伊文氏藍(lán)溶液，觀察不同劑量ghrelin對(duì)小腸轉(zhuǎn)運(yùn)的影響。另2組大鼠分別接受側(cè)腦室注射ghrelin受體拮抗劑（D-Lys3）GHRP-6（3.7μg/kg）、（D-Lys3）GHRP-6（3.7μg/kg）+ghrelin（6.4μg/kg），探討ghrelin對(duì)小腸轉(zhuǎn)運(yùn)的作用機(jī)制。②采用免疫組織化學(xué)和圖像分析方法觀察側(cè)腦室注射ghrelin對(duì)大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)和腸神經(jīng)系統(tǒng)c-Eos蛋白表達(dá)的影響，并觀察（D-Lys3）GHRP-6對(duì)ghrelin作用的影響。結(jié)果 ①側(cè)腦室微量注射ghrelin 0.4μg/kg對(duì)大鼠小腸轉(zhuǎn)運(yùn)無(wú)顯著影響，ghrelin 1.6μg/kg和6.4μg/kg可促進(jìn)小腸轉(zhuǎn)運(yùn)，此作用被（D-Lys3）GHRP-6阻斷。②側(cè)腦室微量注射ghrelin可激活中樞多個(gè)部位的c-Eos蛋白表達(dá)，包括下丘腦弓狀核、室旁核、下丘腦腹內(nèi)側(cè)核、杏仁內(nèi)側(cè)核、迷走神經(jīng)背核等核團(tuán)；胃、十二指腸、近端結(jié)腸的c-Eos表達(dá)增加，胃的c-Eos蛋白表達(dá)增加最顯著。Ghrelin受體拮抗劑（D-Lys3）GHRP-6可抑制ghrelin激活的中樞神經(jīng)系統(tǒng)和腸神經(jīng)系統(tǒng)的c-Eos蛋白表達(dá)。結(jié)論 側(cè)腦室微量注射ghrelin促進(jìn)大鼠小腸轉(zhuǎn)運(yùn)，其促動(dòng)力作用可能通過(guò)受體GHSR介導(dǎo)。側(cè)腦室微量注射ghrelin可通過(guò)中樞神經(jīng)系統(tǒng)和腸神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)小腸運(yùn)動(dòng)。

ghrelin；小腸轉(zhuǎn)運(yùn)；中樞神經(jīng)系統(tǒng)；腸神經(jīng)系統(tǒng)；c-Eos

腦腸肽ghrelin是由28個(gè)氨基酸組成的小分子多肽，在中樞和外周組織均有分布，其受體是生長(zhǎng)激素促分泌素受體（growth hormone secretagogue receptor，GHSR）［1］。Ghrelin的生物學(xué)作用比較廣泛，可保護(hù)胃黏膜，調(diào)節(jié)能量代謝，可通過(guò)中樞和外周機(jī)制促進(jìn)攝食，促進(jìn)胃排空［2-5］。新近研究發(fā)現(xiàn)，ghrelin與消化道運(yùn)動(dòng)關(guān)系密切，中樞和靜脈注射ghrelin可促進(jìn)攝食，誘發(fā)進(jìn)食大鼠的禁食期肌電活動(dòng)［6-7］，靜脈注射ghrelin可促進(jìn)胃排空、小腸轉(zhuǎn)運(yùn)和結(jié)腸傳輸［8-10］。我們既往研究也發(fā)現(xiàn)，靜脈給予ghrelin對(duì)禁食大鼠的小腸轉(zhuǎn)運(yùn)有促進(jìn)作用［11］，但中樞注射ghrelin對(duì)小腸轉(zhuǎn)運(yùn)的影響尚未見(jiàn)報(bào)道。胃腸道的運(yùn)動(dòng)功能與腸神經(jīng)系統(tǒng)（enteric nervous system，ENS）和中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system，CNS）密切相關(guān)。RUTER等發(fā)現(xiàn)經(jīng)腹腔給予ghrelin可增加禁食期大鼠的攝食量，并增加與攝食相關(guān)的中樞核團(tuán)，如弓狀核和室旁核的c-Eos蛋白表達(dá)量［12］。還有研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)室旁核或側(cè)腦室微量注射ghrelin可促進(jìn)大鼠攝食，使背內(nèi)側(cè)核、孤束核、弓狀核、室旁核等核團(tuán)的c-Eos蛋白表達(dá)量增加［13-15］。然而中樞微量注射ghrelin對(duì)大鼠小腸轉(zhuǎn)運(yùn)有何影響，能否增加與促消化道運(yùn)動(dòng)相關(guān)核團(tuán)的c-Eos蛋白表達(dá)，對(duì)脊髓的c-Eos蛋白表達(dá)量有何影響，ghrelin對(duì)核團(tuán)c-Eos蛋白表達(dá)量的增加作用是否與受體功能相關(guān)，目前尚未見(jiàn)報(bào)道。中樞微量注射ghrelin對(duì)大鼠胃腸道c-Eos蛋白表達(dá)量的影響也未闡明。我們的研究觀察了側(cè)腦室微量注射ghrelin對(duì)大鼠小腸轉(zhuǎn)運(yùn)及CNS和ENS的c-Eos蛋白表達(dá)的影響，重點(diǎn)分析了與促胃腸動(dòng)力有關(guān)腦區(qū)的c-Eos蛋白表達(dá)量變化，并研究了受體拮抗劑（DLys3）GHRP-6對(duì)ghrelin作用的影響，為闡明ghrelin的促動(dòng)力作用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康成年SD大鼠，雌雄不限，體質(zhì)量為220～240 g，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 儀器和試劑伊文氏藍(lán)由美國(guó)Sigma公司提供，兔抗大鼠c-Eos蛋白抗體由美國(guó)Santa Cruz公司提供，（D-Lys3）GHRP-6由美國(guó)Anaspec公司提供，Ghrelin由美國(guó)鳳凰生物制品有限公司提供，中樞立體定位儀由日本Narishige公司提供。

1.3 側(cè)腦室套管置入大鼠禁食8 h，腹腔注射100 g/L水合氯醛400 mg/kg麻醉，固定于中樞立體定位儀，頭部去除毛發(fā)，消毒，剪去直徑約1 cm面積的皮膚，顯露前囟，按照SD大鼠腦立體定位圖譜，將中樞套管置入側(cè)腦室。側(cè)腦室坐標(biāo)（前囟后1.0 mm，正中線旁開(kāi)2.0 mm，顱骨表面下3.5 mm），用牙科水泥和牙托粉固定中樞套管，小螺絲釘加固，橡膠塞封住套管外口。術(shù)后3 d動(dòng)物恢復(fù)良好，可用于實(shí)驗(yàn)。側(cè)腦室微量注射采用5μL微量進(jìn)樣器，經(jīng)頭部預(yù)置的中樞套管注入，注射體積為5μL，針尖伸出套管末端1 mm緩慢注入，注射后將微量注射器保留2 min，以防止藥物回流。

1.4 小腸轉(zhuǎn)運(yùn)試驗(yàn)①置入十二指腸導(dǎo)管。大鼠實(shí)驗(yàn)前禁食18 h，用100 g/L的水合氯醛400 mg/kg腹腔注射麻醉。整個(gè)手術(shù)過(guò)程嚴(yán)格遵循無(wú)菌操作原則。沿腹中線剪開(kāi)腹壁各層組織，選擇距幽門(mén)1 cm的十二指腸處為穿刺點(diǎn)，用18 G針頭經(jīng)穿刺點(diǎn)穿刺十二指腸腸腔，再經(jīng)穿刺點(diǎn)插入聚乙烯導(dǎo)管（內(nèi)徑0.7 mm，外徑1.0 mm），導(dǎo)管一端留置在腸腔內(nèi)約1 cm，用手術(shù)線縫合固定導(dǎo)管。在肩胛間區(qū)和右上腹之間用手術(shù)鉗做皮下隧道，將導(dǎo)管通過(guò)皮下隧道固定于肩胛間。術(shù)后大鼠置于37℃溫室內(nèi)2～3 h，之后分籠單獨(dú)飼養(yǎng)。②測(cè)量小腸轉(zhuǎn)運(yùn)。術(shù)后1周將造好的大鼠動(dòng)物模型禁食24 h，隨機(jī)分為6組（n=6）：生理鹽水組（5μL），ghrelin 0.4μg/kg組，ghrelin 1.6μg/kg組，ghrelin 6.4μg/kg組，（D-Lys3）GHRP-6 3.7μg/kg組，（DLys3）GHRP-6（3.7μg/kg）+ghrelin（6.4μg/kg）組。所給藥物溶于5μL生理鹽水，最后一組大鼠的2次給藥間隔時(shí)間為15 min。側(cè)腦室微量注射藥物或生理鹽水后，經(jīng)十二指腸導(dǎo)管注入0.1 m L伊文氏藍(lán)溶液，再注入0.1 m L生理鹽水，使十二指腸導(dǎo)管內(nèi)的伊文氏藍(lán)均進(jìn)入腸腔。20 min后將大鼠脫頸椎處死，沿腹中線剪開(kāi)腹壁，用手術(shù)線扎緊回盲瓣和幽門(mén)，剪取自幽門(mén)至回盲瓣的腸管，將腸管放置成直線。操作中避免拉伸腸管，防止腸內(nèi)容物流動(dòng)影響觀察結(jié)果。測(cè)量小腸總長(zhǎng)度（從回盲瓣到幽門(mén)的長(zhǎng)度）及染料移行長(zhǎng)度（從幽門(mén)到染料移行的前端），計(jì)算出小腸轉(zhuǎn)運(yùn)率。小腸轉(zhuǎn)運(yùn)率（%）=［染料移行的長(zhǎng)度（cm）/小腸總長(zhǎng)度（cm）］×100%。

1.5 染色標(biāo)本制備大鼠隨機(jī)分為4組（n=6），分別經(jīng)側(cè)腦室微量注射ghrelin（6.4μg/kg），生理鹽水（5μL），生理鹽水（5μL）+ghrelin（6.4μg/kg），（DLys3）GHRP-6（3.7μg/kg）+ghrelin。注射藥物后大鼠禁食，自由飲水，90 min后腹腔注射100 g/L水合氯醛400 mg/kg麻醉。打開(kāi)胸腔暴露心臟，從左心室穿刺至主動(dòng)脈，先灌注生理鹽水，靜脈流出無(wú)色生理鹽水時(shí)，再用40 g/L的多聚甲醛緩沖液沖洗固定。剪開(kāi)顱骨和脊柱，取出腦和脊髓（胸腰段），并剪取大鼠消化道各段（包括胃、十二指腸、空腸、回腸、盲腸、近端結(jié)腸、遠(yuǎn)端結(jié)腸），生理鹽水沖洗后在40 g/L的多聚甲醛緩沖液中固定10 h，20～30 g/L蔗糖溶液脫水。組織沉底后取出，包埋劑包埋，液氮速凍，恒冷箱切片機(jī)切片。

1.6 c-Fos蛋白免疫組織化學(xué)染色腦片和胃腸道組織切片在p H 7.4，0.01 mol/L的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）中浸泡5 min，再用0.3 mol/L的稀鹽酸浸泡30 min，PBS漂洗5 min×3次，46.5 m L/L Triton X-100透膜20 min，PBS漂洗5 min×3次，30 m L/L H2O2室溫孵育10 min，以滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，PBS漂洗10 min×2次。用山羊血清室溫孵育60 min后再用兔抗鼠c-Eos抗體孵育40 h（1∶500，4℃）。PBS漂洗10 min×3次，加入生物素標(biāo)記的二抗孵育16 h（羊抗兔IgG，4℃），PBS漂洗10 min×3次，再加入辣根酶標(biāo)記的鏈霉卵白素室溫孵育30 min，PBS漂洗5 min×3次，二氨基聯(lián)苯胺顯色10 min，PBS漂洗以終止顯色。將腦片裱片后晾干，和胃腸道組織切片一起脫水、透明、中性樹(shù)膠封片。用0.01 mol/L的PBS代替第一抗體做陰性對(duì)照。

1.7 c-Fos陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)選擇與消化道功能密切相關(guān)的核團(tuán)及ghrelin受體分布較多的核團(tuán)進(jìn)行觀察。在每只大鼠腦片的相同平面選擇6張片子對(duì)每個(gè)核團(tuán)的c-Eos陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)，參考大鼠腦立體定位圖譜，高倍鏡下計(jì)數(shù)c-Eos陽(yáng)性細(xì)胞（分別數(shù)兩側(cè)核團(tuán)，計(jì)算平均值）。在每只大鼠的胃腸道不同部位各選取6張組織切片，高倍鏡下將每張切片隨機(jī)數(shù)5個(gè)視野取平均值，觀察c-Eos陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)方差齊性檢驗(yàn)，方差齊同，兩組數(shù)據(jù)間比較采用t檢驗(yàn)，多組數(shù)據(jù)間比較采用單因素方差分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 側(cè)腦室微量注射ghrelin對(duì)大鼠小腸轉(zhuǎn)運(yùn)的作用正常大鼠的小腸轉(zhuǎn)運(yùn)率為（64.01±8.50）%，側(cè)腦室微量注射生理鹽水后大鼠的小腸轉(zhuǎn)運(yùn)率為（54.94± 7.07）%，兩者無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。與生理鹽水組相比，側(cè)腦室注射ghrelin 0.4μg/kg似乎對(duì)小腸轉(zhuǎn)運(yùn)有促進(jìn)作用，小腸轉(zhuǎn)運(yùn)率為（62.22±7.88）%，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。側(cè)腦室注射ghrelin 1.6μg/kg［小腸轉(zhuǎn)運(yùn)率為（70.09±9.18）%，P＜0.01）］和ghrelin 6.4μg/kg［小腸轉(zhuǎn)運(yùn)率為（74.08± 7.75）%，P＜0.01］可促進(jìn)大鼠小腸轉(zhuǎn)運(yùn)。經(jīng)側(cè)腦室注射（D-Lys3）GHRP-6后，大鼠的小腸轉(zhuǎn)運(yùn)率顯著下降［（40.86±6.17）%，P＜0.05］。經(jīng)側(cè)腦室注射（D-Lys3）GHRP-6后，再給予ghrelin 6.4μg/kg，大鼠小腸轉(zhuǎn)運(yùn)率為（56.59±8.78）%，顯著低于單獨(dú)給予ghrelin 6.4μg/kg組（P＜0.01，圖1）。

圖1 側(cè)腦室微量注射ghrelin對(duì)大鼠小腸轉(zhuǎn)運(yùn)的影響Eig.1 Influence of intracerebroventricular injection of ghrelin on small intestinal transit in rats（±s）

2.2 側(cè)腦室微量注射ghrelin對(duì)CNS的c-Fos蛋白表達(dá)的作用我們研究發(fā)現(xiàn)，c-Eos蛋白的免疫陽(yáng)性表達(dá)為細(xì)胞核呈棕褐色或棕黃色，在細(xì)胞漿未見(jiàn)表達(dá)。生理鹽水對(duì)照組大鼠的CNS中c-Eos蛋白的陽(yáng)性表達(dá)很少，經(jīng)側(cè)腦室微量注射ghrelin后，CNS內(nèi)的c-Eos蛋白表達(dá)可有不同程度的增加，表達(dá)顯著增加的部位包括弓狀核（arcuate nucleus，ARC）、室旁核（periventricular nucleus，PVN）、下丘腦腹內(nèi)側(cè)核（ventromedial hypothalamic nucleus，VMH）、孤束核（nucleus of solitary tract，NTS）、杏仁內(nèi)側(cè)核（medial amygdaloid nucleus，Me）、迷走神經(jīng)背核（dorsal motor nucleus of vagus，DMN）、胸腰段脊髓背角（cornu dorsale medullae spinalis，CDMS）和延髓最后區(qū)（area postrema，AP）（P＜0.05，圖2）。在其他腦區(qū)，如杏仁基底外側(cè)核（basolateral nucleus of the amygdala，BL）、杏仁中央核（central amygdaloid nucleus，Ce A）、海馬（hippocamp，HIP）、下丘腦背內(nèi)側(cè)核（dorsomedial hypothalamic nucleus，DMH）、腦橋臂旁核（parabrachial nucleus，PBN）及外側(cè)區(qū)（lateral hypothalamic area，LH），c-Eos蛋白的表達(dá)與生理鹽水對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖2 側(cè)腦室微量注射ghrelin對(duì)CNS的c-Fos蛋白表達(dá)的作用Eig.2 Influence of ghrelin injected intracerebroventricularly on c-Eos expression in the CNS

2.3 側(cè)腦室微量注射ghrelin對(duì)胃腸道c-Fos蛋白表達(dá)的作用c-Eos蛋白在生理鹽水對(duì)照組大鼠的胃腸道很少見(jiàn)，甚至為陰性表達(dá)。經(jīng)側(cè)腦室微量注射ghrelin后，c-Eos蛋白表達(dá)在胃、十二指腸和近端結(jié)腸可有不同程度的增加，以胃的表達(dá)增加最顯著（P＜0.05，圖3）。與生理鹽水對(duì)照組相比，大鼠的空腸、回腸、盲腸、遠(yuǎn)端結(jié)腸的c-Eos蛋白表達(dá)有增加趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.4 受體拮抗劑對(duì)側(cè)腦室注射ghrelin激活CNS的影響側(cè)腦室微量注射（D-Lys3）GHRP-6后再給予ghrelin，觀察中樞核團(tuán)c-Eos蛋白表達(dá)的變化。本實(shí)驗(yàn)選取了經(jīng)側(cè)腦室給予ghrelin后c-Eos蛋白表達(dá)增加的中樞核團(tuán)進(jìn)行觀察，包括下丘腦腹內(nèi)側(cè)核、弓狀核、室旁核、杏仁內(nèi)側(cè)核、迷走神經(jīng)背核、孤束核、胸腰段脊髓背角、延髓最后區(qū)。研究發(fā)現(xiàn)（D-Lys3）GHRP-6對(duì)ghrelin激活的中樞各核團(tuán)c-Eos蛋白的表達(dá)有不同程度的抑制，c-Eos蛋白表達(dá)與對(duì)照組相比顯著減少（P＜0.05，表1）。

圖3 側(cè)腦室微量注射ghrelin對(duì)胃腸道c-Fos蛋白表達(dá)的作用Eig.3 Influence of ghrelin injected intracerebroventricularly on c-Eos expression in the gastrointestinal tract

表1 （D-Lys3）GHRP-6對(duì)側(cè)腦室注射ghrelin激活CNS的c-Fos蛋白的影響Tab.1 Influence of（D-Lys3）GHRP-6 on c-Eos expression with activation of the CNS by ghrelin injected intracerebroventricularly（±s）

表1 （D-Lys3）GHRP-6對(duì)側(cè)腦室注射ghrelin激活CNS的c-Fos蛋白的影響Tab.1 Influence of（D-Lys3）GHRP-6 on c-Eos expression with activation of the CNS by ghrelin injected intracerebroventricularly（±s）

與生理鹽水+ghrelin組比較，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。

hrelin 6 49.36±7.75 82.90±9.75 60.18±6.62 95.74±8.82（D-Lys3）GHRP-6+ghrelin 6 26.32±4.45*36.15±5.26**24.46±4.24**46.38±5.27**組別例數(shù)弓狀核室旁核杏仁內(nèi)側(cè)核延髓最后區(qū)生理鹽水+g hrelin 6 70.54±6.94 42.99±7.11 45.09±3.73 23.36±4.60（D-Lys3）GHRP-6+ghrelin 6 31.32±4.82**21.25±2.62*18.91±1.76***10.37±2.18組別例數(shù)孤束核迷走神經(jīng)背核胸腰段脊髓背角下丘腦腹內(nèi)側(cè)核生理鹽水+g *

2.5 受體拮抗劑對(duì)側(cè)腦室注射ghrelin激活ENS的影響本實(shí)驗(yàn)選擇側(cè)腦室注射ghrelin后c-Eos蛋白表達(dá)增加的部位進(jìn)行觀察，包括大鼠的胃、十二指腸、近端結(jié)腸。經(jīng)側(cè)腦室給予（D-Lys3）GHRP-6后再給予ghrelin，觀察大鼠ENS的c-Eos蛋白的表達(dá)量變化。研究發(fā)現(xiàn)，（D-Lys3）GHRP-6對(duì)ghrelin激活的胃腸神經(jīng)叢c-Eos蛋白的表達(dá)有不同程度的抑制，與對(duì)照組比較，c-Eos蛋白表達(dá)均顯著減少（P＜0.05，表2）。

表2 （D-Lys3）GHRP-6對(duì)側(cè)腦室注射ghrelin激活胃腸道c-Fos蛋白的影響Tab.2 Influence of（D-Lys3）GHRP-6 on c-Eos expression with activation of the gastrointestinal tract by ghrelin injected intracerebroventricularly（±s）

表2 （D-Lys3）GHRP-6對(duì)側(cè)腦室注射ghrelin激活胃腸道c-Fos蛋白的影響Tab.2 Influence of（D-Lys3）GHRP-6 on c-Eos expression with activation of the gastrointestinal tract by ghrelin injected intracerebroventricularly（±s）

與生理鹽水+ghrelin組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

hrelin 6 7.64±0.93 5.99±0.77 6.06±0.75（D-Lys3）GHRP-6+ghrelin 6 3.77±0.50**3.52±0.48*3.95±0.45組別例數(shù)胃十二指腸近端結(jié)腸生理鹽水+g *

3 討 論

我們的實(shí)驗(yàn)證實(shí)側(cè)腦室微量注射ghrelin促進(jìn)大鼠小腸轉(zhuǎn)運(yùn)，（D-Lys3）GHRP-6可顯著阻斷ghrelin的作用。EUKUDA等觀察了ghrelin對(duì)大鼠小腸轉(zhuǎn)運(yùn)的作用［16］，提出ghrelin對(duì)小腸轉(zhuǎn)運(yùn)的促進(jìn)作用可能與對(duì)辣椒素敏感的傳入神經(jīng)系統(tǒng)和內(nèi)在神經(jīng)通路有關(guān)，但沒(méi)有就ghrelin促小腸轉(zhuǎn)運(yùn)的量效關(guān)系和受體拮抗劑（D-Lys3）GHRP-6的作用進(jìn)行進(jìn)一步研究。此外，EUKUDA等通過(guò)用鉻酸鈉灌胃的方法來(lái)觀察大鼠小腸轉(zhuǎn)運(yùn)，這種方法會(huì)受到胃排空的影響，并非單純的小腸轉(zhuǎn)運(yùn)。本研究采用置入十二指腸導(dǎo)管，經(jīng)導(dǎo)管注入伊文氏藍(lán)染料的方法，觀察了ghrelin對(duì)大鼠小腸轉(zhuǎn)運(yùn)的影響，并探討了ghrelin受體拮抗劑（D-Lys3）GHRP-6的作用。由于ghrelin及其受體在中樞和外周都有分布，以往研究認(rèn)為中樞和外周給予ghrelin，可能分別通過(guò)中樞和外周相應(yīng)的受體來(lái)發(fā)揮促動(dòng)力作用［17］。因此，本實(shí)驗(yàn)推測(cè)在生理?xiàng)l件下，側(cè)腦室的內(nèi)源性ghrelin可能通過(guò)側(cè)腦室的相應(yīng)受體發(fā)揮促動(dòng)力作用。

由于ghrelin對(duì)胃腸動(dòng)力的作用機(jī)制仍未闡明，因此非常有必要研究ghrelin對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的激活作用。C-Eos蛋白屬于即刻早期基因，在正常情況下，c-Eos蛋白在絕大多數(shù)細(xì)胞內(nèi)表達(dá)很少或不表達(dá)。當(dāng)出現(xiàn)腦缺血、外傷、化學(xué)毒物及電刺激等外界刺激時(shí)，c-Eos蛋白表達(dá)在數(shù)十分鐘內(nèi)可顯著增加。因此，c-Eos蛋白被稱(chēng)為“第三信使”，其表達(dá)常被作為神經(jīng)元激活的標(biāo)志［18］。NAKAZATO等發(fā)現(xiàn)側(cè)腦室給予ghrelin 0.13～13.2μg/kg可刺激大鼠攝食［19］。EUJINO等［6］發(fā)現(xiàn)側(cè)腦室注入ghrelin 0.4～4μg/kg誘發(fā)大鼠禁食期肌電活動(dòng)。我們的小腸轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)側(cè)腦室微量注射ghrelin 6.4μg/kg顯著促進(jìn)大鼠小腸轉(zhuǎn)運(yùn)。因此，本實(shí)驗(yàn)選定6.4μg/kg作為觀察側(cè)腦室注射ghrelin對(duì)中樞和胃腸道c-Eos蛋白表達(dá)變化的給藥量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，側(cè)腦室注入ghrelin可誘導(dǎo)CNS內(nèi)廣泛部位的c-Eos蛋白表達(dá)，以下丘腦室旁核、弓狀核、下丘腦腹內(nèi)側(cè)核、杏仁內(nèi)側(cè)核、胸腰段脊髓后角、腦干迷走神經(jīng)復(fù)合體（dorsal vagal complex，DVC）（包括延髓最后區(qū)、孤束核、迷走神經(jīng)背核）的c-Eos蛋白表達(dá)增加最為顯著。下丘腦背內(nèi)側(cè)核、外側(cè)區(qū)、海馬和腦橋臂旁核等核團(tuán)的c-Eos蛋白有增加趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。我們?cè)诖嘶A(chǔ)上觀察了受體拮抗劑（D-Lys3）GHRP-6的作用，證實(shí)（DLys3）GHRP-6明顯拮抗ghrelin的作用，減少了c-Eos蛋白表達(dá)。

下丘腦是調(diào)節(jié)內(nèi)臟活動(dòng)和內(nèi)分泌活動(dòng)的較高級(jí)神經(jīng)中樞，除了調(diào)節(jié)攝食、體溫、神經(jīng)內(nèi)分泌、水電解質(zhì)代謝等，也是參與調(diào)控調(diào)節(jié)消化道功能的重要中樞。下丘腦的室旁核位于下丘腦內(nèi)側(cè)近室周帶處，與弓狀核有緊密的突觸聯(lián)系，是中樞調(diào)控?cái)z食和胃腸活動(dòng)的關(guān)鍵部位。已有研究證實(shí)室旁核和弓狀核參與CNS對(duì)胃腸功能的調(diào)節(jié)［20-22］。腦干是維持個(gè)體生命的重要中樞部位，是大腦、小腦與脊髓相互聯(lián)系的重要通路，負(fù)責(zé)維持呼吸、血壓、心率、體溫和消化等功能的中央調(diào)控及控制意識(shí)水平。下丘腦與腦干聯(lián)系緊密，兩者之間存在往返的投射關(guān)系。腦干可接受來(lái)自下丘腦的下行纖維投射，同時(shí)也可發(fā)出纖維投射到達(dá)下丘腦。我們研究發(fā)現(xiàn)，側(cè)腦室微量注射ghrelin增加大鼠腦干DVC和下丘腦核團(tuán)的c-Eos蛋白表達(dá)，提示下丘腦和腦干參與調(diào)節(jié)ghrelin的生物學(xué)作用。

支配胃腸的副交感神經(jīng)節(jié)前纖維發(fā)自脊髓胸腰節(jié)段的神經(jīng)元。中樞給予ghrelin使胸腰段脊髓后角的c-Eos蛋白表達(dá)增加，在脊髓后角淺層增加顯著。提示ghrelin可通過(guò)下丘腦-腦干-脊髓通路，將中樞的調(diào)控信號(hào)傳遞到胃腸平滑肌，從而調(diào)控胃腸功能。

杏仁核是邊緣系統(tǒng)中重要的皮層下核團(tuán)，由多個(gè)解剖和功能不同的核團(tuán)組成，與腦干、下丘腦、丘腦及皮層感覺(jué)區(qū)等存在廣泛的纖維聯(lián)系，涉及機(jī)體許多重要生理功能的調(diào)節(jié)機(jī)制，參與學(xué)習(xí)記憶、情緒反應(yīng)、生殖行為等復(fù)雜行為的整合。新近研究發(fā)現(xiàn)杏仁核對(duì)攝食及胃腸運(yùn)動(dòng)的調(diào)節(jié)有重要作用［23-25］，杏仁核內(nèi)微量注射ghrelin可顯著促進(jìn)大鼠食欲，促進(jìn)攝食［26］。我們的研究發(fā)現(xiàn)中樞注射ghrelin，使杏仁內(nèi)側(cè)核的c-Eos蛋白表達(dá)增加，受體拮抗劑的應(yīng)用可抑制ghrelin的作用。由于杏仁核上有GHSR分布，我們推測(cè)杏仁內(nèi)側(cè)核可能通過(guò)受體后信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)激活下丘腦核團(tuán)和腦干DVC，最后通過(guò)迷走神經(jīng)將神經(jīng)沖動(dòng)傳遞到胃腸平滑肌，從而調(diào)節(jié)胃腸道運(yùn)動(dòng)，其具體機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

然而，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)側(cè)腦室注射ghrelin后，c-Eos蛋白陽(yáng)性細(xì)胞在中樞核團(tuán)的表達(dá)與ghrelin受體GHSR的表達(dá)并不完全一致。例如，下丘腦腹內(nèi)側(cè)核的GHSR分布較少［27］，但c-Eos免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞卻明顯增多，其原因可能是ghrelin作用于富含GHSR的核團(tuán)（如室旁核，弓狀核）后，直接或間接的發(fā)出神經(jīng)投射到達(dá)腹內(nèi)側(cè)核，從而激活c-Eos蛋白。下丘腦外側(cè)區(qū)、杏仁基底內(nèi)側(cè)核、海馬CA3和CA4區(qū)，GHSR分布很豐富［27］，但側(cè)腦室注射ghrelin后，這些核團(tuán)卻缺乏c-Eos蛋白陽(yáng)性表達(dá)。我們推測(cè)ghrelin可能通過(guò)除GHSR之外的受體，或其他因子的參與（至少對(duì)c-Eos蛋白來(lái)說(shuō)），發(fā)揮對(duì)這些中樞核團(tuán)的激活作用。

ENS是由胃腸道壁內(nèi)神經(jīng)成分組成的，具有調(diào)節(jié)控制胃腸道功能的獨(dú)立整合系統(tǒng)。ENS通過(guò)釋放多種神經(jīng)調(diào)質(zhì)和神經(jīng)遞質(zhì)，調(diào)控胃腸道的感受、分泌、血供、運(yùn)動(dòng)及水、電解質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)等，并將胃腸道與自主神經(jīng)系統(tǒng)和CNS聯(lián)系起來(lái)。本研究發(fā)現(xiàn)，側(cè)腦室注射ghrelin后，大鼠胃、十二指腸和近端結(jié)腸腸神經(jīng)叢的c-Eos蛋白表達(dá)較生理鹽水對(duì)照組顯著增加，推測(cè)是由于其接受了脊髓的神經(jīng)傳入所致。C-Eos蛋白在胃的表達(dá)最多，這可能是由于GHSR在胃中的含量最多所致［3］。與對(duì)照組相比，大鼠空腸、回腸、盲腸、遠(yuǎn)端結(jié)腸的c-Eos蛋白表達(dá)有增加趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能是由于這些部位的GHSR含量相對(duì)較少。

本研究初步證明了側(cè)腦室微量注射ghrelin促進(jìn)大鼠小腸轉(zhuǎn)運(yùn)，其受體拮抗劑（D-Lys3）GHRP-6可抑制ghrelin的促動(dòng)力作用。側(cè)腦室微量注射ghrelin對(duì)小腸運(yùn)動(dòng)的調(diào)節(jié)作用可能通過(guò)CNS和ENS來(lái)實(shí)現(xiàn)。這些結(jié)論可為闡明ghrelin的促胃腸動(dòng)力作用提供理論基礎(chǔ)，為胃腸動(dòng)力障礙性疾病的治療提供一定的線索。

［1］KOJIMA M，HOSODA H，DATE Y，et al.Ghrelin is a growthhormone-releasing acylated peptide from stomach［J］.Nature，1999，402（6762）：656-660.

［2］BRON R，YIN L，RUSSO D，et al.Expression of the ghrelin receptor gene in neurons of the medulla oblongata of the rat［J］.J Comp Neurol，2013，521（12）：2680-2702.

［3］DASS NB，MUNONYARA M，BASSIL AK，et al.Growth hormone secretagogue receptors in rat and human gastrointestinal tract and the effects of ghrelin［J］.Neuroscience，2003，120（2）：443-453.

［4］XU L，DEPOORTERE I，TOMASETTO C，et al.Evidence for the presence of motilin，ghrelin，and the motilin and ghrelin receptor in neurons of the myenteric plexus［J］.Regul Pept，2005，124（1-3）：119-125.

［5］RUCHALA M，RAFINSKA L，KOSOWICZ J，et al.The analysis of exogenous ghrelin plasma activity and tissue distribution［J］. Neuro Endocrinol Lett，2012，33（2）：191-195.

［6］FUJINO K，INUI A，ASAKAWA A，et al.Ghrelin induces fasted motor activity of the gastrointestinal tract in conscious fed rats［J］.J Physiol，2003，550（Pt 1）：227-240.

［7］CHEUNG CK，WU JC.Role of ghrelin in the pathophysiology of gastrointestinal disease［J］.Gut Liver，2013，7（5）：505-512.

［8］FUJIMIYA M，ATAKA K，ASAKAWA A，et al.Ghrelin，desacyl ghrelin and obestatin on the gastrointestinal motility［J］.Peptides，2011，32（11）：2348-2351.

［9］MONDAL A，XIE Z，MIYANO Y，et al.Coordination of motilin and ghrelin regulates the migrating motor complex of gastrointestinal motility in Suncus murinus［J］.Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol，2012，302（10）：G1207-G1215.

［10］信芳杰，徐珞.Ghrelin對(duì)豚鼠胃竇平滑肌細(xì)胞鈣離子濃度的影響及與NO關(guān)系研究［J］.現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2010，10（2）：216-220.

［11］王燕，董蕾，趙平，等.Ghrelin對(duì)大鼠小腸轉(zhuǎn)運(yùn)及消化間期移行性復(fù)合肌電活動(dòng)的作用及機(jī)制［J］.南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，28（3）：328-332.

［12］RUTER J，KOBELT P，TEBBE JJ，et al.Intraperitoneal injection of ghrelin induces Fos expression in the paraventricular nucleus of the hypothalamus in rats［J］.Brain Res，2003，991（1-2）：26-33.

［13］OLSZEWSKI PK，GRACE MK，BILLINGTON CJ，et al.Hypothalamic paraventricular injections of ghrelin：effect on feeding and c-Fos immunoreactivity［J］.Peptides，2003，24（6）：919-923.

［14］SAKURAZAWA N，MANO-OTAGIRI A，NEMOTO T，et al. Effects of intracerebroventricular ghrelin on food intake and Fos expression in the arcuate nucleus of the hypothalamus in female rats vary with estrous cycle phase［J］.Neurosci Lett，2013，541：204-208.

［15］CONE JJ，MCCUTCHEON JE，ROITMAN MF.Ghrelin acts as an interface between physiological state and phasic dopamine signaling［J］.J Neurosci，2014，34（14）：4905-4913.

［16］FUKUDA H，MIZUTA Y，ISOMOTO H，et al.Ghrelin enhances gastric motility through direct stimulation of intrinsic neural pathways and capsaicin-sensitive afferent neurones in rats［J］.Scand J Gastroenterol，2004，39（12）：1209-1214.

［17］HASHIMOTO H，UETA Y.Central effects of ghrelin，a unique peptide，on appetite and fluid/water drinking behavior［J］.Curr Protein Pept Sci，2011，12（4）：280-287.

［18］宋美英，黃民，王曼麗，等.短期睡眠剝奪對(duì)大鼠外側(cè)韁核內(nèi)氨基酸類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)水平及c-Fos表達(dá)的影響［J］.吉林大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2011，37（5）：788-791.

［19］NAKAZATO M，MURAKAMI N，DATE Y，et al.A role for ghrelin in the central regulation of feeding［J］.Nature，2001，409（6817）：194-198.

［20］LOPEZ M，LELLIOTT CJ，VIDAL-PUIG A.Hypothalamic fatty acid metabolism：A housekeeping pathway that regulates food intake［J］.Bioessays，2007，29（3）：248-261.

［21］FUJIMIYA M，ATAKA K，ASAKAWA A，et al.Regulation of gastroduodenal motility：acyl ghrelin，des-acyl ghrelin and obestatin and hypothalamic peptides［J］.Digestion，2012，85（2）：90-94.

［22］XU L，GAO S，GUO F，et al.Effect of motilin on gastric distension sensitive neurons in arcuate nucleus and gastric motility in rat［J］.Neurogastroenterol Motil，2011，23（3）：265-270.

［23］ZHANG R，ZOU N，LI J，et al.Elevated expression of c-fos in central nervous system correlates with visceral hypersensitivity in irritable bowel syndrome（IBS）：a new target for IBS treatment［J］.Int J Colorectal Dis，2011，26（8）：1035-1044.

［24］MASON BL，WANG Q，ZIGMAN JM.The central nervous system sites mediating the orexigenic actions of ghrelin［J］.Annu Rev Physiol，2014，76：519-533.

［25］VENKOVA K，JOHNSON A C，MYERS B，et al.Exposure of the amygdala to elevated levels of corticosterone alters colonic motility in response to acute psychological stress［J］.Neuropharmacology，2010，58（7）：1161-1167.

［26］ALVAREZ-CRESPO M，SKIBICKA KP，F(xiàn)ARKAS I，et al. The amygdala as a neurobiological target for ghrelin in rats：neuroanatomical，electrophysiological and behavioral evidence［J］.PLoS One，2012，7（10）：e46321.

［27］王燕，史海濤，姜炅，等.Ghrelin及其受體在大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)的分布特征及比較［J］.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2014，31（8）：593-598.

（編輯 韓維棟）

Effect of intracerebroventricular injection of ghrelin on small intestinal transit in rats

WANG Yan，SHI Hai-tao，QIN Bin，LI Hong，JIANG Jiong，SONG Ya-hua
（Department of Gastroenterology，the Second Hospital，Xi'an Jiaotong University Health Science Center；Shaanxi Key Laboratory of Gastrointestinal Motility Disorders，Shaanxi Clinical Research Center of Gastrointestinal Disease，Xi'an 710004，China）

Objective To investigate the effects of ghrelin injected intracerebroventricularly on small intestinal mobility and on c-Fos expression in the enteric nervous system（ENS）and the central nervous system（CNS）.Methods ①Rats

intraduodenal catheter and intracerebroventricular annular tube implantation. After fasting for 24 h，the rats received intracerebroventricular injection of ghrelin or normal saline（0.4，1.6，and 6.4μg/kg，respectively）.Small intestinal transit was measured after injection of Evans blue through the intraduodenal catheter.The other two group of rats received ghrelin receptor antagonist（D-Lys3）GHRP-6（3.7μg/kg）or（D-Lys3）GHRP-6（3.7μg/kg）+ghrelin（6.4μg/kg）.②The c-Fos activation on the ENS and CNS through intracerebroventricular injection of ghrelin was studied by immunohistochemistry.Results ①Ghrelin of 0.4μg/kg injected intracerebroventricularly did not affect small intestinal transit obviously.However，ghrelin of 1.6 and 6.4μg/kg enhanced small intestinal transit and this effect was suppressed by its receptor antagonist（D-Lys3）GHRP-6.②Intracerebroventricular injection of ghrelin could activate the expression of c-Fos in several CNS nuclei such asparaventricular nucleus，arcuate nucleus and ventromedial hypothalamic nucleus.Ghrelin also increased the expression of c-Fos in the stomach，duodenum and adjacent colon，especially the stomach.The receptor antagonist inhibited the effect of ghrelin.Conclusion Intracerebroventricular injection of ghrelin appears to have excitatory effects on small intestinal transit by regulating the intestinal motility through the CNS and ENS.Ghrelin receptor is involved in these activities.

ghrelin；small intestinal transit；central nervous system；enteric nervous system；c-Fos

R333.3

A

10.7652/jdyxb201505003

2015-02-07

2015-04-07

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No.81100258；81200310）；陜西省社會(huì)發(fā)展攻關(guān)計(jì)劃資助項(xiàng)目（No.2015SF102）Supported by the National Natural Science Foundation of China（No.81100258；81200310）and the Social Development Research Project of Shaanxi Province（No.2015SF102）

史海濤.E-mail：shihaitao7@163.com

優(yōu)先出版：http：//www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20150720.1626.008.html（2015-07-20）